Podstawy Genetyki PDF

Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Część teoretyczna U wszystkich organizmów żywych, zdolnych do przekazywania swoich cech następnym pokoleniom, a więc wykazujących cechę dziedziczności, materiałem genetycznym jest DNA. W kolejności zasa...

Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Część teoretyczna U wszystkich organizmów żywych, zdolnych do przekazywania swoich cech następnym pokoleniom, a więc wykazujących cechę dziedziczności, materiałem genetycznym jest DNA. W kolejności zasad purynowych i pirymidynowych wchodzących w skład łańcuchów DNA zapisana jest pierwszorzędowa struktura białek - czyli sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Fragment polinukleotydowy kodujący pojedynczy łańcuch polipeptydowy, nazywany cistronem, a jego obrębie wyróżnia się kodony, (czyli trzy kolejne zasady tzw. triplety) odpowiadające poszczególnym aminokwasom. Niektóre aminokwasy są kodowane przez dwa, trzy, a nawet cztery różne triplety. Stąd mówi się o degeneracyjnym charakterze kodu genetycznego. Całość informacji genetycznej zapisanej w pierwszorzędowej strukturze DNA stanowi o tzw. genotypie, a ten z kolei determinuje fenotyp, czyli zespół jej cech, jakie możemy obserwować w danych warunkach. Kod genetyczny jest odczytywany jednokierunkowo, co trzy litery (3 zasady). Charakter kodu genetycznego i sposób jego odczytu stanowi postawę tłumaczenia istoty mutacji, czyli nagle i spontanicznie pojawiających się zmian genotypu przekazywanych komórkom potomnym. Mutacje punktowe polegają na zmianie zasad w kodonach albo też na wypadaniu (delecji) większych lub mniejszych fragmentów materiału genetycznego. Zmiany w kodowanie mogą być typu tranzycji (jedna para puryna - pirymidyna zostanie zastąpiona parą puryna - pirymidyna), transwersji (para puryna - pirymidyna zostaje zastąpiona parą pirymidyna - puryna), inercji lub delecji ( wstawienie lub wypadnięcie jednej pary zasad). Skutki genetyczne tego typu zmian są różne. Tranzycja i transwersja powodują zmianę w kodonie, co prowadzi do tego, że w łańcuchu polipeptydowym jeden z aminokwasów zostaje zamieniony na inny. Mogą też powstawać triplety nonsensowne (niekodujące żadnego aminokwasu), co prowadzi do skrócenia łańcucha polipeptydowego. Każda zmiana w obrębie kodu genetycznego prowadzi w rezultacie do błędnego jego odczytania i w łańcuchu polipeptydowym pojawiają się inne aminokwasy. W zależności od miejsca tej zmiany i od rodzaju białka następują różne konsekwencje dla komórki np. od osłabienia aktywności danego enzymu aż mojego utratę - a zatem zanik możliwości prowadzenia jakiejś przemiany metabolicznej. 2  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Większość mutacji ma charakter zmian odwracalnych. Mutanty mogą rewertować do formy wyjściowej, przy czym szansa rewersji jest tego samego rzędu, co szansa mutacji i w przypadku mutacji spontanicznych waha się granicach od 1x106 do 1x109 na komórkę w danej generacji. Drobnoustroje stanowią dogodny obiekt przy otrzymywaniu różnych mutantów ze względu na łatwość, z jaką można otrzymać dużą populację komórek, stosunkowo proste metody selekcji i fakt, że bakterie są organizmami haploidalnymi, stąd wszystkie mutacje, nawet recesywne uwidaczniają się w fenotypie. Najłatwiej jest otrzymać mutanty oporne na antybiotyki lub bakteriofagi. Selekcja ich polega na wysiewie odpowiednio dużej populacji na podłoże z czynnikiem, na którego działanie chcemy otrzymać formy oporne. W tych warunkach komórki wrażliwe, stanowiące ogromna większość populacji, giną, a zdolność tworzenia kolonii mają pozostałe przy życiu nieliczne oporne mutanty. Przy otrzymywaniu mutantów opornych na antybiotyki niezbędne jest uwzględnieni specyfiki rozwoju oporności. Na niektóre antybiotyki, np. penicylinę, oporność rozwija się poprzez szereg kolejnych stopni mutacyjnych, z których każdy daje mutanty oporne na coraz wyższe stężenie. Na inne antybiotyki, np. streptomycynę, formy wysoko oporne powstają w wyniku jednostopniowej mutacji. Stąd wyróżnia się w rozwoju oporności na leki model penicylinowy i model streptomycynowy. Według pierwszego powstają formy oporne na penicylinę u Staphylococcus aureus; według drugiego oporność na streptomycynę u pałeczek Enterobacteriacea. Bardzo ważna rolę w badaniach genetycznych odgrywają mutanty żywieniowe. Znaczna część drobnoustrojów może syntetyzować wszystkie związki organiczne (potrzebne im do życia) z soli mineralnych i glukozy (mogą rosnąć na podłożach minimalnych, w których jedynym związkiem organicznym jest glukoza). W hodowli takich prototroficznych organizmów występują nieliczne mutanty auksotroficzne, pozbawione zdolności syntezy jednego z elementów budulcowych np. aminokwasu i wymagające jego obecności w podłożu. Mutanty auksotroficzne najłatwiej izoluje się za pomocą metody penicylinowej (wykorzystuje fakt, że penicylina działa jedynie na bakterie rosnące). Na podłożu minimalnym wrażliwe są na nią jedynie prototrofy, a mutanty auksotroficzne przeżywają, gdyż nie dzielą się. Mutacje dotyczą nie tylko genów wchodzących w skład nukleoidu. Mutować mogą również cytoplazmatyczne determinanty - episomy lub plazmidy. Plazmidy to 3  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza pozachromosomalne elementy genetyczne komórek prokariotycznych, zdolne do niezależnej od chromosomu replikacji i przekazywania swoich genów innym komórkom. Przykładem mutacji w cytoplazmatycznym DNA jest mutacja prowadząca