Lesing 2: Biotegnologie en Rekombinante DNS-tegnologie PDF

BIOTEGNOLOGIE: REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Verwysings: LESING 2 Russell et al 4de uitgawe bl326-329, bl408-415...

BIOTEGNOLOGIE: REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Verwysings: LESING 2 Russell et al 4de uitgawe bl326-329, bl408-415 Russell et al 5de uitgawe bl315-320, bl389-395 Klasnotas Sleutelbegrippe: Die sentrale dogma, restriksie-ensieme, DNS-ligase, PKR, plasmiedvektore, DNS-biblioteke Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE DIE SENTRALE Vloei van genetiese inligting vanaf DNS (genotipe) na proteïen DOGMA (fenotipe) Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE DNS-Polimerase: Replikasie = proses waartydens identiese kopieë van die oorspronklike DNS-molekules gemaak word DIE SENTRALE RNS-Polimerase: Transkripsie = proses waartydens RNS gemaak word DOGMA met behulp van DNS as templaat Ribosoom: Translasie = proses waartydens proteïen gemaak word met behulp van mRNS (boodskapper-RNS) Aanvangs- kodon 5’ 3’ 3’ 5’ Dubbel- string 5’ 3’ Enkel- string Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Geenstruktuur: DIE SENTRALE ’n Geen bestaan uit reguleringsdomeine (promotor-, aktiveerder-, DOGMA demper- en termineerdervolgordes) en ’n oop leesraam (OLR), wat uit eksons en introns bestaan Geenuitdrukking: Aktiveerder Demper Promotor OLR Termineerder ATG Wanneer? Wat? Stop! Waar? Hoeveel? ATG  Slegs een Prokariotiese gene is universele aanvangskodon eenvoudiger en bevat vir alle organismes geen introns nie Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE HOE KAN ONS DNS MANIPULEER? Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Bakteriese restriksie-ensieme sny DNS-molekules op bepaalde DNS- MANIPULASIE MBV volgordes genaamd restriksiesetels RESTRIKSIE-ENSIEME, ’n Restriksie-ensiem maak gewoonlik verskeie snitte, wat DNS-LIGASE EN restriksiefragmente oplewer PLASMIEDE Die nuttigste restriksie-ensieme sny DNS op ’n verspringende (skuins) manier, wat fragmente met kleefente oplewer wat aan die komplementêre kleefente van ander fragmente vasheg DNS-ligase is ’n ensiem wat die lasplek tussen restriksiefragmente seël Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE WAT IS ‘N ’n Klein, sirkelvormige stuk DNS wat onafhanklik van die chromosoom kan repliseer PLASMIED? Uitdrukking van die ingevoegde geen sal deur die promotor gereguleer word Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE VERSKILLENDE KOMPONENTE VAN ’N PLASMIED? Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE VERSKILLENDE KOMPONENTE VAN ’N PLASMIED? Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Restriksiesetel MANIPULASIE MBV RESTRIKSIE- ENSIEME, DNS- LIGASE EN PLASMIEDE Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Restriksiesetel MANIPULASIE MBV RESTRIKSIE- Restriksie-ensiem sny ENSIEME, DNS- suikerfosfaatruggrate LIGASE EN PLASMIEDE Kleefent Byvoeging van ’n DNS-fragment van ’n ander molekule wat deur dieselfde ensiem gesny is. Basisparing vind plaas. Een moontlike kombinasie Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE Restriksiesetel MANIPULASIE MBV RESTRIKSIE- Restriksie-ensiem sny suikerfosfaatruggrate ENSIEME, DNS- LIGASE EN Kleefent PLASMIEDE Byvoeging van ’n DNS-fragment van ’n ander molekule wat deur dieselfde ensiem gesny is. Basisparing vind plaas. Een moontlike kombinasie DNS-ligase seël vasgehegte stringe Rekombinante DNS-molekule Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE DNS-KLONING Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE PROBLEEM... Een probleem met kloning is die identifisering van bakterieë wat plasmiede met ’n invoegsel in bevat Ons weet ons kan ’n antibiotikum gebruik om te selekteer vir ’n bakterie wat ’n plasmied bevat, MAAR … Hoe weet ’n mens of ’n bakterie ’n plasmied met ’n invoegsel in bevat of nie? Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE α-komplementering PROBLEEM... Spesiale kloningsvektore wat stukkies van die lac-operon bevat. OPGELOS Hierdie vektore bevat ’n gedeelte van die geen vir β-galaktosidase (oftewel lacZ). β-gal kataliseer die afbreking van die suiker laktose. Dit kan ook ’n kunsmatige substraat soos X-gal gebruik. Wanneer X-gal afgebreek word, gee dit ’n BLOU kleur af. Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE α-komplementering PROBLEEM... ’n Fragment (die eerste 146 aminosure) van die lacZ-geen (die α- OPGELOS fragment) is in die vektor Die res van die lacZ-geen is in die chromosoom Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE α-komplementering PROBLEEM... OPGELOS WIT = plasmied MET die DNS-invoeging BLOU = plasmied SONDER die DNS-invoeging Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE WAAR KOM DIE Van verskeie bronne, maar meestal die volgende: DNS VANDAAN? Polimerasekettingreaksie (PKR) Werk slegs as jy weet wat die DNS-volgorde is Biblioteke Kan gebruik word om gene te identifiseer op grond van DNS-ooreenkomste met ander gene Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe IN VITRO-AMPLIFIKASIE VAN DNS: DIE POLIMERASEKETTINGREAKSIE (PKR) PKR-komponente en proses Die DNS-templaat Inleiers (primers) wat die fragment “merk” Die ensiem wat die DNS kopieer (oftewel ’n polimerase) Die vier basisse (A T C G) waaruit DNS bestaan Hibridisasie vind baie spesifiek tussen komplementêre volgordes plaas: 5’-ATTGCGTACTAGCATGA-3’ 3’-TAACGCATGATCGTACT-5’ Sodoende kan spesifieke volgordes met behulp van inleiers geïdentifiseer word Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE DIE Eindproduk en POLIMERASEKETTING ontleding... REAKSIE (PKR) Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE PKR werk net as jy weet wat die DNS-volgorde is. Indien nie, is dit VERSKILLENDE die beste om ’n biblioteek te maak. SOORTE DNS- BIBLIOTEKE Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe DIE SKEP VAN ’N GENOOM-DNS-BIBLIOTEEK Restriksie- WAT IS DIT? ensiem- vertering, bv. EcoRI ’n Biblioteek van die genoom-DNS van ’n organisme (ALLE DNS in die nukleus) DNS-fragment onbekend? Isoleer DNS en fragmenteer mbv restriksie- Ligering van fragmente met ensieme DNS-ligase Ligeer fragmente in plasmiede Bakterieë neem plasmiede Dieselfde konsep as R-DNS-tegnologie met nuwe DNS-invoeging in op Baie (miljoende) individuele DNS-fragmente word in plasmiede geligeer Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE TEGNIEK Sel van kolibrie Bakteriese sel lacZ-geen Restriksie- Kleef- Geen van belang setel ente ampR-geen Bakteriese DNS-fragmente plasmied van kolibrie Nie-rekombinante plasmied Rekombinante plasmiede Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE TEGNIEK Sel van kolibrie Bakteriese sel lacZ-geen Restriksie- Kleef- Geen van belang setel ente ampR-geen Bakteriese DNS-fragmente plasmied van kolibrie Nie-rekombinante plasmied Rekombinante plasmiede Rekombinante plasmiede Bakterieë met plasmiede in Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE TEGNIEK Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE DNS kan gebruik word vir die rekombinante TOEPASSINGS proteïenproduksie van: Proteïenhormone Ensieme vir waspoeiers Entstof-epitope Molekulêre biologiese reagense.... Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE ’n Biblioteek wat by die IPB gemaak word, TOEPASSINGS lewer interessante polimere op... Waar kom die DNS vir die biblioteek vandaan? Die polimere wat vervaardig word … Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe Bg32-polimeer (Bg32-betagalaktosidase-ensiem) REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE VOLGENDE KEER Kunsmatige lewe PRAAT ONS OOR: REKOMBINANTE DNS-TEGNOLOGIE, DEEL 2 Science | EyeNzululwazi ngezeNdalo | Natuurwetenskappe