Introduction à l’histologie principes de l’histologie moléculaire PDF

FFFFJFJ 1 INTRODUCTION A L’HISTOLOGIE ET PRINCIPES DE L’HISTOLOGIE MOLECULAIRE DÉFINITIONS DE L'HISTOLOGIE Dans le langage médical courant, "histol...

FFFFJFJ 1 INTRODUCTION A L’HISTOLOGIE ET PRINCIPES DE L’HISTOLOGIE MOLECULAIRE DÉFINITIONS DE L'HISTOLOGIE Dans le langage médical courant, "histologie" est fréquemment pris comme synonyme de "microscopie" ; on dit souvent "examen histologique" pour "examen microscopique". Il s'agit là d'un raccourci trompeur et réducteur. En effet, rapidement, l'histologie s'est dégagée d'une anatomie microscopique purement descriptive, strictement morphologique, pour développer l'histophysiologie. Au début des années 1960, l'introduction de la microscopie électronique fut une véritable révolution qui donna lieu, grâce à la description des ultrastructures, à une réécriture complète de la cytologie et de l'histologie. Aujourd'hui, la spécificité de l'histologie par rapport aux autres sciences biologiques réside dans l'identification et la localisation in situ des molécules. L'utilisation conjointe des moyens actuels d'observation microscopique (photonique, à fluorescence, électronique, confocal, etc.) et des techniques modernes de détection in situ des molécules (histochimie, histoenzymologie, immunocytochimie, hybridation moléculaire in situ, PCR in situ) permet une véritable cytologie, histologie, embryologie ou cytogénétique moléculaires, indispensables à l'appréhension des mécanismes biologiques normaux et pathologiques. L'histologie est donc la science qui étudie l'organisation des tissus mais aussi détecte et localise in situ les constituants moléculaires de l'organisme. L'objectif actuel de l'histologie est de visualiser dans les tissus, dans les cellules, dans leurs organites ou dans la matrice extra-cellulaire, les molécules (en particulier les gènes, leurs ARN-messagers et les protéines pour lesquelles ils codent), en déterminant précisément dans quel emplacement, dans quelle configuration, se trouvent les différentes molécules qui constituent ces structures. Cette notion d'in situ est fondamentale. C'est par elle que l'histologie se distingue de la biochimie (qui traite des broyats d'organes ou de tissus et qui a à faire avec les molécules, leur structure, leurs propriétés, leur forme dans l'espace, sans tenir compte de leur localisation précise dans les structures). Discipline visant à détecter, identifier et localiser les différentes molécules constitutives de l'organisme vivant, l'histologie d'aujourd'hui est devenue une histologie et une cytologie moléculaires. LE CONCEPT DE TISSU 1. Les différents niveaux d'organisation structurale On reconnaît, dans l'organisme, différents niveaux d'organisation structurale qui correspondent, en allant du plus complexe vers le plus élémentaire, aux systèmes et appareils, aux organes, aux tissus, aux cellules, aux organites, aux macromolécules et aux petites molécules. Ces différents niveaux d'organisation structurale de l'organisme sont couverts par FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 2 des disciplines distinctes dont les champs se recouvrent en partie. L'anatomie décrit des systèmes (nerveux, cardiovasculaire) et appareils (digestif, respiratoire, urinaire, etc) et des organes (le cœur, la rate, le foie, l'estomac, etc) macroscopiquement individualisés. Les tissus - premier niveau d'organisation supra-cellulaire - sont des ensembles coopératifs de cellules différenciées qui forment une association à la fois territoriale, fonctionnelle et biologique (ensembles coopératifs de cellules). La cellule est l'unité élémentaire de vie. Tissus et cellules se situent au niveau du microscope optique et pour l'étude des organites cellulaires la microscopie électronique est indispensable. Les molécules entrent dans le champ de la biochimie, de la biologie moléculaire, de la cytologie et de l'histologie moléculaires. 