do utraty zdolności oddychania tlenowego u drożdży. Czynniki pozachromosomalne, dzięki swym właściwościom mogą powodować rozprzestrzenianie się w środowisku wielu cech np. oporności na metale ciężkie, leki, różne substancje toksyczne (ksylen, toluen, naftalen). Istnieją także tzw. plazmidy degradatywne (np. u bakterii z rodzaju Pseudomonas), które warunkują degradacje struktur aromatycznych. U bakterii z rodziny Enterobacteriaceae występują plazmidy kolicynogenne, warunkujące produkcję antybakteryjnych białek, zwanych kolicynami. Episomy to plazmidy bakteryjne zdolne do integracji z chromosomem bakterii na skutek istnienia homologii między DNA plazmidu i DNA komórki bakteryjnej. Integracja ta ma dwie cechy: a) episom replikuje się tylko wówczas, gdy replikuje się chromosom; b) plazmid jest episomom dla jednego gatunku bakterii, dla innych jest plazmidem. Plazmidy, początkowo zidentyfikowane u Enterobacteriaceae, wykrywane następnie w prawie każdej grupie systematycznej organizmów, w której ich poszukiwano, nie wyłączając przedstawicieli Archaebacteria oraz jedno i wielokomórkowych organizmów eukariotycznych. Wspólną cechą tych dodatkowych struktur DNA w komórce i związanych z nimi funkcji jest fakt, że - stale występują w komórce, - i są przekazywane na komórki potomne, ale nie są jednak w normalnych warunkach niezbędne dla życia komórki, może się ona ich pozbyć nie tracąc niczego ze swojej żywotności. Plazmidy - to dwuniciowe koliste cząsteczki DNA występujące w cytoplaźmie komórek bakterii zwykle w postaci superskręconej (CCC), jedyny wyjątek stanowi czynnik genetyczny (ang. - killer - plazmid) występujący u drożdży w postaci dwuniciowej cząsteczki RNA. DNA plazmidowe może występować w czterech podstawowych konfiguracjach. Cechują się one różną szybkością migracji w żelu podczas elektroforezy (Rys. 2.1). 4  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Rysunek 2.1: Schemat przedstawiający formy konfiguracyjne plazmidowego DNA. 1 - Superspiralnie zwinięta kowalencyjnie zamknięta kolista cząsteczka DNA (ang. covalently cIosed circular DNA - CCC DNA); 2 - Kowalencyjnie zamknięta kolista cząsteczka DNA (ang. CCC-relaxed); 3 - Otwarto-kolista cząsteczka DNA (ang. open circular DNA - OC DNA); 4 - Liniowa cząsteczka DNA (ang. linear DNA); W drugiej części rysunku przedstawiono ścieżkę w 1 % żelu agarozowym, widoczne są trzy prążki powstałe po rozdziale elektroforetycznym plazmidowego DNA. Formy DNA występujące w poszczególnych prążkach przedstawiono schematycznie obok. Strzałką oznaczono kierunek migracji w żelu. Wielkość plazmidów waha się w szerokich granicach od około 8x10 3 do 9x104 par nukleotydów. Są to cząsteczki DNA ok 100 razy mniejsze od chromosomu bakteryjnego (plazmid stanowi od 1 % do 5% długości właściwego genoforu). Plazmidy mogą się replikować niezależnie od chromosomu bakteryjnego i stanowią odrębne replikony z własnym obszarem początku replikacji (rep). Plazmid jest tworem autonomicznym, replikuje się niezależnie od replikacji genoforu, ale w pewnym stopniu jest poddany jego kontroli. Toteż liczba plazmidów w komórce bakterii jest utrzymywana na stałym poziomie, przy czym najczęściej jest ich nie więcej niż kilka na jeden genofor. W jednej komórce mogą czasem współwystępować różne rodzaje plazmidów lub mogą się wykluczać. Plazmidy można podzielić na grupy niezgodności. Grupa niezgodności składa się z plazmidów, które nie są zdolne do wspólnego utrzymywania się w tej samej linii komórkowej. Gdy dwa plazmidy należące do tej samej grupy niezgodności są obecne w jednej komórce tylko jeden z nich będzie stabilnie dziedziczony. Plazmidy należące do tej samej grupy niezgodności są zazwyczaj blisko spokrewnione i wykazują co najmniej częściową homologię DNA. W zjawisku niezgodności plazmidowej najważniejszą rolę odgrywa regulacja replikacji. Jeśli system molekularny kontrolujący replikację rozpoznaje dwa plazmidy jako identyczne, 5  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza plazmidy te są niezgodne. W przypadku plazmidów występujących w 1-2 kopiach na komórkę a mechanizm jest następujący: po jednej rundzie replikacyjnej plazmidu system regulacyjny uniemożliwia zapoczątkowanie następnej rundy replikacyjnej, póki nie nastąpi podział komórkowy. Dlatego jedna z komórek potomnych może odziedziczyć tylko jeden z dwu rodzajów plazmidów (Rys. 2.2). W tej sytuacji drugi plazmid zostaje wyeliminowany z linii komórkowej bardzo szybko. Drugim systemem odgrywającym rolę w zjawisku niezgodności jest system regulujący dokładne rozdzielenie plazmidów do komórek potomnych. Gdy dwa plazmidy są rozpoznawane jako identyczne, tylko jeden z nich będzie dokładnie rozdzielony pomiędzy komórki potomne, a rozdzieleniem drugiego będzie rządził przypadek. Po odpowiedniej liczbie podziałów, końcowym efektem jest tu również utrata jednego z plazmidów. Rysunek 2.2: Eliminacja jednego z dwu plazmidów należących do tej samej grupy niezgodności i występujących w liczbie około jednego egzemplarza na komórkę. Regulacja replikacji plazmidowego DNA zachodzi na etapie inicjacji: zmieniona szybkość replikacji jest wynikiem zmienionej częstotliwości inicjacji, natomiast elongacja zachodzi ze stałą szybkością. Replikacja rozpoczyna się w zdefiniowanym miejscu ori i przebiega jednokierunkowo. Do inicjacji replikacji niezbędne jest białko RepA1 kodowane przez plazmidowy gen repA1 znajdujący się w pobliżu ori (w plazmidzie ColE1). 