Techniques d'Analyse en Biochimie

Techniques d'Analyse - Notes d'étude

• Objectifs de la précipitation: Concentrer et purifier les molécules biologiques en solution, en les séparant selon leurs propriétés de solubilité.

• Principes de base de la précipitation des protéines:

  • Modification du pH
  • Modification de la température
  • Modification de la force ionique
  • Ajout de solvants organiques

• Effet du changement des conditions environnementales sur la solubilité des protéines:

  • Les protéines peuvent perdre leurs propriétés biologiques et physiques.
  • La solubilité dépend des conditions ioniques et du pH.

• Phénomènes affectant la solubilité des protéines:

  • Hydratation
  • Charge électrostatique
  • Conformation

• Hydratation des protéines:

  • L'intérieur des protéines est isolé du milieu aqueux par des acides aminés hydrophobes.
  • L'extérieur des protéines interagit avec le milieu aqueux par des chaînes polaires et des acides aminés chargés.
  • Plus les interactions avec le solvant sont nombreuses, plus la molécule est soluble.
  • Un cortège de molécules d'eau s'associe à la macromolécule, on parle d'hydratation.

• Charge électrostatique des protéines:

  • Des protéines chargées de même façon se repoussent, ce qui empêche leur agrégation.
  • Des protéines non chargées peuvent s'agréger.
  • Le pH de la solution et les électrolytes (sels solubles) peuvent modifier la solubilité des protéines.

• Conformation des protéines:

  • Les groupes latéraux des acides aminés permettent aux protéines d'être solubles.
  • Les chaînes latérales chargées (His, Lys, Arg, Asp) ou polaires non chargées (Ser) sont généralement orientées vers l'extérieur de la molécule.
  • Les acides hydrophobes (Met, Ala) se regroupent à l'intérieur de la molécule.

• Influence du pH sur la solubilité des protéines:

  • Les protéines contiennent des groupes ionisables avec des pKa différents.
  • À un pH isoélectrique (pI), la charge nette de la protéine est nulle.
  • En milieu acide, les protéines sont chargées positivement.
  • En milieu basique, les protéines sont chargées négativement.
  • En milieu neutre, le pH du tampon correspond au pI de la protéine, ce qui la rend globalement neutre.

• Influence des solvants organiques sur la solubilité des protéines:

  • Les solvants organiques comme le méthanol, l'éthanol, le butanol et l'acétone sont utilisés pour précipiter les protéines.
  • Ces solvants ont des groupes hydrophobes et polaires.
  • Ils entrent en compétition avec l'eau, diminuant la concentration de l'eau et l'hydratation des protéines. -La masse moléculaire et la longueur de la chaine aliphatique des solvants influence la quantité de solvant nécessaire à la précipitation.

• Influence de la concentration des sels sur la solubilité des protéines:

  • Un grand nombre de sels neutres ou légèrement acides (sulfate d'ammonium, chlorure de sodium) sont utilisés pour solubiliser ou précipiter les protéines.
  • La solubilité augmente généralement avec la concentration des sels.
  • A des faibles concentrations (0,1M-0,3M), les sels favorisent la solubilité des protéines (salting in).
  • A des fortes concentrations, les sels favorisent la précipitation des protéines (salting out).

• Dialyse: Une technique pour éliminer les petites molécules (sels).

• Électrophorèse: Une technique permettant de séparer les molécules en fonction de leurs charges et de leurs tailles.

  • SDS-PAGE: Séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire.
  • Électrophorèse sur gel d'agarose: Séparation des acides nucléiques et de certains grands complexes selon les tailles.
  • Focalisation isoélectrique: Séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI).
  • Électrophorèse capillaire: Méthode rapide et hautement sensible pour la séparation des protéines.

• Western blot: Une technique pour détecter une protéine spécifique dans un mélange de protéines.

  • La protéine d'intérêt est identifiée par un anticorps spécifique.

• Chromatographie: Une technique employée pour séparer les molécules selon leurs différentes propriétés physico-chimiques.

  • Chromatographie en phase gazeuse (CPG): séparation des molécules gazeuses ou susceptibles d'être vaporisées.
  • Chromatographie en phase liquide (CPL): séparation des molécules liquides.
  • Chromatographie liquide à haute performance (HPLC): une technique plus performante pour la séparation et l'identification des molécules.