2. Les différents types tissulaires On peut reconnaître 4 grandes familles de tissus : les épithéliums, les tissus conjonctifs, les tissus musculaires, le tissu nerveux. A ces 4 grandes familles tissulaires, il faut adjoindre les populations cellulaires libres (ou systèmes cellulaires dispersés ou cellules migratrices) qui se distribuent dans tout l'organisme, les unes dans le sang et/ou la lymphe, les autres dans les différents organes du système immunitaire ainsi que dans le tissu conjonctif et beaucoup d'épithéliums. Les cellules de la lignée germinale occupent une place à part. La plupart des organes sont faits de plusieurs variétés de tissus : la paroi de l'estomac, par exemple, comporte un épithélium de revêtement, des épithéliums glandulaires, du tissu conjonctif, du tissu musculaire lisse, du tissu nerveux périphérique et de nombreuses variétés de cellules libres. LES MÉTHODES DE L'HISTOLOGIE MORPHOLOGIQUE Le dénominateur commun à toute activité histologique réside dans l'action de voir (observer) et d'interpréter ce qui est vu. Dans toute démarche d'ordre histologique, 3 étapes se succèdent : 1) rendre visible les structures ou phénomènes que l'on désire étudier (préparation des échantillons), 2) observer ces structures ou phénomènes sous forme d'images (observation microscopique), 3) donner un sens à ces images (interprétation). 1. Préparation des échantillons Pour rendre visible ce que l'on veut observer (visualisation des structures ou des phénomènes), il est nécessaire de mettre en œuvre des techniques diverses que l'on applique au matériel (échantillon ou spécimen de cellules, tissus, organe ou fragment d'organe considéré) : Les techniques "standard" sont les techniques de base, systématiquement utilisées. Qu'elles soient destinées à l'observation en microscopie optique (MO) ou en microscopie électronique (ME), les coupes sont le fruit de procédures techniques dont les principes restent analogues (successivement : fixation, inclusion, coupe et coloration). FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 3 A) Microscopie optique 1) Etude microscopique standard des tissus (histologie) La technique histologique dite "standard" consiste en la préparation d'un fragment d'organe pour examen en microscopie optique. Elle requiert plusieurs temps successifs : fixation, inclusion, coupe, coloration, montage. - La fixation a pour but la conservation des structures et le durcissement des pièces. Elle doit se faire immédiatement après le prélèvement, par immersion de la pièce dans un grand volume de liquide fixateur (au moins dix fois le volume du prélèvement). Les liquides fixateurs les plus utilisés en pratique courante sont à base de formol. La durée de la fixation varie selon le volume des prélèvements (de quelques heures pour un petit fragment biopsique à plusieurs semaines pour un cerveau humain entier). - L'inclusion a pour but de permettre la manipulation du tissus et la réalisation de coupes fines et régulières. Le milieu d'inclusion le plus utilisé est la paraffine. Comme la paraffine est hydrophobe, le prélèvement doit d'abord subir une déshydratation (par immersion dans des bains d'alcool de degré croissant puis dans des bains de xylène) avant d'être coulé dans de la paraffine fondue (chauffée à 56°C), donc devenue liquide, qui infiltre alors toute la pièce. Après refroidissement, on se trouve en présence d'un bloc de paraffine, dur, à l'intérieur duquel la pièce prélevée est incluse. Dans certains cas particuliers, on peut être amené à utiliser d'autres milieux d'inclusion. - Les coupes du bloc de paraffine sont faites grâce à un microtome qui permet de réaliser des tranches de section (coupes) de 2 à 5 µm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies et collées sur des lames de verre. - Les colorations sont réalisées sur ces lames. Comme les colorants sont en solution aqueuse, les coupes doivent en premier lieu subir une réhydratation. Celle-ci est effectuée après déparaffinage des coupes (par la chaleur et des bains de xylène) en immergeant les lames dans des bains d'alcool de degré décroissant puis dans l'eau distillée. Le but des colorations usuelles est d'accentuer les contrastes afin de mieux distinguer et reconnaître les différents éléments de la préparation. Les colorations les plus fréquemment utilisées associent deux ou trois colorants différents: l'Hématéine-Eosine (H.E.) associe l'hématéine, qui colore en violet les structures acides (comme les noyaux riches en acides nucléiques), et l'éosine qui colore en rose les structures basiques (comme la plupart des cytoplasmes) ; les colorations trichromiques usuelles sont l'Hématéine-Eosine- Safran (H.E.S.) par ajout de safran colorant en jaune les fibres de collagène, et le trichrome de Masson qui associe un colorant nucléaire (hématoxyline), un colorant cytoplasmique et un bleu ou un vert colorant les fibres de collagène. L'orcéine colore en noir les fibres élastiques. - Le montage. Après avoir subi une déshydratation (par bains d'alcool de degré croissant puis bains de xylène), les coupes colorées sont montées entre lame et lamelle avec une résine synthétique dont l'indice de réfraction est voisin de celui du verre. Ainsi dispose-t-on d'une "préparation microscopique" (simplement appelée "lame" dans le langage courant) prête à être observée au microscope optique. 