Modulo 11: Viral Elimination and Quality Tests PDF

Módulo 11: Eliminación viral y pruebas para detectar contaminantes en productos/facilidades BIOT 6230 OBJETIVOS ¡ Explicar la importancia de la eliminación viral aplicada a bioprocesos de productos terapéuticos. ¡ Describir la estrategia general relacionada a la eliminación viral en las industr...

Módulo 11: Eliminación viral y pruebas para detectar contaminantes en productos/facilidades BIOT 6230 OBJETIVOS ¡ Explicar la importancia de la eliminación viral aplicada a bioprocesos de productos terapéuticos. ¡ Describir la estrategia general relacionada a la eliminación viral en las industrias. ¡ Evaluar la importancia de la incorporación de tecnologías para la eliminación viral en los bioprocesos para productos terapéuticos. ¡ Identificar los métodos principales utilizados para la eliminación viral. ¡ Describir qué contaminantes comunes pueden afectar los productos o materiales. ¡ Explicar cuáles son las técnicas principales llevadas a cabo para detectar contaminantes. ¡ Describir los objetivos y discutir la importancia de las pruebas de esterilidad, bioburden, para microorganismos objetables y para endotoxinas. ¡ Justificar la importancia de las pruebas de calidad microbiológica para los distintos tipos de bioprocesos. 2 INTRODUCCIÓN ¡ En todo bioproceso para la generación de un producto, en especial los que surgen de cultivos celulares para la generación de biofármacos, cada industria tiene que garantizar que los riesgos de contaminación del producto de interés sean los mínimos (tanto en las etapas “upstream” y “downstream”). En especial cuando los productos generados serán utilizados por pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos. ¡ Existen numerosos tipos de contaminantes que deben ser removidos o evitados en cada una de las distintas etapas del bioproceso comercial: ¡ En las etapas finales (“downstream”) el control de la contaminación es un asunto mucho más serio, toda vez que son en estas etapas que se acerca la confección del producto final, tal como será distribuido al mercado y utilizado por los consumidores. ¡ El riesgo de la presencia de microorganismos es alto en los distintos tipos de bioprocesos (en “upstream y en “downstream”), aun cuando existan facilidades apropiadas y estrategias para intentar reducir la posibilidad de contaminación con mircroorganismos y otros tipos de contaminantes. 3 INTRODUCCIÓN ¡ Hay muchos tipos de productos como por ejemplo, las proteínas, que no pueden pasar por procesos de esterilización típicos de muchas compañías. ¡ La exposición a altas temperaturas o la irradiación de productos es frecuente en diversas compañías. Sin embargo, si estos métodos no se pueden aplicar, entonces se tienen que aplicar métodos de control y prevención de la contaminación en todas las etapas así como en las de finalización o terminación. ¡ En los primeros temas del curso ya vimos como las facilidades, las validaciones, las regulaciones y el control de calidad ayudan a minimizar este problema. Sin embargo, por la naturaleza de la mayoría de los bioprocesos actuales, hay otros riesgos de contaminación, como por ejemplo virus, que tienen que ser atendidos en la operación rutinaria. ¡ La contaminación del producto es uno de los aspectos más peligrosos y que pueden afectar negativamente a una industria. Por esta razón la aplicación de métodos para contrarrestar la contaminación y para evitar la distribución de productos contaminados es requisito regulatorio y tiene que ser cumplido por cada industria. 4 CONTAMINANTES COMUNES EN ALGUNAS ETAPAS DE LOS BIOPROCESOS COMERCIALES ¡ Microorganismos y sus estructuras asociadas (ej., endotoxinas bacterianas), esporas de hongos, entre otras) ¡ Virus ¡ Priones ¡ Sustancias pirogénicas (causantes de fiebre) ¡ DNA ¡ Proteínas que no son de interés (agregados, inactivas o con modificaciones no deseadas ¡ Agentes químicos usados en los procesos ¡ Estos contaminantes no solo afectan la efectividad del producto, sino además, pueden poner en riesgo la vida de aquellos pacientes que utilicen el producto contaminado, máxime si están inmunocomprometidos. 