6  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Funkcje związane z regulacją replikacji determinowane są zwykle przez blisko siebie położone miejsca DNA, tworzące region replikacyjny (rep), co zmniejsza szansę ich rozdzielenia w czasie rekombinacji. Ilość kopii plazmidów w komórce bakteryjnej może być różna i zależy między innymi od procesów regulujących replikację plazmidów. Na podstawie kontroli namnażania plazmidów możemy podzielić je na dwie grupy: -ścisłej (stringent) kontroli namnażania - są to plazmidy duże, ich ciężar cząsteczkowy przekracza 3x107 daltonów, zwykle w komórce występują w ilościach od 1 do 3 kopii; -rozluźnionej (relaxed) kontroli namnażania - są mniejsze od wyżej wymienionych, ich ciężar cząsteczkowy nie przekracza 7x106 daltonów, a ilość od 10 do 100 kopii w. komórce. Ze względu na wymiary i różną gęstość DNA (wynikającą z różnego stosunku par zasad GC i AT), DNA plazmidowy można łatwo wydzielać z komórek przy pomocy wirowania. Plazmidy, w odróżnieniu od chromosomu bakteryjnego, nie są składnikami koniecznymi do normalnego funkcjonowania komórki, chociaż mogą zawierać geny warunkujące istotne właściwości. 7  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Poniższa tabela podaje niektóre właściwości naturalnie występujących plazmidów (cytowana przez K. Tajlora i A. Podhajską w pracy zbiorowej pt. "Biologia molekularna - informacja genetyczna" PWN W-wa 1989). W DNA niektórych plazmidów występuje obszar transferowy (tra) zawierający kilka różnych genów warunkujących zdolność komórek do wytwarzania fimbrii i koniugowania z komórkami innego typu. Geny tra umożliwiają przenoszenie plazmidów do komórek biorców. Ze względu na sposób (drogę) przenoszenia plazmidów dzielimy je na dwie grupy: - plazmidy infekcyjne (zakaźne), które mogą same przechodzić z jednej komórki na drugą (posiadające geny tra) nadający jej charakter dawcy i umożliwiający syntezę pilii płciowych. Posiadanie tych pilii jest niezbędnym warunkiem koniugacji; - plazmidy nieinfekcyjne, korzystające w przechodzeniu na inne bakterie z pośrednictwa fagów transdukujących lub innych plazmidów infekcyjnych (plazmidy nieinfekcyjne u gronkowców). Plazmidy R - to plazmidy wielorakiej oporności na antybiotyki i sulfamidy określające oporność na różne antybiotyki, często niepokrewne - przenoszone są, podobnie jak plazmid F, na drodze koniugacji (plazmidy infekcyjne). Plazmidy R mają zdolność do dysocjacji na segmenty zawierające geny dla funkcji transferowych, tzw. czynnik RTF (ang. resistance 8  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza transfer factor) oraz geny oporności na czynniki antybakteryjne (ang. R-determinant) (Rys. 2.3). Rysunek 2.3: Schemat organizacji genetycznej plazmidów R. Strzałki wskazują kierunek dysocjacji i kointegracji plazmidu. R - geny oporności na czynniki antybakteryjne (ang. R- determinant). RTF - geny odpowiedzialne za replikację i przekazywanie plazmidu (ang. resistance transfer factor - RTF). Sekwencje insercyjne oznaczono symbolem IS. Zdolność do dysocjacji i ko-integracji plazmidów leży u podstawy niezwykłych możliwości adaptacyjnych drobnoustrojów. Dlatego plazmidy R przyczyniły się do wyselekcjonowania szczepów bakteryjnych opornych na różne antybiotyki. Plazmidy F i R wykazują pewne podobieństwo, ale i wyraźne różnice. Różnice dotyczą przede wszystkim przenoszenia markerów chromosomalnych, która to właściwość jest słabiej zaznaczona u bakterii R+ (z plazmidem R) niż u bakterii z plazmidem płodności F. Wprowadzenie niektórych plazmidów R do komórek noszących plazmid F powoduje spadek płodności koniugacyjnej uwarunkowanej obecnością czynnika F. Spadek zaznaczył się w: 1) częstości przekazywania plazmidu F 2) i częstości przekazywania markerów chromosomalnych. Towarzyszył temu zanik syntezy pilii płciowych, uwarunkowanych obecnością plazmidu F. Czynniki R działające inhibicyjnie na wyżej wymieniony spadek płodności koniugacyjnej nazwano R fi+ (od fertility inhibition), natomiast czynniki R nie działające inhibicyjnie na płodność uwarunkowaną czynnikiem F - R fi-, Działanie inhibicyjne czynników R fi+ wiąże się z cytoplazmatycznym represorem (wytwarzanym przez komórki posiadające ten czynnik) i działającym na plazmid F. 9  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Komórki posiadające plazmid R wytwarzają pilie płciowe, ale tylko w czasie 3-6 generacji. W tym okresie komórki te mogą przekazywać plazmid R z dużą częstością; stają się jego efektywnymi dawcami, tworzą system HFRT (high frequency resistance transfer). Natomiast w ustabilizowanych hodowlach z plazmidem R - tylko niewielka frakcja komórek wykazuje obecność pilii, a jednocześnie zdolna jest przekazywać plazmid R na drodze koniugacji. W odróżnieniu od plazmidu F - czynniki R - posiadają oprócz - genów kodujących białka pilii płciowych także - gen regulatorowy odpowiedzialny za syntezę represora pilii płciowych. W przypadku czynników R fi+ represor ten działa inhibicyjnie na syntezę: 1)własnych fimbrii (typu R) 2)i fimbrii typu F. Czynniki R fi- również zawierają gen kodujący represor syntezy, ale tylko własnych fimbrii (typu R), represor nie wpływa natomiast na syntezę fimbrii typu F. Pierwsze wykryte plazmidy R nosiły determinanty oporności na streptomycynę (Sm), tetracykliny (Te), chloramfenikolu (Cm) i sulfonamidy (Su). Obecnie znane są szczepy oporne na praktycznie wszystkie stosowane w terapii antybiotyki. Mechanizm oporności uwarunkowanej plazmidem R jest w większości przypadków natury