Genetyka 2022-2023 - Wykłady Scalone PDF

Genetyka Funkcje poznawcze genomu, metabolizm DNA Dr hab. prof. UJK Wioletta Adamus-Białek Pracownia Genetyki Medycznej Katedra Medycyny Zabiegowej Collegium Medicum UJK w Kielcach [email protected] Kwasy nukleinowe - b...

Genetyka Funkcje poznawcze genomu, metabolizm DNA Dr hab. prof. UJK Wioletta Adamus-Białek Pracownia Genetyki Medycznej Katedra Medycyny Zabiegowej Collegium Medicum UJK w Kielcach [email protected] Kwasy nukleinowe - biomolekuły DNA i RNA (związki organiczne) Gdzie można znaleźć kwasy nukleinowe? KWASY NUKLEINOWE informacja genetyczna organizmu, pośrednia produkcja białek zgodnie z zasadami kodu genetycznego kwas rybonukleinowy (RNA) kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) Liniowe nierozgałęzione biopolimery zbudowane z nukleotydów. Oba mogą występować pod postacią zarówno pojedynczej jak i podwójnej nici, przy czym zazwyczaj DNA tworzy nić podwójną, a RNA pojedynczą. NUKLEOTYD monomer kwasu nukleinowego zbudowany z pięciowęglowego cukru, grupa hydroksylowa znajdująca się przy ostatnim atomie węgla cukru jest zestryfikowana resztą fosforanową, a pierwszy atom węgla połączony jest wiązaniem N-glikozydowym z jedną z czterech zasad azotowych reszty fosforanowe, przyłączone do trzeciego oraz piątego atomu węgla dwóch sąsiednich pentoz polimeru reszty zasadowe to nośnik informacji genetycznej reszty cukrowe i fosforanowe to elementy strukturalne Cukier pentoza (5-C) ZASADY AZOTOWE: PURYNY PIRYMIDYNY STRUKTURA I-RZĘDOWA STRUKTURA I-RZĘDOWA 5’-AGCT-3’ STRUKTURA II-rzędowa DNA Model Dwuniciowej Helisy DNA  B-DNA Typowa, najczęściej występująca w warunkach fizjologicznych jądra eukariotycznego i prokariotycznego Prawoskrętna helisa Dwa helikalne łańcuchy polinukleotydowe oplatają wspólną oś i biegną w przeciwnych kierunkach, Wewnątrz helisy: zasady purynowe i pirymidynowe, na zewnątrz helisy: grupy fosforanowe i reszty deoksyrybozy, Płaszczyzny zasad są prostopadłe do osi helisy, Średnica helisy: 2nm, Okres powtarzalności wzdłuż osi helisy: 3.4nm = 10,5 nukleotydów w każdym łańcuchu.  Dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi komplementarne pary Adenina Tymina Guanina Cytozyna Kolejność zasad w łańcuchu polinukleotydowym nie jest w żaden sposób ograniczona. Ściśle określona sekwencja zasad niesie informację genetyczną. Najważniejszą cechą dwuniciowej helisy DNA jest specyficzność parowania zasad Parowanie Zasad – Wiązania Wodorowe Wiązania chemiczne w cząsteczce kwasu nukleinowego: - Wodorowe (elektrostatyczne, helikazy) - N-glikozydowe (hydroliza kwasowa, hydrolazy glikozydowe) - Fosfodiestrowe (hydrolizują nukleazy, topoizomerazy)  RNA cukier ryboza, uracyl zamiast tymidyny w porównaniu do DNA Dodatkowa grupa hydroksylowa w RNA sprawia, że jest on bardziej podatny na hydrolizę 5-10% masy komórki eukariotycznej Informacyjny RNA – mRNA: przenosi informacje z pojedynczego genu (DNA) do rybosomów, informacja o kolejności łączenia aminokwasów w biosyntezie białka, Rybosomowy RNA – rRNA: udział w strukturze rybosomu, aktywność transferazy peptydowej, translokacja peptydylo-tRNA, w połączeniu z białkami tworzy rybosomy, miejsca w których odbywa się synteza białek. Transportujący RNA – tRNA: tworzy estry ze specyficznymi aminokwasami, które są wykorzystywane do syntezy białek i innych szlaków anabolicznych Małocząsteczkowe RNA – snRNA: bierze udział w wycinaniu intronów, dojrzewaniu rRNA,  RNA- elementy strukturalne Większość cząsteczek RNA występuje w formie pojedynczych nici – wyjątek dwuniciowe RNA niektórych wirusów. Wiele z nich zawiera obszerne rejony o strukturze dwuniciowej helisy (struktura spinki do włosów) Wewnętrzne pętle  Rybosomy Organelle komórkowe o średnicy ok. 20 nm Kompleksy rRNA z białkami, Cząsteczka rybonukleoproteinowa złożona z 2 podjednostek, które zawierają swoisty RNA i swoiste białka, Występuje wiele struktur RNA „szpilek do włosów” i jednoniciowe pętle Ok. 70% RNA to odcinki sparowane, 30% odcinki rozrzucone, W rybosomie każda grupa zasad mRNA łączy się z odpowiednim tRNA związanym z aminokwasem Zaktywowane aminokwasy wiążą się w łańcuch peptydowy Proces biosyntezy białka zachodzący na rybosomach, z wykorzystaniem informacji genetycznej zawartej w mRNA nazywa się translacją Schematycznie struktura przypomina jeża ze szpilkami skierowanymi na zewnątrz, wewnątrz białka głównie zasadowe, sztywna bryła, mogąca zmieniać swój kształt tylko w pewnym zakresie w zależności od typu i etapu biosyntezy białka Wielkość genomowego DNA niektórych organizmów NAJWIĘKSZY Polychaos dubium (Amoeba dubia) - 670 mld bp Amoeba proteus - 290 mld bp Rzadka roślina japońska Paris japonica sports 149 mld bp (Botanical Journal of the Linnean Society) Ryba dwudyszna Protopterus aethiopicus- 130 mld bp, największy znany genom kręgowców NAJMNIEJSZY Wirus żółtej plamistości winorośli (Grapevine yellow speckle viroid) – 220 rybonukleotydów Encephalitozoon intestinalis – 2,25 milion bp, pierwotniaki spokrewnione z grzybami, jednokomórkowe pasożyty wewnątrzkomórkowe ssaków, powodujące mikrosporidiozę W 1984 r. Naukowcy z Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych spotkali się, aby omówić projekt opracowania techniki sekwencjonowania ludzkiego genomu. Cel: wykrywanie mutacji DNA u ocalałych w Japonii po wybuchu bomby atomowej podczas II Wojny Światowej Zaangażowali się również naukowcy z National Institute of Health w Stanach Zjednoczonych, James Watson został szefem National Human Genome Research Institute (NHGRI), później do projektu dołączyli: Wielka Brytania, Francja, Japonia, Kanada, Niemcy i Chiny Utworzyło się międzynarodowe konsorcjum publiczne koordynowane przez Human Genome Organisation (HuGO), pojawiały się kolejne cele Wielkie oczekiwania obejmowały dotarcie do „świętej tajemnicy biologii ”, wyjaśnienie chorób genetycznych i starzenia J. Watson zakończył nadzór nad projektem, ze względu na konflikt interesów – chciał odkodować genom, a jego zastępca wierzył, że znajdzie odpowiedź jak wyleczyć choroby – co dało mu poparcie medialne i rządowe Craig Venter – zaskoczył wszystkich opublikowaniem zsekwencjonowanego pierwszego całego genomu H. influenzae (whole-genome shotgun), stworzył prywatną firmę Celera Genomics Corporation również pracującą nad sekwencjonowaniem genomu ludzkiego Dwa projekty (prywatny i państwowy) zdecydowały się na porozumienie i opublikowanie wyników sekwencjonowania ludzkiego genomu w tym samym czasie 26 czerwca 2000, Francis Collins i Craig Venter spotkali się w Białym Domu z prezydentem Stanów Zjednoczonych, Billem Clintonem i premierem Wielkiej Brytanii Tony Blairem - 15 lutego 2001 projekt ludzkiego genomu wyprodukowany przez publiczne konsorcjum został opublikowany w Nature; 16 lutego tego samego rok Science opublikował projekt od prywatnej firmy Celera Genomics Corporation Wyniki HuGO nadal są na platformie University of California (Human Genome Project Working Draft (http: //genome.cse.ucsc.edu/) oraz w Narodowym