5 CONTAMINACIÓN EN LOS BIOPROCESOS ¡ Mayor preocupación es la microbiana ¡ El ser humano es la fuente principal de contaminantes microbianos ¡ Puede haber también contaminación química o mezclas erróneas 6 DENTRO DE LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA: ¡ Las bacterias son las que más afectan, seguido de los hongos ¡ Sin embargo, muchos ingredientes que se utilizan en los cultivos celulares pudieran tener contaminantes microbianos no tan comunes como es el caso de virus y micoplasmas. ¡ Los virus son entes acelulares microscópicos que parasitan células ¡ Las micoplasmas son bacterias muy pequeñas que no tienen pared celular 7 LA CONTAMINACIÓN CON VIRUS ¡ Entre los entes más problemáticos como posibles contaminantes de cultivos celulares o en bioprocesos, tenemos que mencionar primero a los virus. Es importante nuevamente recordar que los virus son entes acelulares que funcionan como parásitos intracelulares. ¡ Solo material genético y proteínas; y en algunos casos pueden tener una envoltura de lípidos. ¡ ¡ Esto hace que sean difíciles de detectar y controlar Los virus son por lo general los entes microbianos más pequeños (si los comparamos con bacterias), su tamaño está en el rango de los nanómetros (nm). Por lo tanto, es un ente muy difícil de detectar en los procesos y por las pruebas rutinarias que se deben realizar. En muchas ocasiones los virus pueden pasar desapercibidos en medios, cultivos de células y en otros materiales relacionados a la producción. 8 LA CONTAMINACIÓN CON VIRUS ¿Cómo pueden llegar los virus a un proceso de generación de un producto? ¡ Los virus pueden llegar al sistema de producción “upstream” y/o “downstream” provenientes de los medios de cultivo (o sus ingredientes) utilizados para el cultivo de las células, a través de la misma línea celular productora (que estuviera contaminada de antemano), o por contaminación externa (humanos, factores ambientales, agua, etc.). ¡ Es decir, la contaminación viral puede venir desde los procesos “upstream”, principalmente por materiales que forman el medio de cultivo. 9 ¡ A nivel regulatorio se exige que cada industria realice al menos dos procesos diferentes para la remoción o inactivación de posibles virus, antes de la terminación o finalización de los productos en un bioproceso. El concepto utilizado es procesos ortogonales, es decir, diferentes tecnologías aplicadas en el mismo ciclo de procesamiento (con distintos mecanismos) para la remoción de virus. ¡ Las tecnologías que se aplican son establecidas por cada compañía, LA ELIMINACIÓN VIRAL y pueden aplicarse en secuencia corrida o no necesariamente una exactamente detrás de la otra en la producción “dowsntream”. ¡ Por ejemplo, puede ser que en la etapa justo después de la recuperación se aplique alguna metodología para la inactivación viral y luego en las etapas de purificación final se aplique otro proceso de remoción viral diferente. ¡ En otras palabras, cada industria que confecciona un producto de naturaleza biológica, y que no puede pasar por procesos convencionales de esterilización (como en el caso de tabletas, sueros, etc.), tiene que integrar unos procesos distintos (ortogonales) para garantizar la remoción o la inactivación viral. ¡ Ni siquiera se revisa si los productos tienen virus, eso se da como si fuera cierto ¡ Asî que en “downstream” los procesos tienen que incluir métodos para remover virus en las etapas de purificación. 10 ¡ ¿QUÉ ESTRATEGIAS PUEDEN SER APLICADAS PARA LA ELIMINACIÓN DE VIRUS EN LOS BIOPROCESOS? Hay varias estrategias que se aplican para la remoción viral: ¡ El uso de “buffers” que tienen distintos componentes ¡ Procesos específicos de inactivación con la aplicación de: ¡ Detergentes ¡ Solventes específicos ¡ pH extremos ¡ Químicos ¡ Calor (uno muy utilizado) ¡ Radiación ¡ Uso de métodos de partición: ¡ Cromatografía ¡ Filtración viral (tienen que ser membranas especiales- por el tamaño de los virus) ¡ Diafiltración ¡ Precipitación 11 APLICACIÓN DE MÉTODOS DE REMOCIÓN VIRAL ¡ Por lo general, como mínimo, hay un