enzymatycznej; determinanty R kodują syntezę enzymów inaktywujących antybiotyki - penicylinazy, acetylazy chloramfenikolu. Jedynie oporność na tetracykliny jest oparta raczej na zmianach w przepuszczalności ściany komórkowej bakterii R+. Komórki mogą tracić plazmidy spontanicznie lub pod wpływem działania różnych czynników np.: oranżu akrydynowego, bromku etydyny, fioletu krystalicznego, rifampicyny, substancji powierzchniowo czynnych, różnych mutagenów. Bardziej oporne na działanie w/w związków są plazmidy R niż plazmidy płodności F. PLAZMIDY NIEINFEKCYJNE U GRONKOWCÓW Gronkowce są jedynymi z ziarniaków chorobotwórczych, które w odpowiedzi na wprowadzenie terapii penicylinowej wytworzyły mechanizm oporności, polegający na produkcji penicylinazy, enzymu rozkładającego wiązanie p-Iaktamowe penicyliny, co prowadzi do inaktywacji antybiotyku. W próbach wyjaśnienia genetycznego podłoża oporności na penicylinę u gronkowców pierwszą przesłankę stanowiły obserwacje, z których wynikało, że mogą one tracić nieodwracalnie zdolność wytwarzania penicylinazy ze 10  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza stosunkowo dużą częstością, rzędu 1 na 103 komórek. Jednocześnie gronkowce traciły sprzężony z genem penicylinazowym gen oporności na rtęć i gen oporności na erytromycynę. Ta powtarzająca się delecja grupy sprzężonych genów nasunęła przypuszczenie, że muszą się one znajdować na pozachromosomalnym materiale genetycznym. Przemawia za tym również duża częstość tej delecji, w niektórych szczepach rzędu 10-1 na generację. Plazmid penicylinazowy i sprzężone a nim determinanty oporności na rtęć i erytromycynę nie są przekazywane na drodze koniugacji. Mogą jednak przejść z jednych szczepów bakteryjnych na inne przy pomocy fagów transdukujących. KOLICYNOGENIA - czynniki Col (plazmidy Col) Szereg gatunków bakterii wytwarza substancje antybiotyczne o charakterze białkowym i stosunkowo wąskim spektrum działania. Substancje te nazwano bakteriocynami. Najwcześniej , a zarazem najdokładniej zbadano wytwarzane przez pałeczki jelitowe E. coli bakteriocyny, znane pod nazwą kolicyn. Ich wytwarzanie jest uwarunkowane obecnością w komórce determinantów genetycznych, zwanych czynnikami (plazmidami) kolicynogennymi, przekazywanych z generacji na generację na komórki potomne. Pod względem budowy chemicznej czynniki Col są cząsteczkami DNA o strukturze kolistej i masie cząsteczkowej od 4x106 do 6x106 daltonów. ich wielkość dochodzi w przeliczeniu do 1/100 chromosomu bakteryjnego. Poszczególne kolicyny różnią się: -zakresem działania antybakteryjnego -i rodzajem procesów biosyntezy bakteryjnej, których funkcjonowanie hamują. Zakres działania, czyli tzw. spektrum aktywności zależy od swoistych dla określonych kolicyn receptorów na ścianie komórkowej. Receptory te są w zasadzie odmienne dla każdej kolicyny. Wyjątkiem są bakterie nabywające czynnik Col; są one oporne na działanie kolicyny, którą zaczynają wytwarzać, mimo zachowania receptorów w ścianie komórkowej. Mechanizm działania zależy od kolicyny (poszczególne kolicyny oznaczono kolejnymi literami alfabetu: A, B, C, D itd.. Tak na przykład: -kolicyna E2 działa degradująco na DNA komórki bakteryjnej, -kolicyny K oraz J powodują zaburzenia w oksydacyjnej fosforylacji, -kolicyna D jest inhibitorem syntezy białek, podobnie jak wielkocząsteczkowa kolicyna R, wytwarzane przez Pseudomonas aeruginosa. 11  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Determinanty genetyczne kolicynogenii mają w większości przypadków charakter plazmidów. Część z nich np. czynniki Col J, Col V czy ColB są to plazmidy infekcyjne, przekazujące się ze szczepów kolicynogennych na niekolicynogenne w wyniku bezpośredniego kontaktu, czyli na drodze koniugacji. Col V i ColB należą do plazmidów F -podobnych. Czynniki Col E reprezentują plazmidy nieinfekcyjne i na drodze koniugacji mogą się przekazywać tylko wraz z innymi plazmidami np. czynnikiem Col J. Plazmidy Col zarówno infekcyjne, jak i nieinfekcyjne mogą być transdukowane fagami łagodnymi P22 i Pl. KOLICYNOGENIA jest stałą cechą bakterii. Próby eliminacji czynników Col np. metodą "leczenia" akryflawiną nie zawsze się udają. Zwykle niewielka tylko frakcja komórek w hodowli szczepu kolicynogennego wytwarza kolicynę. Wytwarzanie kolicyn można indukować, naświetlając hodowlę szczepu kolicynogennego promieniami UV lub działając mitomycyną. Kolicyną indukującą się jest kolicyna B, nie indukującą się - kolicyna V. Plazmidy Col mogą rekombinować z innymi plazmidami, tworząc plazmidy zintegrowane. Uzyskano rekombinanty plazmidów F i Col, jak też rekombinanty plazmidów Col i plazmidów R. Rekombinowane plazmidy przekazywane są łącznie na drodze koniugacji i ulegają łącznej eliminacji. Do bardziej znanych bakteriocyn należy nizyna - antybiotyk o budowie polipeptydowej, wytwarzana przez szereg szczepów Streptococcus lactis (Lactococcus), hamuje ona wzrost wielu bakterii G+ (m.in. Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus cremoris, Corynebacterium). Wiele pałeczek mlekowych wytwarza bakteriocyny; Lactobacillus acidophilus - laktocydynę, acydolinę i acydofilinę; Lactobacillus brevis - laktolinę i laktobrewinę Lactobacillus bulgaricus - bulgaricom. Bakteriocyny w/w hamują wzrost innych gatunków Lactobacillus, Lactococcus lactis, Streptococcus faecalis, Bacillus (różne gatunki), Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Proteus, Escherichia i Clostridium. 