Centrum Informacji Biotechnologicznej – NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 3 272 090 000 bp - Całkowita długość DNA w organizmie człowieka przekracza kilka milionów kilometrów. Okazało się, że ludzki genom jest tak samo złożony i wyjątkowy jak każdy inny, co rozwiało wyobrażenia o boskości ludzkiego DNA Oszacowano że: genomy osób niespokrewnionych różnią się o około 1 bp/ 1200 - 1500 bp DNA Zmienność genetyczna wynika głównie z polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) oraz ze zmienności liczby kopii (CNV copy number variations) ponad 40% genów kodujących ludzkie białka są podobne do much i robaków 50% ludzkich genów wykazuje wysokie podobieństwo do sekwencji genomowych innych organizmów Geny nie są równomiernie rozmieszczone w 24 chromosomach (jeden z pary chromosomów oraz X i Y) Tylko około 2% ludzkiego genomu jest zaangażowane w syntezę białek - 20 000 genów to geny kodujące białka Ten fakt był jednym z największych powodów rozczarowania HGP. Przewidywano, że ludzki genom koduje 100 000 genów. Społeczność naukowa była zaskoczona, że liczba ludzkich genów jest równa liczbie raczej niewyszukanego nicienia. Odkrycie to uznano za dość prowokujące i postawiono pytanie: skąd bierze się złożoność organizmu? Uświadomiono sobie, że złożoność człowieka opiera się na kodyfikacji różnych białek, a nie na ilości genów. Część tych genów jest wykorzystywana do budowy różnych białek podczas procesu składania informacyjnego RNA. Dzięki temu odkryciu należało zrewidować pojęcie „jeden gen - jedno białko”, które jak dotąd było częścią głównego dogmatu w biologii.  Nadszedł czas, aby zrozumieć, jak działa DNA, które elementy go regulują i jak zachodzi ta regulacja. We wrześniu 2003 r. Uruchomiono projekt ENCyclopedia of DNA Elements (ENCODE) w celu interpretacji danych wygenerowanych przez HGP. Dzięki zastosowaniu metod eksperymentalnych i bioinformatycznych możliwa była analiza struktury DNA i jej składników funkcjonalnych. Projekt miał na celu przygotowanie pełnego katalogu wszystkich elementów funkcjonalnych skodyfikowanych w ludzkim genomie Projekt ENCODE został opracowany przez 32 grupy badawcze tworzące zespół 440 naukowców. Human Genome Project – 1990 - 2003 ENCyclopedia Of DNA Elements (ENCODE) project Opis genomu ludzkiego – 2000 - 2010 PODSUMOWANIE Zidentyfikowano regiony regulatorowe – miejsca wiązania białek z DNA (czynniki transkrypcyjne i składniki polimerazy RNA): czynniki transkrypcyjne wiążące się ze specyficznymi sekwencjami, niespecyficzne czynniki transkrypcyjne, czynniki struktury chromatyny, czynniki remodelujące chromatynę, metylotransferazy specyficzna dla histonu Czynniki związane z polimerazą RNA III  Około 1/3 miejsc została wykryta tylko w jednym typie komórki 3700 miejsc znaleziono we wszystkich innych typach linii komórkowych – regulacja genetyczna w każdym typie komórki jest zróżnicowana introny biorą udział w regulacji ekspresji genów regulacja ekspresji genów możliwa przez metylację cytozyny na wyspach CpG  SEKWENCJE POWTARZALNE Sekwencje powtarzające się występują głównie ale nie tylko w częściach międzygenowych lecz także w genach, nawet w ich częściach kodujących i mogą brać udział w regulacji ich ekspresji. SONDY SATELITARNE Znaczną część genomów wielu organizmów eukariotycznych stanowi tzw. DNA repetytywne, zorganizowane w formie różnej długości powtórzeń tandemowych. Tandemowe sekwencje repetytywne, powszechnie nazywane DNA satelitarnym, można podzielić na trzy grupy: Powtórzenia satelitarne Powtórzenia minisatelitarne Powtórzenia mikrosatelitarne Znane są także: VNTR - ang. variable number of tandem repeats, STR - ang. short tandem repeats I inne … Sekwencje repetytywne tzw. „genetyczny odcisk palca” - badanie takich sekwencji DNA pozwala na odróżnienie osobników tego samego gatunku (ang. fingerprinting) - sekwencje DNA o dużej zmienności międzyosobniczej (liczne polimorfizmy), zmienność ich wynika z różnej liczby powtórzeń krótkiego fragmentu DNA. - w badaniach genetycznego odcisku palca bada się kilka-kilkanaście polimorfizmów, dzięki czemu można uzyskać odpowiednio wysokie prawdopodobieństwo, że wskazuje on na określoną osobę. - kryminalistyka, ustalania ojcostwa. Powtórzenia satelitarne W skład wchodzi wysoko repetytywne DNA o długości jednej do kilku tysięcy par zasad Sekwencje tego typu występują jako duże (do miliona par zasad!) bloki heterochromatyny w okolicach centromerów i telomerów chromosomów. Tego typu DNA satelitarne szczególnie obficie występuje w chromosomie Y. ZMIENNOŚĆ SEKWENCJI REPETYTYWNYCH 5’AATCAATCAATCAATCGTTCAATCGCCTTTAAGGCTAATCAATCTTGCAAGACTAGCAATCAATCAATCAGTCTAACTTGTGGTAACAGG3’ AATC – 4-nukleotydowe powtórzenie mikrosatelitarne, w nici 90 pz (bp) DNA powtórzone 4 razy (4x, 1x, 2x, 3x) DNA satelitarne wykazuje wyjątkową zmienność w zakresie liczby powtórzeń pomiędzy osobnikami w populacji. Zastosowanie sond satelitarnych umożliwia szybką i precyzyjną ocenę liczby kopii chromosomów w jądrach interfazowych oraz metafazach. Ten rodzaj sond wykorzystywany jest do szczegółowych badań liczby chromosomów, identyfikacji markerów chromosomowych oraz detekcji aneuploidii. Z tego względu sondy satelitarne znajdują szerokie zastosowanie w rutynowych badaniach genetycznych z dziedziny onkologii i patologii. Użycie tych sond gwarantuje uzyskanie silnych i jasnych sygnałów, co umożliwia badanie zmian genetycznych różnych typów materiału, takich jak: komórki hodowane in vitro, preparaty odbitkowe, wymazy z jamy ustnej, preparaty cytospinowe, tkanki mrożone, skrawki parafinowe, próbki plwociny, spermy czy moczu. Ekspansja niestabilnych ciągów powtórzeń w pojedynczych genach jest przyczyną ponad 20 różnych chorób dziedzicznych ang. Triplet Repeat Expansion Diseases (TREDs): zespół łamliwego chromosomu X (FXS), dystrofia miotoniczna (DM), choroba Huntingtona (HD) szereg ataksji rdzeniowomóżdżkowych (SCAs). Ciągi powtórzeń ulegające patogenicznym ekspansjom występują we wszystkich regionach funkcjonalnych genów, zarówno w częściach ulegających translacji, jak i w regionach niekodujących.  