2) Etude microscopique des tissus congelés La congélation des tissus est utilisée d’une part pour la réalisation de techniques d’histologie moléculaire et d’autre part pour l’analyse du tissu musculaire squelettique FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 4 dont la morphologie est modifiée par la technique en paraffine. Le prélèvement tissulaire doit être congelé rapidement à très basse température (-80°C), avec un cryoprotecteur, le plus souvent l’isopentane. Le tissu est soit monté sur gomme adragante soit inclus en cassette dans un milieu d’enrobage, puis immergé dans l’isopentane (cryoprotecteur) refroidi dans l’azote liquide à -80°C. L’isopentane est un solvant amphiphile qui se substitue à l’eau du tissu et en évite la cristallisation qui altèrerait la morphologie du tissu. Une fois congelé, le prélèvement ne doit pas subir de décongélation et être maintenu à une température inférieure à -18°C (conservation à -80°C, coupes au cryostat à -20°, transport en carboglace). - Les coupes du bloc congelé sont faites grâce à un cryostat qui permet de réaliser des tranches de section (coupes) de 5 à 50 µm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies et collées sur des lames de verre, et séchées à l’air à température ambiante qui constitue l’étape de fixation. - Les colorations sont réalisées sur ces lames. Toutes les colorations utilisées pour les coupes en paraffine sont applicables aux coupes en congélation. L’intérêt des coupes en congélation est dans l’application des techniques d’histologie moléculaire. 3) Etude microscopique des cellules (cytologie) La technique cytologique dite "standard" fait appel à un étalement (et non pas à une coupe) des cellules. Ce matériel est d'une particulière fragilité. La technique requiert plusieurs temps successifs : étalement immédiat des cellules sur lame, fixation, coloration, montage. - L'étalement sur lame consiste en la réalisation soit de frottis (avec ou sans centrifugation préalable), soit d'appositions (en appliquant le tissu directement sur la lame), soit de "pastilles" de cytocentrifugation (à l'aide d'une cytocentrifugeuse qui permet la projection des cellules sur la lame). - La fixation des cellules se fait soit par simple séchage à l'air, soit à l'aide de fixateurs à base d'alcool éthylique ou méthylique. - Les colorations standard sont basées sur les propriétés de basophilie et d'éosinophilie des constituants cellulaires. Les deux colorations les plus utilisées sont le Papanicolaou et le May Grunwald Giemsa (MGG). Le MGG colore les éléments basophiles en violet et les éléments acidophiles en rose orangé. Cette coloration permet aussi de mettre en évidence le caractère métachromatique de certaines structures (structures capables de modifier la couleur naturelle du colorant utilisé). - Le montage des lames est identique à celui utilisé pour les préparations histologiques. B) Microscopie électronique à transmission (MET) La technique dite "standard" de microscopie électronique est analogue dans ses principes à celle de microscopie optique. Elle requiert plusieurs temps successifs: fixation, inclusion, coupe, coloration (ou plus exactement contraste). - La fixation se fait habituellement dans du glutaraldéhyde tamponné et est suivie d'une post-fixation par le tétroxyde d'Osmium (OsO4). - L'inclusion se fait dans une résine synthétique (type Epon ou Araldite) durcie par polymérisation, après que les fragments aient été déshydratés dans les FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 5 alcools et dans l'oxyde de propylène. - Les coupes ultrafines des blocs se font à l'aide d'un ultramicrotome qui permet de réaliser des coupes ultrafines d'environ 80 nm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies sur des grilles de cuivre. - Le contraste des coupes s'effectue habituellement avec de l'acétate d'uranyle (contrastant les nucléoprotéines : noyau, nucléole, ribosomes) et des sels de plomb comme le citrate de plomb (contrastant les membranes). 