12  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Koniugacja bakterii to czasowe połączenie dwóch komórek podczas którego może dojść do ograniczonej wymiany i rekombinacji materiału genetycznego. Łączące się w pary komórki nie są równocenne. Okazało się, że bakterie mogą występować w dwóch typach "płciowych" - określone jako DAWCY i BIORCY. Genetyczną determinantą płci jest episom zwany czynnikiem F (fertility = płodność) lub plazmidem F. Jego obecność w komórce nadaje bakterii charakter dawcy. Obrazuje to rysunek 1.1. A B C Rysunek 1.1: Typy "płciowe" u bakterii. a)- komórka F+ zawierająca genofor (g) i czynnik płciowy (F): czynnik może włączyć się do genoforu w jednym z wielu dostępnych miejsc, tworząc różne typy Hfr; b)- komórka Hfr z czynnikiem F włączonym w genofor; c)ponowne powstanie z Hfr komórki F+; czynnik F odłącza się od genoforu zabierając wraz ze sobą fragment DNA genoforu, ale tylko w jednym, ściśle określonym miejscu: w danym przypadku w miejscu przylegającym do położenia markerów a i b na genoforze. Plazmid F może w komórce występować w dwóch stanach: - autonomicznym w cytoplaźmie - komórki takie określa się symbolem F+ - zintegrowanym (włączonym do chromosomu bakteryjnego) - komórki takie noszą nazwę Hfr (high frequency of recombination = wysoka częstość rekombinacji). Czynnik F może przechodzić ze stanu autonomicznego do zintegrowanego z chromosomem i odwrotnie z częstością około 10-4 na generację komórek (F+ →Hfr). 13  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Przechodząc ze stanu zintegrowanego w autonomiczny, czynnik F może porwać ze sobą sąsiadujący fragment chromosomu. Powstają w ten sposób tzw. czynniki F' zdolne do przekazywania pewnych markerów chromosomalnych. Plazmid F jest podwójną helisą DNA występująca w cytoplaźmie, długości około 30 um (masa cząsteczkowa 6,3 x 106 Da), zamkniętą kolisto i wewnątrz komórki związaną z błoną cytoplazmatyczną. Replikuje się niezależnie i niekoniecznie synchronicznie z genoforem (chromosomem) bakterii. Podlega jednak jakiejś kontroli pośredniej ze strony komórki bakteryjnej. W komórce Escherichia coli jest jeden do dwóch plazmidów F na jeden genofor bakteryjny. Plazmid F koduje pewną ilość informacji genetycznej. Dotyczy ona przede wszystkim syntezy i tworzenia fimbrii (pilli) płciowych, regulacji i inicjacji własnej replikacji oraz dwóch dodatkowych cech bakterii, zależnych od obecności tego plazmidu. Jedną z nich jest represja innych plazmidów F lub podobnych plazmidów. W komórce zawierającej plazmid F wytwarzany jest represor, nie dopuszczający do wniknięcia lub replikacji innych plazmidów. Cechę tą nazywamy niezgodnością. 14  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Drugą cechą jest zdolność bakterii F+ , Hfr i F' do koniugowania z komórkami F. Struktura genetyczna plazmidu jest dokładnie poznana. Jego mapa genetyczna pokazana jest poniżej na rysunku 1.2 Rysunek 1.2: Mapa genetyczna czynnika F (uproszczona). IS-2, IS-3 - sekwencje insercyjne; lex - gen warunkujący oporność na fagi żeńskie; inc - gen warunkujący niezgodność plazmidów; rep - region rozpoczynania replikacji; ori T - miejsce początkowe przy przenoszeniu plazmidu w czasie koniugacji; tra - zespół genów, warunkujących zdolność do koniugacji, między innymi geny kodujące białko fimbrii (pilinę) i budowę fimbrii płciowych. Integracja plazmidu F w chromosom bakteryjny zachodzi dzięki rekombinacji nieuprawnionej tj. zachodzącej pomiędzy helisami DNA nie wykazującymi ogólnej 15  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza homologii. Uwarunkowana jest ona występowaniem w rekombinujących strukturach specjalnych, dość długich, homologicznych (do 1400 par nukleotydów) sekwencji, nazwanych sekwencjami insercyjnymi (IS). Obrazuje to rysunek 1.3. Rysunek 1.3: Rekombinacja nieuprawniona. Integracja plazmidu F z genoforem bakterii (g); IS - sekwencje insercyjne. DNA plazmidu F i genoforu są, poza IS, niehomologiczne. W przebiegu krzyżowania bakterii należy odróżnić 2 etapy: - koniugację - i rekombinację. 16  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Rodzaj przenoszonego materiału genetycznego, a w konsekwencji i wynik krzyżowania bakterii, zależy od stanu w jakim plazmid F egzystuje w komórce. Rysunek 1.4:Schemat krzyżowania w koniugacji bakteryjnej. ABCD oznacz odcinek genoforu, w obrębie którego zachodzi rekombinacja A, B, C, D są to wyznaczniki genetyczne, określające zdolność (+) lub niezdolność (-) do syntezy jakiegoś czynnika wzrostowego. Str to wyznacznik, określający wrażliwości (s) lub oporność (r) bakterii na streptomycynę. 17  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Dawcy F+ podczas kontaktu z biorcami przekazują (jednokierunkowo) tylko autonomiczny plazmid F zmieniając płeć biorców na F+ w ciągu jednej godziny kontaktu. Powstające komórki nazywane są koniugantami. Niekiedy z częstością niższą niż 10 -4 na generację komórek pojawiają się rekombinanty. Tworzą się one tylko w wyniku kontaktu biorców z nielicznymi komórkami Hfr obecnymi w populacji F+. W krzyżówkach dawców Hfr z komórkami biorców F- jest przekazywany chromosom bakteryjny, a w konsekwencji z dużą częstością powstają rekombinanty. W czasie kontaktu dawcy F' z komórkami biorców F- przekazywany jest plazmid F' łącznie z genami chromosomalnymi, w efekcie powstające komórki zmieniają "płeć", ale jednocześnie zapoczątkowują klony bakterii, częściowo diploidalne (merozygoty), bowiem allele przekazywane przez czynnik F' mają jednocześnie swój odpowiednik