Genes, like diamonds, are forever GEN Jesteśmy oto maszynami przetrwania, zaprogramowanymi zawczasu robotami, których zadaniem jest ochranianie samolubnych cząsteczek zwanych genami. Termin "gen" wprowadził duński botanik Wilhelm Johannsen w 1909 roku, kiedy nie zdawano sobie sprawy z działania DNA. W pierwotnym znaczeniu termin ten odnosił się więc do abstrakcyjnej jednostki dziedziczenia, warunkującej występowanie w organizmie (i przekazywanie potomstwu) jakiejś prostej, elementarnej cechy, np. określonej barwy oczu, barwy kwiatów, odporności albo podatności na jakąś chorobę. Dziś wiadomo, że wszelkie dziedziczne cechy organizmów, od ich budowy i cech fizjologicznych, po zwierzęce instynkty, czy ludzkie talenty i skłonności, są wynikiem występowania w komórkach odpowiednich białek, zakodowanych w genach, na ekspresję których ma wpływ środowisko. Gen podstawowa jednostka dziedziczności, która determinuje powstanie jednego polipeptydu lub kwasów rRNA lub tRNA odcinek DNA nadający komórce zdolność do tworzenia RNA, a pośrednio kodujący zwykle także białko za pośrednictwem mRNA; mRNA determinuje budowę określonego białka, tRNA i rRNA to cząsteczki pomocnicze uczestniczące w tworzeniu białek kodowanych w różnych mRNA; poszczególne rodzaje ogromnie zróżnicowanych cząsteczek mRNA zakodowane są w różnych genach  1968 Marshall Nirenberg, Robert William Holley i Har Gobind Khorana, Nagroda Nobla, odkodowanie kodu genetycznego i odkrycie jego roli w syntezie białek. Cechy kodu genetycznego 1. Trójkowy: kodon – 3 nukleotydy obok siebie, 1 aminokwas – 3 nukleotydy (4 zasady: 4x4x4=64 możliwości kodowania aminokwasów) 2. Uniwersalny: 1 kodon – 1 aminokwas (wyjątki: kodony stop w mitochondrium) 3. Niezachodzący: 9 nukleotydów – 3 aminokwasy 4. Bezprzecinkowy: 9 nukleotydów – 3 aminokwasy 5. Wieloznaczny (zdegenerowany): 1 aminokwas < kodony 6. Jednoznaczny (Zdeterminowany): 1 aminokwas – 3 nukleotydy 7. Współliniowy: sekwencja zasad w genie i sekwencja aminokwasów są równoległe Częstość kodowania danego aminokwasu koreluje wprost proporcjonalnie z częstością występowania go w białku, Kodony nie są wykorzystywane z tą samą częstotliwością STOP! UAA – U Are Annoying UGA – U Go Away UAG – U Are Gone Heterogenność DNA Badanie nad kinetyką łączenia się zdenaturowanych nici DNA (renaturacja) 1. Natychmiastowa renaturacja DNA - sekwencje powtarzalne, satelitarne w dużej liczbie kopii, blisko centromerów, heterochromatyna konstytutywna, 10 – 15 % genomu 2. Spowolniona renaturacja DNA – mniej powtarzalne sekwencje, 20 – 40% genomu, sekwencje SINE (elementy Alu o funkcji retrotranspozonów zdolne do przemieszczania się w inne miejsca genomu), LINE (najdłuższe sekwencje niekodujące, ok 6400 bp u człowieka w 100 000 kopii, retrotranspozonowe) 3. Bardzo wolna renaturacja DNA (sekwencje unikalne) Pierwszy odcinek rozpoznawany podczas transkrypcji to sekwencja UTR Gen zaczyna się od ORF (open reading frame) - sekwencji ATG (5’AUG kodujący metioninę) Promotor (ok 100 bp od miejsca start – końca 5’ genu), CAAT (80-70 bp do końca 5’ genu), kaseta TATA lub GC (30 – 25 bp, miejsce przyłączania polimerazy RNA) Eksony – wszystkie sekwencje poddane transkrypcji wystpujące mRNA w cytozolu (wyjątki Rycina) AATAAA – przed końcem ostatniego eksonu (ok 10 – 20 bp) sygnał do odcięcia transkryptu pierwotnego (hnRNA) – zakończenie transkrypcji poniżej AATAAA w regionie bogatym w G/C Intron - część sekwencji genu, która nie koduje sekwencji polipeptydu, a jedynie rozdziela kodujące egzony. Introny powszechnie występują w genach organizmów eukariotycznych, natomiast u prokariotów niezwykle rzadko, jedynie w genach kodujących tRNA i rRNA. Po przepisaniu sekwencji genu z DNA na RNA introny są wycinane przy udziale snRNA w procesie splicingu i powstaje dojrzały matrycowy RNA (mRNA), który wykorzystują rybosomy jako matrycę do syntezy peptydów i białek. Intron nie jest "śmieciem genetycznym" Jak wskazują najnowsze badania, introny mogą kodować specyficzne RNA, które mogą regulować syntezę białek. Niektóre introny mają też właściwości rybozymów, dzięki czemu same się wycinają. Sekwencja intronów dostarcza sygnał dla SR-białek regulując splicing alternatywny. Introny można podzielić na cztery klasy: introny jądrowe, które są wycinane przy udziale spliceosomu, oraz samowycinające się introny I, II i III grupy. M.in. za odkrycie intronów w 1993 roku Phillip A. Sharp i Richard J. Roberts otrzymali nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny. Egzon, ekson - w komórkach eukariotycznych odcinek genu kodujący sekwencję aminokwasów w cząsteczce białka. Eksony są w genomie jądrowym oddzielone intronami. Pierwotny transkrypt zawiera na przemian ułożone odcinki intronowe i eksonowe. Po zsyntetyzowaniu czapeczki i poliadenylacji cząsteczki RNA, ale jeszcze przed jej eksportem z jądra do cytoplazmy następuje wycięcie wszystkich intronów oraz połączenie eksonów w jedną całość (splicing). Po zakończeniu tych procesów transkrypt staje się funkcjonalną cząsteczką informacyjnego RNA (mRNA), który w tej postaci może opuścić jądro komórkowe. Geny regulatorowe (regulatory), geny kontrolujące działanie genów strukturalnych, włączają lub wyłączają ich aktywność genów strukturalnych, dzięki czemu synteza białek przebiega różnie w różnych komórkach, mimo iż wszystkie komórki mają taką samą informację genetyczną, geny regulatorowe to sekwencje kodujące białko, które wpływa na ekspresję genów na poziomie transkrypcji lub translacji. Sekwencja regulatorowa genu (ang. gene regulatory sequence) fragment DNA, który reguluje ekspresję genu, sekwencja regulatorowa to sekwencja nie kodująca, wiążąca się z białkami regulatorowymi. Do sekwencji regulatorowej przyłączają się białka regulujące transkrypcję, takie jak: czynniki transkrypcyjne i remodelatory, oraz polimeraza RNA. Kombinacja tych sekwencji, wraz z kombinacją czynników białkowych dostępnych w jądrze komórkowym i ich aktywności, sprawia, że poziom ekspresji genu jest regulowany w zależności od typu, stanu metabolicznego komórki i bodźców zewnętrznych. House-keeping genes Housekeeping to nie sprzątanie i gotowanie, to GOSPODAROWANIE, PILNOWANIE TEGO CO NAJWAŻNIEJSZE Konstytutywne Ekspresja do końca życia komórki Kodują białka wszechobecne, niezbędne do życia każdej komórki Np. Enzymy glikolityczne, oddechowe Stały niski poziom ekspresji Możliwa regulacja - ekspresja zależy od środowiska zewnętrznego  PSEUDOGENY – tajemnicze zakamarki genomu Uszkodzone niefunkcjonalne geny, w większości nie podlegają transkrypcji (6-20% transkrybowane) Niefunkcjonalność: brak kodonu stop, start, regionu promotorowego Powstają np. podczas powielania / duplikacji genu lub jego fragmentu, niesymetrycznego crossing-over, też jako retropseudogeny Liczne mutacje Niektóre pełnią kluczowe funkcje regulatorowe w transformacji nowotworowej oraz w innych trudnych w leczeniu lub nieuleczalnych chorobach  Typowe geny zawierają informacje o tym: 1. jak zbudować dane białko (tzn. w jakiej kolejności połączyć aminokwasy w ciągły łańcuch) sekwencje kodujące genu 2. do jakiego przedziału komórki je przesyłać (np. do mitochondriów czy do wakuoli) 3. w jakich okolicznościach (warunkach) należy to białko tworzyć sekwencje regulatorowe 4. z jaką intensywnością i przez jaki czas je wytwarzać genu 5. U organizmów tkankowych także informację o tym, w których tkankach, w jakiego typu komórkach dany produkt ma powstawać.  