método de remoción viral, integrado a la etapa de Recuperación y otro aplicado en las etapas de purificación final, pero hay compañías que aplican más de dos. ¡ El orden específico puede variar de compañía en compañía,. ¡ Siempre los procesos relacionados a la producción de biofármacos son más estrictos que otros bioprocesos que no son de naturaleza terapéutica. ¡ Hay bioprocesos tradicionales (no terapéuticos) que no requieren la remoción de partículas virales. ¡ Producción de ácidos orgánicos ¡ Producción de cerveza/vino ¡ Producción de enzimas ¡ Entre otros 12 CONTAMINANTES CATALOGADOS COMO AGENTES PIROGÉNICOS ¡ Los pirógenos son moléculas que cuando entran al torrente sanguíneo, tienen la capacidad de producir fiebre en el paciente, así como unas respuestas inmunológicas que pueden ser más severas y que pueden llevar a la muerte de un paciente si no recibe atención médica inmediata. ¡ Ya sea que ocasione problemas menos significativos como problemas más severos, los pirógenos no deben estar en productos que entrarán en el organismo. ¡ Por lo tanto, es necesario que existan pruebas para determinar su presencia en los productos. Algunos ejemplos de agentes pirógenos son: ¡ Cierto tipo de sustancias químicas ¡ Material particulado no viable (pequeñas fibras principalmente). ¡ La endotoxina de las bacterias gram negativas (que forma parte del lipopolisacárido de dichas bacterias). ¡ Esta puede ser peligrosa 13 CONTAMINACIÓN POR DNA ¡ La contaminación con DNA por su parte es otro problema común en especial en las etapas “downstream” iniciales, y aunque su significancia médica en el producto final no está del todo clara, sí se cree que puede provocar respuestas inmunológicas no deseadas en el paciente. ¡ A nivel operacional, el DNA aumenta la viscosidad de la solución, lo que hace un poco más difícil los procesos de recuperación y purificación inicial. Por lo general, se utilizan nucleasas para contrarrestar este problema. Estas enzimas degradan el material genético y no afectan a las proteínas. ¡ El uso de sistemas de cromatografía, principalmente las que son de intercambio iónico, así como de filtración en gel, es muy efectivo en la remoción de proteínas no deseadas y del DNA. Sin embargo, cada industria tiene que realizar pruebas para caracterizar los productos en las diferentes etapas, particularmente una vez finalizados los procesos de purificación. ¡ Es necesario que se lleven a cabo pruebas para determinar la presencia y cantidad de la molécula de interés, así como la potencia del producto (proteína de interés). La determinación de la concentración de proteínas y de la presencia de impurezas en el producto final es requerida para el éxito del proceso 14 CONTAMINACIÓN POR PROTEÍNAS ¡ Las impurezas de naturaleza proteica, así como las proteínas que no son de interés son muy abundantes en las etapas “downstream”. ¡ Los procesos de purificación, particularmente los de cromatografía tienen el objetivo primordial de remover las proteínas no deseadas. Existen diversas fuentes que pueden aportar proteínas en los procesos de cultivo de células como los medios de proteínas no deseadas, más las células productoras tienen muchas proteínas que no son la de interés. ¡ En adición, las mismas proteínas de interés pueden ser afectadas en el proceso “downstream” y formar agregados inactivos o pueden sufrir modificaciones en su estructura, lo que a su vez modifica su actividad biológica. Es requerido que éstas también sean removidas del proceso de producción. Los problemas mayores con las impurezas de naturaleza proteica incluyen: ¡ El potencial de su actividad biológica (efectos que no son los esperados en el producto final). ¡ Pueden actuar como antígenos por la capacidad que tienen de fomentar respuestas del sistema inmunológico, que en ocasiones pueden ser severas y peligrosas. 