w chromosomie biorcy. Zjawisko to nosi nazwę seksdukcji. Przekazywanie chromosomu podczas koniugacji przedstawia rysunek 1.5. Rysunek 1.5: Schemat koniugacji pomiędzy komórką Hfr () i F (). Genofor komórki Hfr zaznaczono linią ciągłą, komórki F - linią przerywaną, a czynnika F - linią zygzakowatą; a - zbliżenie komórek; b - skuteczny kontakt i wytworzenie mostka między komórkami; c - przekazanie części (lub niekiedy całości) genoforu z Hfr do F- ; d - przerywanie kontaktu; e - rekombinacja w komórce F- między jej własnym genoforem i nicią DNA, przekazaną przez Hfr. Po skontaktowaniu bakterii następuje z dużą częstością pęknięcie chromosomu dawcy w miejscu włączenia plazmidu F. 18  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Następnie chromosom przechodzi do. komórki biorcy w postaci liniowej, przy czym funkcjonalna część plazmidu F stanowi jego ostatni marker. Jako pierwszy wnika zawsze koniec przeciwległy do plazmidu F zwany O (origin = początek) lub leading locus (miejsce prowadzące). Następne markery (geny) wchodzą do komórki biorcy w kolejności odpowiadającej ich ułożeniu na chromosomie. Szybkość przekazywania chromosomu ściśle zależy od temperatury. W 37°C przekazanie całego chromosomu łącznie z plazmidem F trwa około 100 minut. Przeważnie jednak. chromosom podczas koniugacji ulega z przypadkowych przyczyn rozerwaniu i końcowe markery (dystalne) nie dostają się do komórki biorcy. Wniknięcie określonego markera Hfr do biorcy nie jest równoznaczne z jego ujawnieniem w potomstwie w postaci rekombinantów. Wbudowanie markera do chromosomu rekombinanta zależy od tego, w jaki sposób przebiega rekombinacja pomiędzy homologicznymi odcinkami chromosomów rodzicielskich. Selekcja określonych typów rekombinantów jest wykorzystywana do mapowania chromosomu bakteryjnego. Odległość pomiędzy markerami można tu określić tak jak u innych organizmów, w procentach rekombinantów, lub - co jest możliwe tylko u bakterii - w jednostkach czasu (minutach). Częstość pojawiania się w potomstwie krzyżówki rekombinantów dziedziczących poszczególne markery rodzicielskie Hfr obniża się w miarę oddalania się markerów od punktu O na chromosomie dawcy. Przez uporządkowanie rekombinantów według wielkości malejących otrzymuje się więc kolejność ułożenia markerów na chromosomie szczepu Hfr. Spadek częstości pojawiania się poszczególnych typów rekombinantów wynika z faktu, że markery nie dostają się do komórek biorców na skutek przerwania chromosomu, nie mogą rekombinować i ujawniać się w potomstwie. Ponieważ przekazywanie chromosomu w stałej temperaturze, odbywa się ze stałą szybkością, czas upływający pomiędzy przejściem kolejnych markerów do "zygoty" jest wprost proporcjonalny do ich bezwzględnej odległości na chromosomie. Mapowanie chromosomu w jednostkach czasu przeprowadza się rozrywając koniugujące pary po różnym czasie kontaktu i badając kolejność pojawiania się w ich potomstwie rekombinantów dziedziczących poszczególne markery Hfr. 19  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Wyróżnia się różne typy Hfr, które mogą przekazywać markery chromosomalne w różnej kolejności i w przeciwnych kierunkach, zależnie od miejsca włączenia plazmidu F. Bakterie F+ mogą niekiedy spontanicznie tracić czynnik F, zmieniając je w komórki F-. Dzieje się to na skutek przypadkowego zaburzenia replikacji czynnika F, która w stanie autonomicznym episomu odbywa się niezależnie od replikacji chromosomu. Zjawisko takie można wywołać sztucznie, hodując bakterie F+ w obecności barwników akrydynowych. Otrzymuje się w wyniku populację komórek biorców F-. Komórki Hfr w tych warunkach nie zmieniają płci, ponieważ czynnik F replikuje się w nich wraz z całym chromosomem. 20  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza Organizmy dziedziczą, nie tyle określone cechy, co potencjalną zdolność do ich ujawniania. Czy dana cecha ujawni się czy nie często decyduje środowisko. Zespół cech ujawniających się określa się nazwą fenotypu. Potencjalna zdolność do ujawniania cech z pokolenia na pokolenie uwarunkowana jest strukturą materiału genetycznego jakim jest DNA (wyjątkowo u niektórych wirusów RNA). Ten zespół potencjalnych możliwości zaszyfrowany w DNA, nazywa się genotypem. Genotyp określa więc granice fenotypu, ale ujawnienie potencjalnych możliwości ukrytych w genotypie zależy w dużej mierze od oddziaływania środowiska. Dziedziczenie przez organizmy potencjalnych możliwości ujawniania cech jest równoznaczna z dziedziczeniem przez nie zdolności do syntezy określonych enzymów i innych białek czynnych. Występowanie określonego enzymu lub innego białka czynnego nie jest samo cechą fenotypową. Cechami są natomiast skutki działania tego enzymu lub białka czynnego. Skutki te mogą się przejawiać np. jako zdolność organizmu do przeprowadzania jakiegoś procesu fizjologicznego. Skutki te mogą się jednak też przejawiać bardziej pośrednio, jako zmiana jakiejś właściwości morfologicznej. Informacja genetyczna o syntezie określonego białka zapisana jest w genach. Gen to odcinek łańcucha DNA złożony z kilkuset par nukleotydów. Geny warunkujące jedną cechę określa się terminem allele. U organizmów diploidalnych (rozmnażających się płciowo) występują dwie alternatywne formy genu zwane allelami danego genu, jeden allel pochodzi od gamety męskiej, drugi od gamety żeńskiej. Osobniki mające dwa identyczne allele genu warunkującego daną cechę określa się jako homozygoty, a osobniki mające dwa różne allele - jako heterozygoty. Wszelkie trwałe zmiany w materiale genetycznym przenoszone na potomstwo nazywa się mutacją. Normalnie funkcjonujący gen posiadający pierwotną (w stosunku do zmutowanej) sekwencję nukleotydów nazywa się genem dzikim. Zmiany zachodzące w obrębie jednego genu określa się jako mutacje punktowe, natomiast zmiany, które dotyczą znacznych obszarów DNA jako mutacje chromosomowe. Mutacje punktowe w odróżnieniu od chromosomowych są łatwo odwracalne. Geny zajmują stałe miejsca (loci) w chromosomach i mogą rekombinować. Dzięki badaniom rekombinacji sporządzono dokładne mapy genetyczne poszczególnych chromosomów. Mapy te obrazują kolejność ułożenia genów na chromosomie oraz odległość między genami wyrażone w jednostkach rekombinacji (procentach crossing-over u 21  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza organizmów eukariotycznych) lub u bakterii (organizmów prokariotycznych) w jednostkach czasowych. Crossing-over to pękanie chromatyd chromosomów homologicznych i ich ponownego łączenia w nowym układzie (Rysunek 3.1) Rysunek 3.1: Uproszczony schemat crossing-over. W profazie I podziału mejotycznego chromosomy homologiczne (każdy złożony z dwóch chromatyd) układają się obok siebie (a). Może dojść do pęknięcia i połączenia "na krzyż" chromatyd należących do dwóch różnych chromosomów (b). W I podziale chromosomy rozchodzą się (c) a w II podziale pękają centromery i rozchodzą się chromatydy (d), każda z nich trafia do innej gamety Gen jest jednostką mutacji, rekombinacji i funkcji. Rekombinacja może zachodzić na identycznej zasadzie zarówno wewnątrz genów jak i między nimi. Mutacji może ulegać dowolny nukleotyd w obrębie genu. Jeśli skrzyżuje się ze sobą mutanty alleliczne to można z pewną częstością (rzędu ułamków procenta) otrzymać rekombinanty typu dzikiego. Stanowią one połowę wszystkich rekombinantów, druga połowa to rekombinanty mające dany gen zmutowany w dwóch miejscach. Na podstawie częstości rekombinacji pomiędzy poszczególnymi mutacjami w danym genie sporządza się mapy genetyczne genów tak samo jak mapy genetyczne chromosomów. Mutacje w różnych genach uzupełniają się (komplementują), w jednym (na ogół) nie. Jeśli mamy do czynienia z mutacjami mapującymi się na różnych chromosomach lub leżących daleko od siebie na jednym chromosomie, to nie ma wątpliwości, że są to mutacje różnych genów, nawet jeżeli efekty fenotypowe tych mutacji są takie same. Jeżeli dwa geny związane na przykład z syntezą jednego aminokwasu leżą obok siebie na chromosomie to test rekombinacji nie pozwoli na ustalenie czy dane dwie mutacje zaszły w jednym czy też w dwóch różnych genach. Jednoznaczną na ogół odpowiedź można otrzymać stosując test na 22  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza komplementację (inaczej: test na aIleliczność). Test ten w przypadku organizmów diploidalnych polega na otrzymaniu osobnika heterozygotycznego (w wyniku krzyżowania dwóch mutantów o tym samym fenotypie), u którego występują jednocześnie oba zmutowane allele - Jeśli mutacje dotyczą różnych genów (i są recesywne) to osobnik taki będzie miał dziki fenotyp (test komplementacji pozytywny) - jeżeli obie mutacje zaszły w tym samym genie, to osobnik taki będzie miał fenotyp mutanta (test komplementacji negatywny). W tej drugiej sytuacji nie występuje dziki allel zmutowanego genu, który mógłby wytwarzać funkcjonalne cząsteczki zakodowanego w nim białka. Omówione sytuacje są przedstawione schematycznie na Rysunku 3.2. Rysunek 3.2. Test na alleliczność. Jeżeli mutacje zaszły w dwóch genach, to heterozygota niezależnie od tego czy mutacje znajdują się w układzie cis czy też trans będzie miała fenotyp nie zmutowany (dziki). Dziki fenotyp heterozygoty świadczy więc o komplementowaniu (wzajemnym uzupełnianiu się) dwóch mutacji, a zatem o niealleliczności zmutowanych genów. Jeżeli mutacje zaszły w tym samym genie, to heterozygota mająca mutacje w układzie cis będzie miała fenotyp dziki (jeden allel genu A jest zmieniony w dwóch miejscach, a drugi jest nie zmutowany), podczas gdy heterozygota w układzie trans będzie mutantem (oba allele genu A zmutowane). Taki wynik testu świadczy o braku komplementacji. Dwie mutacje o tym samym fenotypie mogą być w układzie trans lub cis. Dwie mutacje niealleliczne, kodujące dwa różne polipeptydy będą komplementować zarówno w układzie cis jak i trans. Jeśli mutacje są alleliczne i są w jednym genie kodującym jeden polipeptyd to komplementować będą w układzie cis, a w układzie trans komplementacja zachodzić nie będzie. Tak więc gen jako jednostka funkcjonalna kodująca jeden polipeptyd może być genetycznie zdefiniowana jako odcinek DNA, w obrębie którego mutacje w 23  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza układzie trans nie komplementują. Taki odcinek DNA został przez Benzera nazwany cistronem i odpowiada on genowi jako jednostce funkcjonalnej kodującej jeden polipeptyd. Wykonanie testu na komplementację jest także możliwe w przypadku organizmów, u których dominuje faza haploidalna, pod warunkiem, że można u nich uzyskać stabilne formy diploidalne (lub heterokariony). W przypadku bakterii test na komplementację można przeprowadzić w układzie, w którym jeden zmutowany allel znajduje się w chromosomie bakteryjnym (genoforze), a drugi jest wprowadzony do komórki na plazmidzie lub za pośrednictwem bakteriofaga. W przypadku wirusów test na komplementację przeprowadza się infekując komórki jednocześnie dwoma zmutowanymi