Organizacja genów prokariotycznych Operon: zespół kilku sąsiadujących ze sobą genów, tworzących jednostkę transkrypcji, znajdującą się pod wspólną kontrolą operatora, pojęcie operon wprowadzone przez Jacoba i Monoda w 1961r Ekspresja genu (ang. gene expression) proces, w którym informacja genetyczna zawarta w genie zostaje odczytana i przepisana na jego produkty, które są białkami lub różnymi formami RNA. Transkrypcja i dojrzewanie mRNA – jądro komórkowe Translacja – rybosomy w cytoplazmie Prokariota Eukariota Jedna polimeraza RNA przepisuje informację Trzy polimerazy: polimeraza RNA I (przepisuje głównie geny o wszystkich genach. rybosomowego RNA), polimeraza RNA II (przepisuje geny białek, czyli syntetyzuje mRNA) i polimeraza RNA III (głównie geny tRNA) Z promotorem łączy się bezpośrednio Z promotorem łączą się liczne białka, tzw. czynniki transkrypcyjne, polimeraza, następuje odłączenie jej które wskazują polimerazie miejsce początku transkrypcji. Sygnałem podjednostki sigma i rozpoczęcie transkrypcji. rozpoczęcia transkrypcji jest fosforylacja białek polimerazy prowadzona przez czynnik transkrypcyjny. Cząsteczka RNA po transkrypcji jest od razu Cząsteczka RNA musi przejść proces obróbki, obejmujący wycięcie gotowa do translacji. fragmentów niekodujących (intronów) i połączenie kodujących (egzonów), tzw splicing, oraz zmianę końców cząsteczki: na końcu 5' syntetyzowany jest kap, zmodyfikowana cząsteczka guaniny połączona z rybozą, a do końca 3' przyłączany jest ogon poli(A) - łańcuch złożony z kilkuset nukleotydów adeninowych. Transkrypcja oraz dojrzewanie RNA zachodzą w jądrze, a gotowa Transkrypcja i translacja zachodzą w tym cząsteczka RNA eksportowana jest przez pory jądrowe do samym miejscu cytoplazmy, gdzie zachodzi translacja. U organizmów prokariotycznych kilka części kodujących różnych genów może korzystać z tego samego promotora i innych pomocniczych sekwencji (por. operon). Zarówno u organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych (częściej) część kodująca genu może zawierać fragmenty (sekwencje), których kopii nie ma w dojrzałych, gotowych do działania, cząsteczkach mRNA. Takie wstawki w części kodującej, początkowo przepisywane na mRNA, a później z niego usuwane, nazywamy intronami. Fragmenty części kodującej genu, które pozostają po wycięciu intronów z pierwotnego transkryptu i składają się na dojrzały mRNA, nazywane są eksonami (egzonami). Czasami jeden gen jest składnikiem intronu innego genu. U organizmów prokariotycznych (gł. wirusów), zdarza się też, że ten sam odcinek DNA bywa wykorzystywany jako składnik kilku różnych genów, zależnie od sposobu jego odczytywania Analogicznie np. zapis "maskarada" może być odczytany jako jedno słowo, albo zbitka słów "maska" + "rada", albo nawet "maska"+"kara"+"rada". W przypadku DNA może się też zdarzyć (choć rzadko), że jedna informacja (gen) zapisana jest na jednej nici, a inna, na drugiej komplementarnej nici (sekwencje obu genów odczytywane są wtedy w przeciwnych kierunkach, a ich koniec i początek nie pokrywają się). Oznacza to oczywiście, że komórkowe mechanizmy transkrypcji, obróbki transkryptów i biosyntezy białek wykazywać mogą pewną (bardzo ograniczoną) swobodę w odczytywaniu informacji genetycznej! Kolejność składników genu - trzeba określić, gdzie jest jego początek, a gdzie koniec i która z dwóch nici składająca się na cząsteczkę DNA jest analizowana. Opis i analiza DNA - sekwencja zbliżona do sekwencji transkryptu (mRNA), a nie komplementarną do transkryptu, czytamy w kierunku 5’ – 3’ Nić kodująca – w kierunku 5’-3’ czytamy informację genetyczną, do niej komplementarna nić matrycowa (3’-5’) na której powstaje mRNA (transkrypt, 5’-3’) Fragmenty położone bliżej końca 3' uważane są za położone dalej (niżej) w obrębie genu.  TRANSKRYPCJA Przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA. Proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA. Matryca (nić DNA matrycowa) jest odczytywana w kierunku 3' → 5', a nowa cząsteczka RNA powstaje w kierunku 5' → 3‘(posiada sekwencję nici DNA kodującej). Jednostka transkrypcji - odcinek DNA od promotora do terminatora podlegający transkrypcji. Sekwencje regulatorowe np.: promotorowe, start, stop. Mechaniczne systemy terminatorowe – struktura szpilki do włosów lub białko rho. Podczas transkrypcji polimeraza RNA zależna od DNA buduje cząsteczkę RNA łącząc, zgodnie z zasadą komplementarności, pojedyncze rybonukleotydy według kodu matrycowej nici DNA. Etapy: 1. inicjacja 2. elongacja 3. terminacja  TRANSKRYPCJA W przeciwieństwie do polimerazy RNA bakterii, jądrowe polimerazy RNA organizmów eukariotycznych potrzebują do rozpoczęcia transkrypcji zestawu właściwych dla danej polimerazy czynników transkrypcyjnych: główne (ok 50 białek), specyficzne). Czynniki rozpoznają kompleks kwas nukleinowy-białko. Sterowanie transkrypcją przez związanie czynników białkowych lub hormonalnych może odbywać się z różnych miejsc na DNA. Miejsca te mogą leżeć w obrębie genów (promotory), lub też w odległości kilku tysięcy nukleotydów (enhancery, silencery). Wzmacniacze (enhancery) – często daleko (kpz) powyżej lub poniżej genu, do nich wiążą się aktywatory - z koaktywatorami – z głównym kompleksem czynników transkrypcyjnych Wyciszacze (silncery) – tłumią transkrypcję, wiążą się z represorami Motywy wiążące DNA – struktury białkowe czynników transkrypcyjnych, pomagają zlokalizować czynnikom sekwencje regulatorowe oraz stabilizować ich specyficzne wiązanie  Model wzmacniacza regulacji ekspresji genów. Wzmacniacze są odrębnymi regionami genomowymi, które zawierają klastry miejsc wiążących czynnik transkrypcyjny (TF), które mogą wzmacniać lub zwiększać szybkość transkrypcji docelowego genu (genów), niezależnie od ich lokalizacji, orientacji i odległości w stosunku do celu (ów). (A) Wiązanie czynników transkrypcyjnych (TF) z motywami DNA w wzmacniaczu uruchamia rekrutację kompleksu mediatora i stymuluje zapętlanie chromatyny. (B) Cohesin stabilizuje interakcję wzmacniacz-promotor. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2017 Jan;1860(1):131-139. doi: 10.1016/j.bbagrm.2016.06.006. Epub 2016 Jun 16. Towards genome-wide prediction and characterization of enhancers in plants. Marand AP1, Zhang T1, Zhu B1, Jiang J2. GŁÓWNE KLASY MOTYWÓW WIĄŻĄCYCH DNA 1. Helisa-skręt-helisa 2. Helisa-pętla-helisa 3. Palec cynkowy 4. Suwak leucynowy 5. β-kartka Rgulacja ekspresji poprzez strukturę chromatyny - Epigenetyka (powyżej genetyki): nie dotyczy sekwencji genu: różnice u bliźniąt jednojajowych - modyfikacje białek histonowych - Acetylacja histonów: przyłączenie grup acetylowych do reszt lizyny, aktywacja DNA - Deacetylacja – inaktywacja ekspresji genetycznej - Zwiększenie koncentracji histonów – inaktywacja, zmniejszenie – aktywacja - wyciszanie: metylacja, - Aktywacja: acetylacja, fosforylacja, ADP-rybozylacja (też stabilizacja struktury, procesy naprawy DNA), Ubikwitynacja (degradacja białek, zmiana struktury histonów, rozluźnienie), podobnie sumoilacja, biotynylacja, i prawdopodobnie więcej …  Mechanisms involved in chromatin modifications Five broad and interrelated mechanisms are known to affect chromatin structure: DNA methylation, histone modification, insertion of histone variants, remodeling complexes, and non-coding RNAs. All five have been shown to be essential contributors to the development and cell fate determination of tissues including in the nervous system, while histone modifications and DNA methylation have so far been more extensively investigated in the context of adult brain function. Dulac C. Brain function and chromatin plasticity. Nature. 