15 CONTAMINANTES MICROBIANOS ¡ Los principales contaminantes microbianos en las bioindustrias son las bacterias y los hongos. ¡ Son mayormente bacterias gram positivas ¡ Malas prácticas asépticas ¡ Micoplasmas ¡ ¡ Ingredientes de medio de cultivo celular Bacetrias gram negativas ¡ Agua contaminada ¡ En el caso de los hongos, se pueden encontrar tanto levaduras como hongos miceliales (mohos). ¡ Es importante recalcar que la presencia de microorganismos en la inmensa mayoría de productos no es aceptada, a no ser que el producto requiera la presencia microbiana (ejemplo, alimentos, probióticos) o que sea un producto no estéril (no va a llegar a tener contacto con el cuerpo humano), y que esa población microbiana no sea peligrosa. 16 ¡ Para esto las compañías tienen por LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA TIENE QUE SER DETECTADA regla que realizar análisis microbianos a la materia prima, facilidades, equipos, productos, entre otros. ¡ Eso es clave para reducir el riesgo de que un producto pase al mercado contaminado con microorganismos. ¡ La división de QC, en específico el laboratorio de Microbiología se encarga de este tipo de pruebas y análisis. 17 ESTRATEGIAS PARA IDENTIFICAR POSIBLES CONTAMINANTES ¡ Cada compañía debe realizar distintos tipos de análisis para verificar la posible presencia de contaminantes microbianos o de moléculas no deseadas en la materia prima, las aguas y los productos. ¡ Existen diversos tipos de análisis químicos, moleculares, inmunológicos, bioquímicosmicrobiológicos, entre otros. ¡ Por lo general, sistemas de espectrometría de masa (MS) son ampliamente utilizadosen laboratorios de control de calidad para detectar presencia de moléculas no deseadas en la materia prima. ¡ De igual forma existen numerosas pruebas microbiológicas específicas, y también se aplican métodos como “Western blot”, ELISA, electroforesis en 2D, RT-PCR, cromatografía, secuenciación, entre otros. ¡ Muchas compañías utilizan sistemas automatizados validados para la identificación microbiana. Muchos de estos sistemas se fundamentan en utilización de sustratos de carbono (perfil bioquímico) ¡ Ejemplos de algunos sistemas bioquímicos automatizados: ¡ Sistema Vitek ¡ Sistema Biolog ¡ Sistema Phoenix 18 Existen diferentes tipos de pruebas y dependiendo el tipo de producto es que se especificarán las que deben ser realizadas. PRUEBAS PARA IDENTIFICAR LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA Por lo general, las siguientes son las pruebas que más se llevan a cabo para analizar posible presencia microbiana: Prueba de límites microbianos (“Bioburden”) 19 Prueba de endotoxinas Pruebas para microorganismos objetables Prueba de esterilidad (requerida para muchos productos de naturaleza terapéutica) Pruebas para detectar micoplasmas ¿QUÉ PRUEBAS MICROBIANAS SE REQUIEREN? ¡ Las regulaciones van a especificar, pero todo depende del tipo de producto y su uso esperado ¡ Productos parenterales (inyectables) son los que más pruebas de control de calidad requieren, pero toda compañía productira tiene que garantizar que sus productos cumplen con los estándares establecidos según las regulaciones aplicables. ¡ A continuación serán descritas las pruebas de naturaleza microbiana más comunes en las industrias reguladas. 20 PRUEBA DE ESTERILIDAD (“STERILITY TESTING”) ¡ Es una prueba que se realiza con el objetivo de verificar que un material, solución o producto esté libre de microorganismos (bacterias y hongos-principalmente). ¡ Es decir, esta prueba verifica presencia de contaminación viable. Se hace a materiales y productos que requieren estar libres de microorganismos. ¡ Se realiza en industrias cuyos productos requieren ser estériles (productos parenterales [inyectables] por ejemplo). ¡ Si los resultados de esta prueba no son satisfactorios (es decir si hay crecimiento en esta prueba)-es muy probable que el material o el producto, luego de una investigación minuciosa tenga que es rechazado, o se retrase su salida al mercado, si se confirma ausencia real de contaminantes. ¡ Existen protocolos que establecen el uso de unos medios de cultivo específicos con los cuales se tiene que llevar a cabo las pruebas de esterilidad. En industrias de productos no estériles, no se estará llevando a cabo esta prueba de esterilidad, aunque pudiera realizarse a materiales necesarios para