2. L'observation microscopique. La production des images est liée à la mise en œuvre de moyens optiques: loupes, microscope optique ou photonique standard, microscope à fluorescence (UV), microscopes électroniques (à transmission ou à balayage). Dans le domaine de la recherche, le microscope confocal est particulièrement intéressant. Son principe repose sur une analyse par laser de nombreux niveaux superposés d'une préparation, assistée par ordinateur intégré, et produisant des images digitalisées. La microscopie confocale permet notamment de détecter des fluorochromes de couleurs différentes dans une même préparation et d'effectuer des reconstructions en trois dimensions des structures analysées. La conservation des images peut être réalisée par la photographie (procédé habituel pour la microscopie électronique), le cinéma, la vidéo ou la digitalisation. La numérisation des images permet leur stockage, leur archivage et leur transmission à distance par ordinateur. 3. L'interprétation des images L'observation microscopique requiert une bonne connaissance de l'échelle des grandeurs. Les ordres de grandeur observables en microscopie optique vont du mm au µm (diamètre d'un globule rouge : environ 7,5µm). Les grandeurs observables en microscopie électronique peuvent aller jusqu'à 0,1nm (épaisseur d'une membrane plasmique: environ 7 nm). A) Donner du sens aux images. L'interprétation permet de donner une signification aux images observées, de détecter la présence d'une structure, d'une molécule, d'une fonction chimique et de les localiser au niveau de la cellule, du tissu, ou de l'organe Les mécanismes cérébraux de l'observateur mis en jeu dans l'interprétation des images sont ceux des processus de reconnaissance de formes, de contrastes, de couleurs, combinés de façon peu dissociable dans des processus de reconnaissance plus globale impliquant une familiarisation avec les structures étudiées. Parmi les difficultés d'interprétation, les plus élémentaires tiennent aux incidences de coupe et aux artéfacts. B) Reconnaître les incidences de coupe. Les images observées sont situées dans un seul plan. Le plus souvent les structures sont coupées selon une incidence due au hasard, ces incidences de coupe pouvant donner des images en deux dimensions très variées pour une même structure. A FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 6 partir de ces images à deux dimensions il faut reconstituer mentalement une structure à trois dimensions. C) Se méfier des artéfacts. Les artéfacts sont des images artificielles créées par la technique. Si l'on prend comme exemple une préparation histologique de routine (fixée au formol, incluse en paraffine, colorée à l'hématéine-éosine) on reconnaît des artéfacts de prélèvement (pinces, ciseaux, coagulation, gelures, etc.), de décongélation (rupture de la chaine du froid après congélation), de fixation (dessèchement, retard de fixation, fixateur trop ou trop peu concentré, pigment formolique, etc.), d'inclusion (vides artificiels dus à la rétraction des cellules ou des tissus), de coupe (stries de rasoir, coupes trop épaisses ou trop minces, etc.), de collage (décollements, plis et replis de la coupe), de montage (bulles d'air entre la lame et la lamelle), de coloration (empâtements, dépôts, taches de colorant, etc.). Les déformations des images dues à des imperfections des moyens optiques d'observation. Enfin, il faut tenir compte du risque fréquent de mauvaise préservation des tissus. LES METHODES DE L'HISTOLOGIE MOLECULAIRE Diverses méthodes permettent de mettre en évidence des constituants chimiques au sein des tissus et des cellules. On distingue les techniques histochimiques permettant la mise en évidence de types moléculaires particuliers, les techniques histoenzymologiques permettant la mise en évidence d’activités enzymatiques spécifiques, les techniques immunohistochimiques permettant la mise en évidence de protéines par l’utilisation d’anticorps spécifiques, et les techniques d'hybridation in situ qui mettent en évidence les acides nucléiques. I- REACTIONS HISTOCHIMIQUES CLASSIQUES Les réactions histochimiques classiques mettent en évidence des molécules par réaction chimique simple et sont désignées comme "colorations spéciales": le PAS (acide périodique-Schiff) colore les résidus glucidiques ; l'Oil red O colore les lipides neutres (coloration à l’huile rouge sur prélèvement frais ou congelé); le Perls détecte le Fe3+ (coloration au bleu de Prusse). II- R EACTIONS HISTO- ENZYMOLOGIQUES L'histoenzymologie permet la détection d'une activité enzymatique endogène par une réaction chromogène secondaire à la transformation d'un substrat par l’enzyme présente dans la cellule ; exemples : réaction phosphatase acide qui détecte l'activité lysosomale (par exemple celle des macrophages), réactions oxydatives ou ATPasiques utilisées pour typer les cellules musculaires striées squelettiques. III- LES TECHNIQUES IMMUNO-HISTOCHIMIQUES Les techniques immunohistochimiques (IHC) sont les plus utilisées. Elles ont pour but commun la visualisation sur coupes histologiques de sites antigéniques ayant réagi avec des anticorps mis au contact de la coupe. Ces techniques peuvent également s'appliquer aux cellules (immunocytochimie - ICC) et à la microscopie électronique (immunoélectronique). Il existe de très nombreuses variantes FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 7 techniques reposant sur des principes de mise en évidence différents et de multiples procédés d'amplification des marquages. 