2010;465(7299):728-735. doi:10.1038/nature09231 miRNA (microRNA) - Może powstawać z intronów lub z obszarów międzygenowych - Także kodowane przez geny, transkrybowany przez polimerazę II, blokuje translację - Dwie długości – 61 nukleotydów i 21-23 nukleotydów (RNAi – interferujący) - Regulacja trwałości mRNA – regulacja ekspresji genów (30% ludzkich genów) – hamowanie ekspresji - Wysoka komplementarność do genów w miejscu 3’UTR – 100% komplementarność - dochodzi do nukleolitycznej degradacji mRNA  Stwardnienie zanikowe boczne Zespół górnej tętnicy krezkowej Ataksja móżdżkowo-rdzeniowa Transkrypcja z udziałem Polimerazy I - Polimeraza I występuje w jąderku - Transkrypcja rDNA tzn. genów kodujących rRNA – tandemy genów powtórzonych (450 kopii u ludzi) - Tworzą wspólną jednostkę transkrypcyjną - Wysoki poziom ekspresji – duża ilość rRNA - Wysokie stężenie polimerazy I - Powstaje pre-rRNA (45S) – dojrzewa poprzez dodanie ponad 100 grup metylowych - Pre-rRNA zostaje pocięty na mniejsze podjednostki - Po dołączeniu się białek rybosomalnych - powstaje duża podjednostka rybosomu 60S oraz mniejsza 40S (w sumie 80S) - Powstałe dwie podjednostki rybosomu przechodzą do cytoplazmy  Transkrypcja z udziałem polimerazy II - Przyłączenie czynników transkrypcyjnych do promotora – zainicjowanie transkrypcji głównie przez białka TF II (A, B, D, E, F ok 25-30 nukleotydów poniżej TATA (jeżeli brak to kaseta CG), - Synteza pre-mRNA - Polimeraza II przyłącza się do kasety TATA - Polimeraza posiada również funkcję odseparowywania mRNA od matrycy, - Liczba cząstek polimerazy do jednoczesnego transkrybowania genu zależy od zapotrzebowania na produkt genu - Polimeraza II sytnetyzuje również snRNA (splicing) - Terminacja – może zależeć od pojawienia się struktury „szpilki do włosów” (sekwencje bogate w GC) - Po rozpoczęciu transkrypcji powstaje czapeczka (cap) na końcu 5’mRNA – niezbędna w procesie dojrzewania mRNA (ochrona przed nukleazami) i translacji (początek translacji) - Nukleaza rozcina transkrypty poprzez nukleazę przyczepiającą się do sekwencji AAUAAA - Po cięciu polimeraza poli-A przyłącza do końca 3’ zmienną liczbę nukleotydów adenylowych (ogon poli-A) – stabilność mRNA - mRNA kodujący białka histonowe nie ma poli-A - Miejsca promotorowe mogą znajdować się w różnych częściach genu – różne białka do różnych tkanek (tk. Mięśniowa lub nerwowa) np. gen dystrofiny  Splicing – wycinanie intronów - Jądro komórkowe - Na końcach intronów sekwencje konsensusowe 5’GU…..AG3’ (znane są też miejsca AT AC) - GU – miejsce donorowe, AG – miejsce akceptorowe - Miejsce rozgałęzienia A (20 nukleotydów powyżej 3’ - Udział snRNA U1, U2, U3, U4, U5, U6 (bogate w uracyl, zmiany genetyczne –> angiogeneza (własne unaczynienie) Brak, zmiana lub maskowanie antygenów powierzchniowych, substancje hamujące odpowiedź immunologiczną, niszczenie limfocytów T – brak skutecznej odpowiedzi immunologicznej, Dziedziczne uwarunkowania zachorowań na raka należy podejrzewać przede wszystkim wówczas, gdy: 1. chorobę wykryto w bardzo młodym wieku, 2. taki sam typ nowotworu pojawił się u kilku blisko spokrewnionych osób, 3. rak wystąpił obustronnie w narządach parzystych (np. obustronny rak piersi, obustronny rak nerki), 4. pojawiały się zachorowania synchroniczne np. w tym samym czasie w jelicie grubym stwierdzono dwa niezależne ogniska raka jelita grubego) lub metachroniczne (np. ta sama osoba zachorowała na raka błony śluzowej trzonu macicy, a następnie na raka jelita grubego), 5. stwierdzono szczególne cechy zachorowania np. rak piersi u mężczyzny, rak jelita grubego współistniejący z mnogimi polipami jelita grubego, nowotwory związane z nerwiakowłókniakowatością) Na podstawie: Krajowy Rejestr Nowotworów  Genetyka nowotworów – zasady ogólne niewielki odsetek powszechnych nowotworów (2 – 5%): – rak piersi, rak jelita grubego – dziedziczność – pojedynczy gen o silnej penetracji w rodzinie obciążonej: – wysokie ryzyko choroby wśród krewnych – dziedziczenie zgodne z pr. Mendla autosomalne dominujące z niepełną penetracją czasem ograniczone do jednej płci  Rozpoznanie w poradni genetycznej Rozpoznanie zespołu dziedzicznie uwarunkowanej predyspozycji do zachorowania na nowotwór: ocena kliniczna zachorowania, analiza rodowodu, ocena wywiadu rodzinnego badania molekularne Analiza rodowodu: krewni I i II stopnia względem probanta Krewni I stopnia: rodzice, rodzeństwo i dzieci Krewni II stopnia: babcie i dziadkowie, rodzeństwo rodziców oraz wnuki. Rozpoznanie zespołu dziedzicznie uwarunkowanej predyspozycji do zachorowania na nowotwory złośliwe jest pewne w sytuacji potwierdzenia nosicielstwa mutacji w znanym genie predyspozycji. Poradnictwo genetyczne, a problemy z pacjentami „Pacjent optymista” Informacja o braku mutacji w jednym z genów predyspozycji u osoby zdrowej z obciążonymi wywiadami rodzinnymi w kierunku raka, może być przez pacjenta mylnie interpretowana jako wykluczenie podwyższonego ryzyka zachorowania na nowotwór. - Można tak wnioskować gdy w danej rodzinie została określona mutacja markerowa, a u pacjenta nie wykryto takiej zmiany. „Pacjent pesymista” stwierdzenie nosicielstwa mutacji w silnym genie predyspozycji do zachorowania na ciężkie choroby może zwiększyć ryzyko ujawnienia się zaburzeń lękowych lub depresyjnych, a także utrudnić pacjentowi dostęp do niektórych form ubezpieczenia czy być powodem zaburzenia relacji rodzinnych. Molekularne podłoże onkogenezy Molekularne podłoże onkogenezy  EGF, VEGF, EGFR, RB-1, VEGFR, WT-1, Src, P53 ZAP-70, APC, ABL, BRCA1 Raf, ATM CDK, RAS, MYC  Czynniki epigenetyczne onkogenezy Rak jelita grubego, przełyku, płuc, prostaty, pęcherza moczowego, glejak wielopostaciowy Nowotwory CIMP-dodatnie (CpG island methylator phenotype): metylacja CpG DNA, niestabilność w wyciszaniu genów: – gen hMLH1, leczenie inhibitorami metylacji w raku jelita grubego – p161NK4a, rak gruczołowy przełyku, glejak wielopostaciowy – RARβ, RASSF1, APC, rak płuca – GSTP1, rak prostaty – K-RAS raki Zaburzanie równowagi hormonalnej lub procesów różnicowania się komórek, przekroczenie stężeń progowych – Hormony np. estradiol – Czynniki immunosupresyjne głównie indukowane przez wirusy – Kokarcynogeny (olejki cytrusowe, katechol, etanol, SO2) podawane równocześnie, zwiększają działanie kancerogenów – Promotory po indukcji przez kancerogen np. fenol, pestycydy chlorowane, estry forbolu  Czynniki epigenetyczne onkogenezy Czynniki ryzyka i predyspozycje rodzinne Dane lit. wskazują, że główną przyczyną powstawania chorób nowotworowych są czynniki środowiskowe (badania nad bliźniętami monozygotycznymi) Kancerogeny: czynniki biologiczne, chemiczne lub fizyczne zwiększające częstość występowania nowotworów złośliwych Palenie papierosów (ok 30% nowotworów), używki, alkohol (ok 3%), niewłaściwa dieta (ok 