la producción. ¡ Recuerden que no todos los productos tienen que estar estériles, o están estériles en las etapas previo a la terminación 21 https://www.arlok.com/basics-sterility-testing-1 22 PRUEBA DE ESTERILIDAD ¡ Para que se apruebe la misma NO puede haber crecimiento microbiano ¡ ¡ El producto o material tiene que ser estéril Requiere antes de llevarla a cabo, hacer un control positivo (“growth promotion”) y un control negativo antes de su aplicación ¡ Se verifica que el medio permite el crecimiento de microorganismos (al hacer el control positivo) ¡ ¡ Se inocula el medio con una cantidad conocida de la bacteria de prueba Se verifica que el medio no está contaminado antes de su uso (control negativo) ¡ Solo se incuba el medio sin manipular PRUEBAS DE LÍMITES MICROBIANOS (BIOBURDEN) ¡ Esta es una de las más comunes que se realiza. ¡ Bioburden significa carga (cantidad) microbiana total de una muestra tomada. La realizan casi todas las compañías que generan productos para el consumo humano, principalmente con fines terapéuticos. ¡ Las pruebas para bioburden se conocen como “microbial limit testing”. En términos generales hay dos tipos de pruebas: ¡ ¡ TAMC: Total Aerobic Microbial Count ¡ TYMC: Total Combined Yeasts and Molds Count ¡ Este tipo de pruebas se hacen a materiales y productos que se espera sean estériles, pero también se les realiza a aquellos que no tienen que ser estériles (no tienen contacto directo con el producto o no serán utilizados de forma sistémica en un consumidor). Al final, los resultados obtenidos en estas pruebas se verifican contra los estándares y parámetros establecidos por regulación para saber si el material o producto examinado cumple o no con los requisitos de calidad. Es decir, hay un número máximo (límite) permitido de microorganismos. Esos límites van a variar dependiendo el material analizado y el tipo de producto. 23 ¡ Busca verificar la cantidad de microorganismos en una muestra de materia prima o producto antes de que pasen por procesos de esterilización BIOBURDEN ¡ Aunque pudiera haber crecimiento, se supone esté dentro de un límite aceptable por regulación ¡ Los microorganismos son ubicuos ¡ Es decir, son comunes en el ambiente. 24 ¡ Hay microorganismos específicos que son objetables, o que NO pueden estar presentes en los materiales ni en los productos. Depende el tipo de producto, ya está establecido por regulación qué microorganismos son considerados objetables, y por ende entonces la obligación de realizar pruebas específicas para detectarlos. ¡ Ejemplos de microorganismos objetables para industrias específicas: PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MICROORGANISMOS OBJETABLES ¡ ¡ Pseudomonas aeruginosa (productos tópicos (ungüentos), medicamentos tópicos para quemaduras) ¡ Escherichia coli (medicamentos que se toman por boca) ¡ Staphylococcus aureus (gotas para ojos, ungüentos) ¡ Salmonella spp. (medicamentos que se toman por boca, alimentos, suplementos) ¡ Bacterias gram negativas tolerantes a la bilis ¡ Clostridios ¡ Candida albicans Cada compañía sabe qué pruebas específicas tienen que hacer para objetables relacionados a sus productos. ¡ Esto está descrito en las regulaciones y en la farmacopea de EEUU (USP) 25 LOS MICROORGANISMOS OBJETABLES PUEDEN ¡ Dañar un producto ¡ Hacerlo inefectivo ¡ Alterar la salud de un paciente ¡ Hacer que no sea atractivo para un consumidor 26 PRUEBA DE ENDOTOXINAS ¡ Esta es otra de las pruebas que más se realizan. ¡ Las endotoxinas son parte de la segunda membrana de bacterias gram negativas (lipopolisacárido). ¡ Cuando están presentes en un producto, dependiendo de su cantidad, pueden promover una respuesta inmunológica exagerada que pudiera llevar a la muerte a una persona. ¡ ¡ Por lo tanto, es muy importante saber si un material o un producto tiene presencia de endotoxinas y en qué cantidades. Hay diferentes pruebas para detectar endotoxinas. Las tradicionales son las LAL (Limulus amebocyte lysate), sin embargo, hay esta prueba es cualitativa y un tanto subjetiva, por lo que hay otros métodos para detectar endotoxinas (métodos colorimétricos, métodos moleculares) que se aplican en la actualidad. 