1) Les techniques d'immuno-fluorescence Les techniques d'immunofluorescence (IF) sont les plus anciennement utilisées. Elles consistent à coupler un produit fluorescent (fluorochrome) à l'anticorps choisi. Ceci permet de localiser le site de la réaction antigène-anticorps par l'observation des coupes en microscopie optique à fluorescence (rayons ultraviolets). Ce type de technique nécessite habituellement pour l'obtention d'images convenables l'utilisation de tissu frais congelé coupé à l'aide d'un microtome particulier appelé cryostat. La fluorescence est éphémère et les résultats ne peuvent être conservés que par des microphotographies. Ces difficultés et limites expliquent le développement d'autres techniques immunohistochimiques mieux adaptées au diagnostic histo-pathologique de routine. 2) Les techniques immuno-enzymatiques Les méthodes immuno-enzymatiques ont le grand avantage sur celles d'immuno-fluorescence de pouvoir être utilisées sur du matériel fixé dans le formol et inclus en paraffine, et sont donc largement utilisées. Les anticorps, au lieu d'être couplés à des produits fluorescents, sont conjugués à une enzyme qui peut être visualisée dans les tissus par l'utilisation d'un substrat chromogène. Les deux enzymes les plus utilisées sont 1) la peroxydase du raifort (horseradish peroxydase ou HRP) dont la révélation se fait classiquement avec le substrat chromogène diaminobenzidine (DAB) qui donne lieu à un produit de réaction brun directement observable en microscopie optique ; 2) la phosphatase alcaline dont la révélation se fait habituellement avec le substrat chromogène fast red qui donne lieu à un produit de réaction rouge. Pour ces réactions, les activités enzymatiques naturelles ou endogènes doivent être bloquées. Les peroxydases endogènes sont bloquées par un prétraitement du tissu par l'eau oxygénée (H2O2), et la phosphatase alcaline par le lévamisole. Les méthodes immunoenzymatiques directes (un antigène reconnu par un anticorps directement couplé à l'enzyme) ont une sensibilité souvent insuffisante. Elles ont été améliorées par plusieurs méthodes d'amplification du signal. Les méthodes d'amplification incluent les méthodes immunoenzymatiques indirectes et les méthodes sandwich. Les méthodes immunoenzymatiques indirectes font intervenir : 1) un premier anticorps, non couplé, reconnaissant l'antigène tissulaire (IgG de souris reconnaissant spécifiquement un antigène humain particulier, par exemple); 2) un deuxième anticorps, couplé à l'enzyme, dirigé contre le fragment Fc du premier anticorps (on utilise comme deuxième anticorps des anticorps anti-espèce: anticorps de lapin anti-IgG de souris, par exemple); 3) une réaction enzymatique utilisant un substrat chromogène. Les méthodes sandwich font intervenir: 1) un premier anticorps, non couplé, reconnaissant l'antigène tissulaire (IgG de souris reconnaissant un antigène humain, par exemple); 2) un deuxième anticorps, non couplé, dirigé contre les fragments Fc du premier et du troisième anticorps (anticorps de lapin anti-IgG de souris, par exemple); 3) un troisième anticorps de la même espèce que le premier, complexé à l'enzyme par son fragment Fab; 4) une réaction enzymatique utilisant un substrat FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 8 chromogène. Ces méthodes sandwich sont désignées selon la nature du complexe impliquant le troisième anticorps: technique de la peroxydase-antiperoxydase (PAP) et technique dite APAAP (pour Alcaline Phospatase Anti Alcaline Phosphatase). 3) Les techniques d’immunoélectronique Les techniques immuno-électroniques permettent la localisation de l'antigène à l'échelle sub-cellulaire. Elles utilisent - soit des anticorps couplés à la peroxydase (HRP) comme pour la méthode immunopéroxydase utilisée en microscopie optique, le produit de réaction brun en présence de DAB étant dense aux électrons - soit des anticorps couplés à des microsphères d'or colloïdal (immunogold). La réaction est identifiée par la présence des images de grains denses aux électrons correspondant aux microsphères. Des anticorps différents, couplés à des microsphères de diamètres différents (de 0,8, 5, 10, 20 nm) peuvent être utilisés, permettant l'identification de plusieurs antigènes sur la même coupe ultrafine. La réaction immunologique peut être réalisée avant inclusion (« pre-embedding »), ou après inclusion (« post-embedding ») ce qui implique une procédure spécifique différente de la technique classique de microscopie électronique. 