35%), ekspozycja na azbest, hormony steroidowe, otyłość, infekcje wirusowe i pasożytnicze, promieniowanie Zanieczyszczenie środowiska (ok 2%); produkty rozpadu radonu, UV, substancje chemiczne (np. dioksyny) pochodzące z zakładów przemysłowych Czynniki środowiskowe jako bezpośrednie inicjatory karcynogenezy lub promotory, mogą stymulować powstawanie mutacji i powodować przyspieszony wzrost zmutowanych komórek Rak płuca, pęcherza moczowego, skóry, białaczki  Czynniki epigenetyczne onkogenezy dwa argumenty dot. istotności: – liczba zidentyfikowanych karcynogenów: dym tytoniowy – rak płuc i in. pył radioaktywny – rak płuc azbest – rak płuc i międzybłonniak opłucnej i wiele innych – porównania epidemiologiczne między populacjami rak piersi: częsty wśród ludności pochodzenia europejskiego – w krajach rozwijających się częstość niższa  Biologiczne czynniki onkogenne Wirusy onkogenne oddziaływają z protoonkogenami, antyonkogenami lub ich produktami Zmieniają regulację metabolizmu komórki oraz ekspresję genów poprzez wbudowanie własnego kwasu nukleinowego Kodują białka np. unieczynniające białko pRB lub p53 Mogą zwiększać destabilizację genomu Geny regulatorowe wirusa pełnią funkcję wzmacniaczy w indukcji nowotworu Onkogeny wirusowe (v-onc) wykazują homologię do onkogenów komórkowych (c-onc)  Biologiczne czynniki onkogenne Retrowirusy najpierw przepisują RNA na DNA dzięki odwrotnej transkryptazie, które dopiero wbudowują w genom gospodarza - prowirus gag (białka strukturalne, antygeny swoiste) pol (odwrotna transkryptaza) env (białka otoczki) Trzy grupy: I – retrowirusy przewlekle transformujące, chłoniaki i białaczki po wielu m-cach lub latach; II – retrowirusy ostro transformujące, mięsaki, chłoniaki, białaczki, w ciągu kilku dni od zakażenia za pomocą wirusa pomocniczego; III – retrowirusy transaktywujące, wirus ludzkiej białaczki z komórek T typu 1 i chłoniaki, występują endemicznie w Japonii, HIV-1, HIV-2 – retrowirusy transaktywujące inne wirusy np. Epstein-Barr’a lub HPV Symbol Nazwa Rak WIRUSY DNA JCV Wirus JC rak jelita grubego, postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia HPV Wirus rak szyjki macicy, sromu, skóry, odbytu, prącia, brodawczaka płaskonabłonkowy rak głowy i szyi ludzkiego KSHV/HHV-8 Ludzki wirus mięsak Kaposiego, pierwotny chłoniak wysiękowy, opryszczki wieloośrodkowa choroba Castlemana EBV/HHV-4 Wirus Epstein- Chłoniak Burkitta, Chłoniak Hodgkina, Ziarnica złośliwa, Barr gruczolakorak żołądka, mięsak gładkokomórkowy, niezróżnicowany rak nosogardzieli, MCV Polyomavirus rak komórek Merkla (rak neuroendokrynny skóry) komórek Merkla CMV/HHV-5 Ludzki wirus rak śluzowo-naskórkowy, prawdopodobnie też inne cytomegalii WIRUSY RNA HTLV-1 Ludzki wirus Tropikalna spastyczna parapareza, białaczka dorosłych limfotropowy limfocytów T (ATL) HCV, HBV Wirusy zapalenia Rak wątrobowokomórkowy (HCC) wątroby  Molekularne podłoże onkogenezy Nagromadzenie mutacji w obrębie genów (>100): supresorowych: hamują wzrost i podział (proto)onkogenów: stymulują wzrost i podział stabilizujących (naprawa DNA) kontrolujących apoptozę Biorących udział w angiogenezie Regulujących adhezję komórkową Immunoglobulin i układu HLA Abberacje chromosomalne – geny fuzyjne, zmiana czynników transkrypcyjnych  Molekularne podłoże onkogenezy większość nowotworów – mutacje nie są dziedziczone: – de novo w wieku dorosłym – w komórkach somatycznych – pod wpływem karcynogenów nowotworzenie: – wiele kolejnych mutacji – czynniki dziedziczne mają zazwyczaj niewielki wpływ – Wystąpienie już 2 mutacji znacznie przyspiesza tempo podziałów, – Predyspozycja do kolejnych mutacji w obrębie danego klonu i dalsze złośliwienie nowotworu  Molekularne podłoże onkogenezy geny supresorowe / protoonkogeny: – kontrola wzrostu / podziału komórek wiele mutacji: – konieczność pokonania mechanizmów kontroli podziałów – oraz komórkowych systemów ochronnych: naprawa błędów DNA apoptoza proces starzenia się z związany z replikacją (limit Hayflicka) Przyczyny oporności komórek nowotworowych na substancje przeciwnowotworowe oporność naturalna (brak zjawiska selekcji linii komórkowych) oraz odporność nabyta śmierć komórek < wzrost komórek Przedłużenie średniego czasu przeżycia: Mimo obserwowanej oporności obserwuje się opóźnienie czasu podwojenia guza Mutacje indukowane (rzadziej) i mutacje spontaniczne pojawiające się ze stałym prawdopodobieństwem ze względu na niestabilność genetyczną nowotworu (hipoteza Goldie-Coldman) Pojawienie się mutacji powodującej oporność na lek już w populacji 105 komórek nowotworowych: 1 cm guz (ok. 109 komórek) – oporność na min 1 lek Mutacje TP53 jak i innych genów szlaków apoptozy – silna oporność na wiele leków oraz radioterapię Wielolekowe programy – przełamanie oporności na pojedyncze leki Oporność kinetyczna, biochemiczna, farmakologiczna  Geny supresorowe prawidłowa funkcja kodowanych białek: – hamowanie podziałów komórkowych – rozpoznanie dwuniciowych uszkodzeń DNA kontrola cyklu komórkowego – promowanie apoptozy – kontrola prawidłowego przylegania komórek brak przerzutów związane z nowotworzeniem gdyż: – ich mutacje powodują utratę funkcjonalności kodowanego białka Mutacje recesywne, promuje do rozwoju nowotworu po mutacji w drugim allelu (dwuuderzeniowy model rozwoju nowotworu A. Knudsona)  Geny supresorowe odkryte dzięki badaniom nad siatkówczakiem (retinoblastoma): – nowotwór rzadki (1:20000), najczęstszy nowotwór złośliwy oka u dzieci – gen RB1 (13q14) – negatywny regulator cyklu komórkowego nieufosforylowane RB inaktywuje czynnik transkrypcyjny E2F (konieczny do wejścia w fazę S c.k.) blokada cyklu komórkowego fosforylacja = inaktywacja RB Geny supresorowe  Geny supresorowe zmiany dotyczące utraty „prawidłowego” allelu (loss of heterozygocity; LOH): – missense (kluczowy aminokwas) – mutacje dot. procesu składania prawidłowego transkryptu – skrócenie prawidłowego białka nonsense zmiana ramki odczytu – delecja genu – metylacja CpG w sekwencji promotorowej Mechanizm utraty heterozygotyczności  Geny supresorowe Gen supresorowy Białko, Rak TP53 Zespół Li Fraumeni, rodzinna predyspozycja do nowotworów VHL Zespół von Hippla-Lindaua Rb1 Siatkówczak, osteosarcoma (i mutacja w komórkach rozrodczych, II w komórkach somatycznych) WT1 Guz nerki (g. Wilmsa) (koduje czynnik transkrypcyjny BRCA1, BRCA2 Rak piersi, jajnika NF1, NF2 Neurofibromatosis typ I i II, oponiak, osłoniak nerwu słuchowego APC Rodzinna polipowatość jelita grubego, rak okrężnicy, żołądka, trzustki Geny supresorowe Receptor TGF-β komórek nabłonkowych transformujący czynnik wzrostu, rak okrężnicy HSECAD E-kadheryna komórek nabłonkowych, rak żołądka, piersi  TP53 TP53 (białko p53) – kontrola cyklu komórkowego (wpł. na fosforylację RB) – kontrola procesu apoptozy – najczęstsza zmiana genetyczna w nowotworach Min 50% wszystkich nowotworów 70 % guzów w raku j. grubego = LOH TP53 rak płuc rak piersi nowotwory mózgu rak wątroby przewlekła białaczka szpikowa  Zespół Li Fraumeni – rzadko zdarza się dziedziczenie mutacji TP53 – rozwój niezależnych ognisk nowotworowych w różnych narządach mięsaki kości mięsaki tkanek miękkich białaczki nowotwory: – piersi – mózgu – nadnerczy – trzustki – żołądka – dziedziczenie autosomalne dominujące zwiększona podatność na nowotwory gdy utracony zostanie drugi, prawidłowy allel TP53 (zasada podwójnego uderzenia) 50% szans na nowotwór do 30 r.