27 28 https://www.quora.com/How-are-lipopolysaccharides-physiologically-important PRUEBA LAL ¡ Esta prueba fue ampliamente utilizada en la década de los 1990 y los 2000 para detectar de forma cualitativa la presencia de endotoxinas en materia prima y productos ¡ Es una prueba cualitativa que fue desarrollada en los 1960s y que se basaba en una célula especializada presente en la sangre del cangrejo de herradura (Limulus polyphemus) ¡ ¡ Esta célula crea una reacción de polimerización al interactuar con endotoxinas bacterianas que fomenta una coagulación La prueba se le conoce además como-gel clot: si un producto tiene endotoxinas, el medio de la prueba se coagula y eso es un resultado positivo 29 YA EN LA ACTUALIDAD SE USAN PRUEBAS CUANTITATIVAS PARA DETECCIÓN DE ENDOTOXINAS ¡ Estas pruebas se basan en espectrofotometría y puede ser en una dinámica colorimétrica (sustrato de color especial) o turbidimétrica (meramente basándose en la turbidez del líquido) ¡ Los datos de absorbancia se cuantifican y eso permite saber la concentración de endotoxinas en una solución. ¡ Es como un tipo de prueba ELISA ¡ Existen estándares establecidos para poder establecer si hay un número no permitido de endotoxinas (unidades de endotoxinas) en una muestra. 30 PRUEBAS DE ENDOTOXINA ¡ Actualmente existen muchos “kits” que son utilizados para medir presencia de endotoxinas. Estos pueden ser cualitativos (presencia/ausencia) o cuantitativos. ¡ Cada compañía establece por procedimiento cómo será su protocolo de detección de endotoxinas. ¡ Entre los materiales que son evaluados para presencia de endotoxinas se encuentran: ¡ Productos ¡ Agua ¡ Soluciones Buffer ¡ Medios de cultivo ¡ Otros 31 PRUEBAS PARA DETECCIÓN DE MICOPLASMA ¡ Las micoplasmas son muy frecuentemente contaminantes del cultivo de células en las que se generan los productos biofarmacéuticos. ¡ Por eso es importante realizar la prueba de micoplasma a los cultivos celulares y otras soluciones que tendrán contacto con el producto en algún momento dado. ¡ Existen diversas pruebas para la detección de micoplasmas en cultivos celulares y en materia prima ¡ Las más utilizadas son el cultivo en medio especial para micoplasmas y PCR ¡ También se utilizan: ¡ Inmunofluorescencia ¡ Microscopía confocal 32 PRUEBAS PRINCIPALES PARA MICOPLASMAS ¡ Se utiliza un medio de cultivo especial para micoplasma y se inocula una dilución de la sustancia a ser evaluada en el mismo ¡ Este medio se incuba por 14 días y al cabo de este tiempo se evalúa bajo el microscopio de luz, la presencia de colonias pequeñas que parecen huevos fritos, que confirman presencia de la bacteria. ¡ Como se tarda mucho, por eso se prefiere iniciar con un PCR y se usa la prueba del medio de cultivo como un método confirmatorio. ¡ En la prueba de PCR las bandas del DNA de micoplasmas ocurren entre 400-550 pares de bases 33 ALGUNAS LECTURAS SUGERIDAS PARA AMPLIAR EL MATERIAL ¡ http://www.future-science.com/doi/pdf/10.4155/pbp.13.61 ¡ http://www.bioprocessintl.com/wp-content/uploads/bpi-content/BPI_A_131109AR02_O_230170a.pdf ¡ http://www.processdevelopmentforum.com/articles/application-of-quality-by-design-to-viral-safety/ ¡ http://omicsonline.org/rapid-assay-of-bioburden-endotoxin-and-other-contaminnation-2157-7064.1000204.pdf 34 FUENTES ADICIONALES ¡ https://www.youtube.com/watch?v=Gfu61757ikc ¡ https://www.youtube.com/watch?v=N_IKMs2I-do ¡ https://www.youtube.com/watch?v=5Zi2Rl-bI7E 35 REFERENCIAS ¡ Dutton, R.L. & Scharer, J.M., 2007. Advance technologies in biopharmaceutical processing. United Sates of America: Blackwell Publishing. ¡ Gupta, V. K., Singh, B. N., Gathergood, N., & Molina, G. (Eds.). (2020). Bioprocessing for biomolecules production. John Wiley & Sons, Incorporated. ¡ Hugo and Russell's Pharmaceutical Microbiology. Edited by Stephen P. Denyer, Norman A. Hodges, Sean P. Gorman, Brendan F. Gilmore (2014). 36 PLAN PARA EL MÓDULO 11 Se debe terminar de trabajar con el mismo en o antes de la tercera semana de noviembre Tiene un foro relacionado 37