2ème Chapitre - Mécanismes de maintien du génome PDF (2024/2025)

Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Chapitre II. Partie 01. Rappel sur la « Réplication/ Réparation » de l’ADN (Revoir les notions précédemment expliquées durant la 3ème...

Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Chapitre II. Partie 01. Rappel sur la « Réplication/ Réparation » de l’ADN (Revoir les notions précédemment expliquées durant la 3ème année Licence). II. Partie 02 : Systèmes de restriction-modification. II.2.1. Enzymes de restrictions *Définition Ce sont des endonucléases capables de reconnaître une séquence caractéristique de nucléotides dans une molécule d'ADN bicaténaire (quelque soit son origine) et de couper à un point particulier (site spécifique), appelés cibles ou sites de restriction situés entre les nucléotides, ou sur un site pas trop éloigné. Ces sites ont entre 4 et 6 paires de bases avec lesquelles ils sont reconnus. Figure 01. Exemple d’enzyme de restriction « EcoRI ». *Découverte - Les enzymes de restriction sont des protéines synthétisées par des bactéries pour se protéger des infections de virus (bactériophages). - Ce mécanisme de résistance aux bactériophages, dénommé restriction, fut étudié par Arber à l’Université de Genève dans les années 60. - Ces enzymes coupent l’ADN viral à des endroits spécifiques. - Nathans et Smith ont obtenu le prix Nobel de Médecine en 1978 pour la découverte et les applications des enzymes de restriction. Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Figure 02. Schéma représentant la coupure par l’enzyme EcoRI. Ces sites sont pour la plupart palindromiques (= ils sont composés de séquences nucléotidiques identiques sur les deux brins mais en orientations antiparallèles). - Les enzymes de restriction sont des protéines synthétisées par des bactéries pour se protéger des infections de virus (bactériophages). - Ce mécanisme de résistance aux bactériophages, dénommé restriction, fut étudié par Arber à l’Université de Genève dans les années 60. - Ces enzymes coupent l’ADN viral à des endroits spécifiques. - Nathans et Smith ont obtenu le prix Nobel de Médecine en 1978 pour la découverte et les applications des enzymes de restriction. Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome - Lorsqu’un bactériophage infecte une bactérie, il lui « injecte » son ADN :  1er Cas : « Sans système de défense adapté » : De nombreux bactériophages seront alors produits dans la bactérie qui sera finalement lysée.  2ème Cas : « Résistance de la bactérie » : De manière à résister à cette infection, la bactérie synthétise des enzymes de restriction qui vont fragmenter l'ADN viral étranger. Parallèlement : La bactérie possède des méthylases capables de modifier (méthyler) son propre ADN afin qu’il ne soit pas reconnu par les enzymes de restriction. - Aujourd’hui plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes sont disponibles commercialement, qui font parties des outils indispensables en biologie moléculaire (ciseaux moléculaires). - Ces outils permettent de couper l’ADN afin de :  Isoler certains fragments.  Construire des cartes génétiques (cartes de restriction).  Créer de nouvelles combinaisons d’ADN...clonage.. etc. - En ce qui concerne la nomenclature des enzymes de restriction, les trois premières lettres de chacune d’entre elle concernent :  La première lettre du nom de genre, par exemple E (Escherichia).  Les deux premières lettres du nom de l’espèce, par exemple co (coli).  La quatrième concerne la souche bactérienne d’où est extraite l’enzyme en question.  Le chiffre romain : indique l’ordre de la caractérisation de l’enzyme chez la même souche. Exemple : HindIII signifie que c’est la troisième (III) Enzyme de restriction isolée et caractérisée de la souche bactérienne Haemophilus influenza Rd. Tableau I. Le nom d’une enzyme de restriction indique son origine. Nom de l’enzyme Origine Sau3A Staphylococcus aureus 3A BamHI Bacillus amyloliquefaciens H (1° dans la souche ) EcoRI Escherichia coli (1° dans la souche ) MspI Moraxella species (1° dans la souche ) KpnI Klebsiella pneumoniae (1° dans la souche ) * Fonctionnement - Aujourd’hui plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes sont disponibles commercialement, qui font parties des outils indispensables en biologie moléculaire (ciseaux moléculaires). - Ces outils permettent de couper l’ADN afin de : Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome  Isoler certains fragments.  Construire des cartes génétiques (cartes de restriction).  Créer de nouvelles combinaisons d’ADN, etc. 2. Présenter un brin plus long que l’autre. Dans ce cas l’extrémité est dénommée "bouts collants" (sticky ends) 1. Les extrémités des fragments obtenus peuvent être formées de deux brins d’égales longueurs, appelés "bouts francs" (blunt ends) Figure 03. Exemples de coupures engendrées par différentes enzymes Figure 04. Suivant le nombre de nucléotides reconnus, l'enzyme de restriction coupe l'ADN plus ou moins fréquemment.  Il existe trois types d’enzymes de restriction :  Les enzymes de type I et III ne sont pas utilisées en pratique, car elles coupent l’ADN de façon aléatoire.  Les enzymes de restriction de type II, clivent spécifiquement les deux brins d’ADN au niveau d’une séquence bien définie (séquence palyndromique). Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Figure 05. Différentes structures des enzymes de restriction (Type I, II et III). II.2.2. Système de restriction-modification *Définition et découverte - Ce système a été découvert en 1968 à la suite d'une série d'études sur l’infection par le phase 1 chez deux souches différentes d'Escherichia coli (appelées souches "K12" et "B"). - Le système de restriction-modification (MR ou RM) est utilisé in vivo par les bactéries pour protéger contre les attaques d'ADN exogènes (normalement virales) qui entrent dans la bactérie, éliminant les séquences étrangères au génome. - Le propre ADN ne subit pas de délétion par les enzymes de restriction de l'organisme qui les produit, car auparavant il a été modifié par méthylation par l'action d'une méthyltransférase, une enzyme qui transfère les groupes méthyle de la S-adénosyl- méthionine (SAM) à des bases spécifiques. Figure 06. Reconnaissance de l’ADN phagique par le système de restriction- modification (RM) d’une bactérie. Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Figure 07. Schéma général montrant le système de restriction-modification (RM) chez les bactéries après infection par un phage. * Fonctionnement de ce système Le système de restriction-modification (MR) est composé de deux parties :  Restriction : permet aux bactéries de se protéger contre l'ADN exogène pour éviter la "promiscuité" dans les échanges génétiques. Cela confère une immunité contre les bactériophages qui pourraient mettre en péril l'individualité génétique ou même la vie de la bactérie, grâce à des coupures par des endonucléases de restriction à de l'ADN exogène qui pénètre dans la bactérie.  Modification : consiste en l'introduction de groupes méthyle (CH3-) dans certaines bases au sein de certaines séquences d’ADN, catalysée par une méthylase spécifique. Figure 08. Schéma montrant la « Restriction/Modification ». Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome  MR type I : Ils ont été les premiers à être décrits, leur caractéristique est que les activités de modification et de restriction sont produites par un complexe multiprotéique qui effectue les deux types d'activités.  MR type II : Ici, chaque sous-unité du dimère reconnaît la même séquence, présente dans chacune des parties spéculaires du palindrome, et effectue une coupe à un endroit spécifique, qui correspond évidemment à l'autre chaîne de l'autre moitié du palindrome. Remarque : Plus d'un tiers des souches bactériennes ont au moins un système de type MR II. Beaucoup d'entre eux sont codés à partir de gènes situés dans des plasmides. Tableau II. Tableau représentant certaines fonctionnalités des deux systèmes RM. Type de fonctionnalités système MR type I - Ils reconnaissent des séquences relativement grandes qui n'ont pas de symétrie. - L'activité de restriction (des sous-unités R) se sépare du site de reconnaissance (de l'ordre d'environ 1 000 pb) et dans des endroits non spécifiques. - La restriction nécessite l‘ATP. - L'activité méthylase du complexe utilise la S-adénosyl-méthionine (SAM) comme donneur des groupes méthyle. MR type II - Les deux activités sont réalisées par deux protéines différentes qui ne forment pas de complexes multiprotéiques. - Ils n'utilisent pas d'ATP. Ils n'ont besoin que des ions Mg ++ pour fonctionner. La méthylase utilise SAM comme donneur de méthyle. - Chaque membre de la paire de modification et de restriction reconnaît la même séquence d'ADN spécifique. - Le site de reconnaissance se compose de 4 ou 6 pb constituant une séquence palindromique. - La méthylase est généralement une protéine monomère, qui introduit des groupes méthyle dans un A ou dans un G (selon la méthylase en question), dans les deux chaînes, au sein du site de reconnaissance. - L'enzyme de restriction est généralement une protéine formée de deux sous-unités du même type, assemblées symétriquement. Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome *Différents systèmes de restriction-modification  Il existe en général 3 (voir 4) systèmes d'enzymes de restriction : Type 1  Une seule enzyme (avec 3 sous-unités).  Activité de restriction (courte) et une modification (méthylation).  Reconnaissance de la séquence d'ADN spécifique coupée au hasard sur des sites autres que le site de reconnaissance (en amont ou en aval).  Coupure laisse des extrémités cohésives.  Besoin d'ATP pour se déplacer dans l'ADN, du site de reconnaissance au site de coupure (environ 1000 paires de bases) + cofacteurs SAM (S-adénosyl-méthionine) et Mg2+. Figure 09. Schéma montrant le système de restriction-modification « Type I ». Type 2  Activité de restriction seulement / D'autres enzymes effectuent la méthylation.  Coupure faite dans le site de reconnaissance ou à proximité, de sorte que la coupure est résistante et prévisible.  En raison de cette caractéristique, ils sont largement utilisés pour le clonage de gènes, car lors de la découpe sur des sites spécifiques, des séquences connues peuvent être récupérées.  Besoin que de Mg2+ comme cofacteur, ils n'ont pas besoin d'ATP. Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Figure 10. Schéma montrant le système de restriction-modification « Type II ». Type 3  Enzyme oligomère qui effectue toutes les activités enzymatiques.  Fonction de restriction et de modification, en coupant de 25 à 27 paires de bases loin du site de reconnaissance, laissant des extrémités cohésives.  Nécessitant deux séquences de reconnaissance en orientation opposée dans la même chaîne d'ADN.  Besoin d'ATP, de Mg2+ et de SAM (S-adénosyl-méthionine) en tant que cofacteurs. Figure 11. Schéma montrant le système de restriction-modification « Type III ». Remarque : Il existe d'autres systèmes de restriction actuellement découverts, tels que le système de type 4 d'E. coli (Eco 571). Type 4  Consiste en une seule enzyme qui ne coupe que l'ADN méthylé dans une séquence spécifique, et qui méthyle également. Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A. Module : SMEG Master 1 GFA Session : 2024/2025 2ème Chapitre : Mécanismes de maintien du génome Figure 12. Comparaison entre les 3 systèmes de restriction-modification (I, II et III) Figure 13. Différents systèmes de restriction-modifications (I,II, III et IV). Structure, Maintien et Expression des Génomes Mme. SAADI A.