ż. 90% szans na nowotwór do 70 r.ż. Geny zaangażowane w naprawę DNA – mechanizmy n. DNA – korygowanie uszkodzeń: błędy replikacji działanie mutagenów – defekty dziedziczne w/w systemów: zwiększone ryzyko nowotworów  Xeroderma pigmentosum – uszkodzenie systemu wycinania / naprawy uszkodzeń DNA po ekspozycji na UV – wieloogniskowe raki skóry / bliznowacenie rogówki Mutacje drugiego systemu naprawy DNA – naprawa błędnie sparowanych nukleotydów – MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 – utrata drugiego prawidłowego allelu = w komórce somatycznej gromadzą się mutacje – mutacje w tej grupie genów: czynnik inicjujący w dziedzicznych zespołach predystynujących do nowotworzenia DNA repair Protein Repair pathways affected Cancers with increased risk gene/ disease ataxia ATM reduced HRR, SSA or NHEJ białaczka, chłoniak, piersi telangiectasia mutated Bloom BLM HRR białaczka, chłoniak, okrężnica, piersi, skóra, syndrome (helicase) płuca, przewód słuchowy, język, przełyk, żołądek, migdałki, krtań, macica breast cancer BRCA1 HRR of double strand breaks and piersi, jajnik 1&2 BRCA2 daughter strand gaps Fanconi FANCA HRR and TLS Białaczka, guzy wątroby, guzy lite na wielu anemia genes etc. obszarach MRE11A MRE11 HRR, NHEJ piersi TP53 P53 HRR, BER, NER, DDR for those mięsaki, raki piersi, guzy mózgu i raki kory pathways and for NHEJ and MMR nadnerczy WRN WRN HRR, NHEJ, long patch BER mięsak tkanek miękkich, jelita grubego, skóry, tarczycy, trzustki RECQL4 RECQ4 Helicase likely active in HRR rak podstawnokomórkowy, rak płaskonabłonkowy, rak śródnaskórkowy XPC, XPE XPC, XPE Global genomic NER, repairs rak skóry (czerniak i nieczerniak) (DDB2) damage in both transcribed and untranscribed DNA  Protoonkogeny 340 protoonkogenów zmapowanych w ludzkim genomie Prawidłowe geny regulujące cykl komórkowy (wzrost i różnicowanie, przesyłanie sygnałów wewnątrzkomórkowych Regulowane poprzez mechanizmy homeostazy: Supresory Hormony Cytokiny Zmiana (aktywacja) w onkogeny poprzez Nadekspresję (może wynikać z zaburzeń mechanizmów regulujących ekspresję lub mutacje) Mutacje punktowe, Zwielokrotnienie kopii genu, Translokacje Insercje, rekombinacje, delecje Infekcja retrowirusem (onkogeny homologiczne)  Onkogeny mutacje w protoonkogenach oznaczają: – Zmiana struktury białka – Nabycie funkcji przez kodowane białka – Nadekspresję kodowanych białek – Utrata funkcji regulacyjnych nowotworzenie jest powodowane poprzez mutację w jednym allelu (rzadko w obu)  Mutacje punktowe ras 10-20% raków, głównie trzustki, przewodów żółciowych, tarczycy, endometrium,jelita grubego, płuca, białaczek Brak w rakach piersi i szyjki macicy FTL-3, MLL, c-KIT, c-fms Ostre białaczki szpikowe  Aberracje chromosomowe w nowotworach Częsty wskaźnik złego rokowania (np. w białaczkach) Obecność (często specyficznych) aberracji strukturalnych i liczbowych w większości białaczek, chłoniaków złośliwych, guzów litych tkanek miękkich Aberracje pierwotne (specyficzne dla nowotworu) i wtórne (progresja nowotworowa) Translokacje są główną przyczyną aktywacji onkogenów w nowotworach układu krwiotwórczego Oporność na leki koreluje z mutacjami  Zwielokrotnienie kopii genu Produkt białkowy prawidłowy, nadmierna ilość N-myc – neuroblastoma L-myc – drobnokomórkowy rak płuca c-myb, c-myc – ostre białaczki erb-B2 – rak piersi CCND1 – rak piersi, rak płaskonabłonkowy Obserwuje się oporność na leki przeciwnowotworowe i gorsze rokowanie  Translokacje Przeniesienie w regiony promujące transkrypcję: promotory, wzmacniacze Powodują nadekspresję genu t(8;14)(q24.1;q32) – chłoniak Burkitta, stymulacja i nadekspresja c-myc (pierwotnie na chromosomie 8) przez sekwencję wzmacniającą transkrypcję dla genu ciężkich immunoglobulin IgH (na chromosomie 14) [Angi M, Kamath V, Yuvarani S, Meena J, Sitaram U, Manipadam MT, Nair S, Ganapule A, Fouzia NA, Abraham A, Viswabandya A, Poonkuzhali B, George B, Mathews V, Srivastava A, Srivastava VM. The t(8;14)(q24.1;q32) and its variant translocations: A study of 34 cases. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 2017 Sep;10(3):126-134. doi: 10.1016/j.hemonc.2017.03.002. Epub 2017 Mar 31. PMID: 28390216.]  Chromosom Philadelphia t(9;22)(q34;q11) Translokacja wzajemna protoonkogenu Abl z chromosomu 9 na 22 - powstanie chromosomu Philadelphia z genem fuzyjnym BCR-Abl powodującego przewlekłą białaczkę szpikową Stała produkcja nowego białka fuzyjnego BRC-Abl kinazy tyrozynowej Abl1 – podstawowe isoformy to p210 lub p185 (nazwa białka w zależności od kDa) wzrost częstotliwości podziałów komórkowych, blokowanie mechanizmów naprawy DNA (wzrost liczby mutacji), upośledzenie apoptozy, interakcji i adhezji do podścieliska 95% przewlekłych białaczek szpikowych (brak chromosomu Ph – przewlekła białaczka neutrofilowa)  [Asif M, Jamal MS, Khan AR, et al. A Novel Four-Way Complex Variant Translocation Involving Chromosome 46,XY,t(4;9;19;22)(q25:q34;p13.3;q11.2) in a Chronic Myeloid Leukemia Patient. Front Oncol. 2016;6:124. Published 2016 May 30. doi:10.3389/fonc.2016.00124] Fig. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for the detection of (9;22)(q34;q11). BCR– ABL translocation was detected in 91% of the 500 nuclei counted.  Onkoproteiny Nowe białko Długotrwała niekontrolowana synteza może też powodować, że komórki tracą kontrolę nad proliferacją Integracja wirusowego homologa onkogenu prowadząc do interferencji w syntezę białek lub w procesy regulacyjne komórki Czynniki transkrypcyjne np. EWS w guzie Ewinga Czynniki remodelujące chromatynę np. MLL w ostrych białaczkach Białka wiążące chromatynę (np. onkogeny c-fos, c-myc, c-myb) Czynniki wzrostu np. β-katenina w rodzinnej polipowatości gruczolakowatej Receptory czynników wzrostu np. EGFR, HER2/neu, KIT Czynniki przesyłania sygnału np. kinaza białkowa ABL w przewlekłej białaczce szpikowej Czynniki regulujące apoptozę np. BCL-2 w chłoniakach nieziarnicznych Receptory hormonów [Castel P, Rauen KA, McCormick F. The duality of human oncoproteins: drivers of cancer and congenital disorders. Nat Rev Cancer. 