wirusami. Jeżeli mutacje dotyczą różnych nieallelicznych genów, wirusy będą mogły przejść pełny cykl życiowy w zainfekowanej komórce. Typy mutantów : Mutanty pokarmowe (auksotroficzne) - są to mikroorganizmy, które w wyniku uszkodzenia określonego genu utraciły zdolność do syntezy jakiegoś związku chemicznego (np. aminokwasu, witaminy, zasady azotowej). Mutanty te można utrzymać przy życiu dodając do pożywki minimalnej składnik, którego nie potrafią wytwarzać. Analiza mutantów pokarmowych pozwala na znacznie łatwiejsze niż mutantów morfologicznych, zademonstrowanie zależności między genem, białkiem, a cechą organizmu. Można bowiem ustalić, że fenotyp mutanta (wymaganie jakiegoś składnika wzrostowego lub niezdolność do wykorzystywania jakiegoś składnika do wzrostu) wynika bezpośrednio z braku lub niefunkcjonalności określonego enzymu. Mutanty oddechowe (petite) - są to organizmy, które w wyniku uszkodzenia - genów jądrowych lub genów mitochondrialnych mają zahamowane funkcje mitochondriów. Mitochondria zawierają bowiem niewielkie koliste cząsteczki DNA (mtDNA). Mitochondrialny DNA (mtDNA) zawarty w komórkach różnych organizmów znacznie się różni pod względem ilości kopii, wielkości i sekwencji. W pojedynczej komórce może znajdować się ponad 100 cząsteczek mtDNA. Ilość mtDNA w komórkach zwierzęcych jest stała i wynosi 1% całkowitej ilości DNA, ale np. w drożdżach Saccharomyces cerevisiae ilość ta jest zmienna i waha się od 2 do 36% całkowitego DNA w zależności od warunków wzrostu. mtDNA jest dwuniciowy i występuje w formie kolistej (liniowy mtDNA znaleziono u bardzo niewielu organizmów m.in. u drożdży Hansenula mrakii). mtDNA różnią się między sobą składem zasad - w mtDNA zawartość par zasad GC wynosi do 50%, najczęściej jednak mniej niż 30%, 24  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza a u drożdży Saccharomyces cerevisiae osiąga zaledwie 17%. Wielkość mtDNA niższych eukariontów jest bardzo zróżnicowana np. w mitochondriach drożdży Schizosaccharomyces pombe znajduje się DNA o długości około 6 μm i masie cząsteczkowej rzędu 107 daltonów, natomiast w mitochondriach Saccharomyces cerevisiae o masie cząsteczkowej 4,6-5,2x107 daltonów, a długość 21-25 μm. Różnice w wielkości mtDNA wynikają raczej z obecności powtarzających się sekwencji DNA i sekwencji niekodujących niż liczby genów. W mtDNA występują geny kodujące: - mitochondrialne tRNA i rRNA - oraz niektóre podjednostki enzymów łańcucha oddechowego. Większość informacji o sposobie dziedziczenia cech mitochondrialnych uzyskano dzięki analizie mutantów mitochondrialnych Saccharomyces cerevisiae. Drożdże są względnymi tlenowcami i hodowane w warunkach beztlenowych czerpią energię wyłącznie z procesów fermentacji. Ta właściwość komórek drożdży powoduje, że zarówno mutacje jądrowe, jak i mitochondrialne, prowadzące do zahamowania funkcji mitochondriów, nie powodują śmierci zmutowanych komórek, lecz jedynie niezdolność do wzrostu na nie ulegających fermentacji źródłach węgla, jak glicerol czy etanol. Saccharomyces cerevisiae jest organizmem jednokomórkowym. Komórki haploidalne rozmnażają się przez pączkowanie w wyniku podziałów mitotycznych. Przez połączenie dwóch komórek haploidalnych różniących się typem koniugacyjnym (a i alfa - α), powstaje diploidalna, heteroplazmatyczna zygota, dająca początek diploidalnemu potomstwu. Komórki diploidalne, tak jak i haploidalne, rozmnażają się przez podziały mitotyczne. Natomiast w wyniku mejozy powstają cztery haploidalne spory, dwie o typie koniugacyjnym a - i dwie - alfa, dające początek pokoleniu haploidalnemu. W czasie kilkunastu podziałów mitotycznych heteroplazmatycznego klonu zygotycznego następuje rozsegregowanie cech mitochondrialnych i powstają homoplazmatyczne haploidy. W diploidalnym potomstwie występują segreganty typu rodzicielskiego, jak i segreganty ze zrekombinowanym układem cech mitochondrialnych. W wyniku podziałów mejotycznych homoplazmatycznych diploidów powstają cztery homoplazmatyczne spory. Tak więc w przypadku mutacji mitochondrialnych segregacja dwóch alleli danego locus następuje podczas podziałów mitotycznych heteroplazmatycznego klonu zygotycznego, natomiast w wyniku podziałów mejotycznych dwa allele segregują w stosunku 4:0 lub 0:4. W przypadku mutacji jądrowych nie występuje 25  Podstawy Genetyki Stempniewicz, Niemiec, Łaba, Piegza segregacja w czasie podziałów mitotycznych, natomiast w wyniku mejozy dwa allele tego samego locus segregują w stosunku 2:2 (Rys, 3.3). homoplazmatyczne potomstwo haploidalnych spor Rysunek 3,3: Dziedziczenie cech mitochondrialnych u S cerevisiae a i a typy koniugacyjne (geny jądrowe). Kółka czarne i jasne - różne genomy mitochondrialne, typu rodzicielskiego; kółka w połowie zaczernione - genomy mitochondrialne zrekombinowane. Komórki haploidalne rozmnażają się w wyniku podziałów mitotycznych. Heteroplazmatyczne zygoty powstają przez połączenie dwóch komórek o przeciwnych typach koniugacyjnych i różnych genomach mitochondrialnych, dając początek diploidalnemu potomstwu. Po kilku lub kilkunastu podziałach mitotycznych następuje segregacja cech mitochondrialnych i powstają homoplazmatyczne diploidy o genotypach mitochondrialnych rodzicielskich i zrekombinowanych. Mogą one podlegać sporulacji i w wyniku podziałów mejotycznych powstają cztery spory, każda o identycznym genotypie mitochondrialnym. Typ koniugacyjny i pozostałe markery jądrowe segregują w stosunku 2:2. Spory dają początek haploidalnemu potomstwu. 26