4) La technique utilisant l'avidine et la biotine L'utilisation du système avidine-biotine implique la présence de : 1) la biotine, petite vitamine hydrosoluble qui peut être facilement couplée, par exemple à un anticorps et à une enzyme comme l'HRP ; 2) l'avidine ou streptavidine, protéine bactérienne ayant la propriété de se lier à la biotine par une liaison de haute affinité et de grande spécificité. Parmi les multiples combinaisons possibles, la plus répandue comporte : 1) un anticorps biotinylé, reconnaissant l'antigène tissulaire ; 2) l'avidine; 3) de l'HRP biotinylée. 5) Sensibilisation des techniques immunohistochimiques En définitive, les techniques d'immunohistochimie peuvent être effectuées soit en MO soit en ME, sur frottis cellulaires, coupes au cryostat de matériel congelé ou sur coupes de matériel inclus. Divers procédés ont été utilisés pour augmenter la sensibilité des techniques immuno-histochimiques : (1) Procédés visant à dévoiler les antigènes masqués (digestion enzymatique par une protéase - comme la trypsine, pepsine, ou pronase par exemple-, altération de la structure spatiale des protéines par chauffage au four à micro-ondes) ; (2) Perméabilisation des membranes cytoplasmique et nucléaire par l'utilisation du TritonX-100 (détergent non-ionique qui permet la dissolution des phospholipides membranaires); (3) Amplification des édifices moléculaires dans les méthodes sandwich (multiplication des anticorps intermédiaires). On peut également jouer sur le type des anticorps primaires : les anticorps utilisés peuvent être polyclonaux (obtenus après immunisation d'un animal) ou monoclonaux (produits par la technique des hybridomes). La spécificité des anticorps monoclonaux est évidemment supérieure à celle des sérums polyclonaux, mais leur sensibilité peut être inférieure. FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire FFFFJFJ 9 IV- L'HYBRIDATION IN SITU La détection d'une séquence d'acides nucléiques peut être réalisée par l'hybridation de cette séquence avec une séquence d'acides nucléiques complémentaire préalablement marquée (sonde). Les méthodes reposant sur ce principe sont le Southern blot, le Northern blot, et l'amplification génique par PCR (Polymerase Chain Reaction), effectués à partir de broyats de tissus, et l'hybridation in situ (HIS ou ISH pour "In Situ Hybridization") qui s'effectue sur frottis cellulaires ou coupes histologiques, et permet la détection et la localisation précise de séquences d'acides nucléiques dans les cellules ou le tissu. Les sondes utilisées peuvent être de petite taille, constituées d’acides nucléiques synthétiques de 20 à 50 nucléotides (oligosondes), ou de plus grande taille, de plusieurs centaines de bases, synthétisées à partir de vecteurs (plasmides, cosmides, etc…). Le marquage des sondes peut être réalisé par des isotopes radio-actifs ("sondes chaudes" : tritium H3, phosphore P32 ou P33, soufre S35) ou par des produits non radio-actifs (sondes dites "froides" utilisant des systèmes de révélation semblables à ceux utilisés en immuno-histochimime, notamment la fluorescence (FISH : « fluorescent in situ hybridization »). La révélation de l'hybridation se fait par autoradiographie en cas de sonde chaude (comptage des grains d'argent sur les autoradiographies permettant une estimation quantitative de la réaction), ou fait appel à des méthodes semblables à celles de l'immunohistochimie en cas de sonde froide (exemple : microscopie à fluorescence pour le FISH). La technique de PCR in situ associe l'extrême sensibilité de l'amplification par PCR et les techniques de localisation cellulaire de l'ISH. Elle est très délicate à mettre en oeuvre. V- LES MARQUAGES MULTIPLES Des signaux multiples peuvent être localisés simultanément sur une même préparation grâce à l'utilisation de méthodes différentes de révélation (fluorochromes de différentes couleurs, différentes enzymes de révélation, billes d’or de tailles différentes, etc). Des marquages doubles ou triples sont communément utilisés en recherche. FJ Authier – Introduction à l’histologie & principes de l’histologie moléculaire