2020 Jul;20(7):383-397. doi: 10.1038/s41568- 020-0256-z. Epub 2020 Apr 27. PMID: 32341551.] Zespoły rodzinnych predyspozycji do nowotworów Rak dziedzicznie nie różnią się fenotypowo, klinicznie i histopatologicznie od postaci sporadycznej 5-10% dziedziczenie mendlowskie, głównie dominująco (wzór transmisji pionowej) Mutacja germinalna: pierwsza mutacja de novo w oocycie lub spermatocycie lub odziedziczona od rodzica Nowotwory rodzinne - nowotwory o niejednoznacznym torze dziedziczenia np. wielogenowa predyspozycja do rozwoju nowotworu Charakterystyczne cechy: niższa średnia wieku dla objawów, występowanie obustronne i/lub wieloogniskowe, mogą towarzyszyć inne nowotwory Zespoły rodzinnych predyspozycji do nowotworów rak piersi i jajnika: dziedziczenie dominujące – mutacja w genie BRCA1 lub BRCA2 dziedziczne raki jelita grubego nerwiakowłókniakowatość typu I czerniak rodzinny rzadko: – zespół Li – Fraumeni Rola BRCA1 i BRCA2 w onkogenezie Mechanizm działania BRCA1 i BRCA2 oba białka: – naprawa DNA – regulacja transkrypcji – kontrola cyklu komórkowego – utrzymanie integralności genomu naprawa dwuniciowych pęknięć DNA na drodze homologicznej rekombinacji Mechanizm działania BRCA1 i BRCA2  Mutacje w genach BRCA1 i BRCA2 predyspozycja do raka piersi / jajnika – cecha autosomalna dominująca z wysoką penetracją BRCA1 – wysokie prawdopodobieństwo raka piersi – 65% do 70 r.ż. – prawdopodobieństwo raka jajnika – 39% do 70 r.ż. BRCA2 – wysokie prawdopodobieństwo raka piersi – 45% do 70 r.ż. – niższe p. raka jajnika: 11% – nosiciele mutacji mają zwiększone prawdopodobieństwo zachorowania na: czerniaka (2,6x) raka prostaty (4,6x) rak trzustki (3,5x) pęcherzyka żółciowego / przewodów żółciowych (5x) żołądka (2,6x)  Mutacje w genach BRCA1 i BRCA2 typy mutacji: – najczęściej: utrata funkcji poprzez skrócenie białka – pewna liczba się powtarza: 185delAG / 5382insC (BRCA1) i 6174delT (BRCA2): Żydzi Aszkenazyjscy (efekt założyciela) 999del15 (BRCA2): Islandczycy (w/w efekt) 5382insC / 4135delA / C61G (BRCA1): Polska – wykrywanie: zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA + analiza sekwencji – rodziny ze znaczącym występowaniem raka jajnika / piersi – ryzyko: analiza komputerowa metody manualne (system Manchester)  Zapobieganie / wczesne wykrywanie nowotworów obecność mutacji predysponującej = znana: – identyfikacja zdrowych nosicieli możliwa uprzednie konsultacje obecność mutacji: bezpośrednia analiza DNA regularne badania profilaktyczne / kontrolne rak piersi – badania kontrolne: – samobadanie – badanie kliniczne piersi – mammografia – rezonans magnetyczny piersi nosicielki mutacji w BRCA1 / BRCA2 – badanie b. czułe rak jajnika: – pomiar stężenia CA125 (glikoproteinowy antygen) w surowicy – USG przezpochwowe  Zapobieganie / wczesne wykrywanie nowotworów obecność mutacji patogennej BRCA1 / BRCA2: – profilaktyczna, obustronna mastektomia redukcja ryzyka wyst. nowotworu o 90% – usunięcie jajników (z jajowodami) redukcja ryzyka o 80 – 96% redukcja ryzyka raka piersi – dodatkowo o 50% badania nad identyfikacją czynników ryzyka: – niższe ryzyko r. piersi: późna miesiączka, posiadanie dzieci, karmienie piersią – niższe ryzyko r. jajnika: doustna antykoncepcja  Rak jelita grubego w większości przypadków: – ważne czynniki środowiskowe 5 – 10% - czynniki genetyczne (dziedziczne): – HNPCC: hereditary non-polyposis colon cancer (zespół Lyncha) – FAP: familial adenomatous polyposis (rzadko: 1% przypadków) – MAP: MUTYH – associated polyposis związany z genem MUTYH (dziedziczenie aut. recesywne) łagodniejszy przebieg  Rak jelita grubego podejrzenie ryzyka wystąpienia dziedzicznego raka j. grubego: – liczne polipy (typowe dla FAP i MAP) – inny wieloogniskowy nowotwór – wywiad rodzinny dodatni dla raka j. grubego: lub pokrewnych: rak bł. śluzowej macicy w przypadku braku innych informacji o probandzie: – ryzyko zachorowania krewnego I-go st.: 1 / 17 1 / 10 gdy proband zachorował przed 45 r.ż. – gdy chorował krewny I-go i II-go st.: ryzyko 1 / 12 – gdy chorowało dwoje krewnych I-go st.: ryzyko 1 / 6  Dziedziczny niezwiązany z polipowatością rak jelita grubego HNPCC / zespół Lyncha – rodzinna agregacja raków jelita grubego i innych – powiązanych – nowotwory złośliwe j. grubego 80 – 90 % mężczyzn / 40 % kobiet przeważają guzy prawostronnie położone: 65 % – rak błony śluzowej macicy: 40 – 60 % kobiet z HNPCC – także lecz rzadziej możliwe guzy pierwotne: żołądka, trzustki, jajników, nerek, mózgu  Dziedziczny niezwiązany z polipowatością rak jelita grubego wbrew nazwie: polipy mogą być obecne: – rzadziej: do 50 w porównaniu do 100 i więcej przy FAP występowanie: niestabilność sekwencji mikrosatelitarnych: – wykrywana zmiana długości mikrosatelit w DNA guza w stosunku do DNA z krwi obwodowej 90 % przypadków w porównaniu do 15 % nowotworów sporadycznych – prowadzi do zaburzeń procesu replikacji DNA także: utrata białek związanych z naprawą DNA  Dziedziczny niezwiązany z polipowatością rak jelita grubego mutacje związane z HNPCC: – MSH2 – 60 % – MLH1 – 30 % – rzadko: MSH6 i PMS2 produkty: białka kompleksów uruchamiających proces eliminacji błędnie sparowanych nukleotydów w replikacji DNA – brak: niestabilność mikrosatelitarna mutacje heterozygotyczne – dziedziczenie autsomalne dominujące z niepełną penetracją  Dziedziczny niezwiązany z polipowatością rak jelita grubego Rodzinna polipowatość gruczolakowata jelit FAP (Familial adenomatous polyposis) / zespół Gardnera dziedziczenie: autosomalne dominujące objawy charakterystyczne (od wcz. dzieciństwa): – polipy jelitowe (okrężnica !) w liczbie 100 > – wrodzony przerost nabłonka barwnikowego siatkówki (CHRPE) polipy = gruczolaki – nieleczone = transformacja nowotworowa – u niemal 100% chorych przed 40 r.ż. – także: zwiększone ryzyko nowotworu złośliwego górnych odcinków przewodu pokarmowego Rodzinna polipowatość gruczolakowata jelit mutacje w genie supresorowym APC – białko APC: regulacja stężenia β-kateniny (kofaktor transkrypcji) zapobiega nadmiernej akumulacji kofaktora razem z AXIN / GSK3 fosforylacja / ubikwitynizacja / degradacja w proteosomie – mutacje zlokalizowane na 3’ końcu genu – prowadzą zazwyczaj do skrócenia białka (np. delecja AAAGA w kodonie 1309) Rodzinna polipowatość gruczolakowata jelit  Polipowatość związana z mutacją MUTYH fenotyp podobny do FAP: – 15 – 200 polipów w jelicie grubym dziedziczenie: autosomalne recesywne gen MUTYH (dawniej: MYH) koduje enzym – glikozylazę – białko to bierze udział w procesie naprawy DNA – uszkodzenia są związane z oksydacją poszczególnych zasad w łańcuchu – zwłaszcza par A – oxoG – naprawa poprzez wycięcie uszkodzonej zasady  Nerwiakowłókniakowatość typu I Dziedziczenie autosomalne dominujące, pełna penetracja, zmienna ekspresja, 50% mutacje de novo, homozygoty letalne gen NF1 (chromosom 17): – produkt: neurofibromina – białko supresorowe w komórkach głównie OUN i obwodowym UN, reguluje procesy podziału, reguluje działanie protoonkogenu p21ras, – Guzy czaszkowe i inne – Nerwiakowłókniaki (guzki podskórne zbudowane z elementów nerwów obwodowych oraz fibroblastów) – wytworzenie tzw. plam cafe-au-lait – zmiany barwnikowe tęczówki (guzki Lischa), zmiany kostne poprzez zwiększoną aktywność RAS prowadzi do braku uniknięcia różnicowania przez komórki oraz stały wzrost (np. komórek Schwanna) Nerwiakowłókniakowatość typu I  Czerniak rodzinny czerniak złośliwy – jeden z najczęstszych nowotworów złośliwych – ryzyko wzrasta dwukrotnie: gdy krewny I-go st. chory – ryzyko wzrasta 6,5 – krotnie: gdy w/w krewny miał