Rekombinant DNA Teknikleri PDF

TIBBİ BİYOLOJİ REKOMBİNANT DNA (rDNA) Teknikleri Prof. Dr. Fatma Filiz ARI  Rekombinasyon bir yeni bileşim olayıdır. DNA'da doğal olarak meydana gelen rekombinasyon genetik varyasyonlar oluşturur ve rekombinasyon taşıyan hücrenin yeni bir karakter kazanmasına ve ebeveyn hücrede...

TIBBİ BİYOLOJİ REKOMBİNANT DNA (rDNA) Teknikleri Prof. Dr. Fatma Filiz ARI  Rekombinasyon bir yeni bileşim olayıdır. DNA'da doğal olarak meydana gelen rekombinasyon genetik varyasyonlar oluşturur ve rekombinasyon taşıyan hücrenin yeni bir karakter kazanmasına ve ebeveyn hücreden farklı olmasına neden olur. Rekombinasyon sonucunda oluşan değişikliklerden bazıları yararlı olup hücrenin/ bireyin değişen çevresel şartlara evrimsel adaptasyon göstermesini sağlar. Bazı rekombinasyonlar ise hücre/birey için zararlı sonuçlar yaratabilir. Günümüzde DNA rekombinasyonu hücre dışı ortamda (in vitro) test tüpleri içinde gerçekleştirilebilmektedir.  rDNA Teknolojisinin Kullanım Alanları Bilimsel araştırma amacıyla: spesifik bir gen veya DNA dizisinin klonlanması ve tanımlanması Farmasötik/Ticari amaçla: gen ürünlerinin (Protein veya RNA) ilaç olarak kullanılmak üzere (aşı, enzim, hormon, antikor gibi) etkin ve yüksek miktarda üretimi Tıbbi amaçla: mutasyon/polimorfizm tespiti ile hastalıkların tanısı, mümkün olan hastalarda genetik defektlerin düzeltilmesi, Adli Tıpta-DNA parmak izi ve hastalıkların mekanizmalarını çözmek için transgenik model organizmaların üretimi Tarımsal amaçla: zor iklim ve çevre şartlarına dayanıklı, verimi yüksek bitki ve hayvanların üretilmesi  Rekombinant DNA Teknolojisinin Tarihçesi 1869 Genetik bilginin nükleik asitlerde depolandığının anlaşılması 1953 DNA’nın çift sarmal ve iki nükleotid dizisinden oluştuğunun keşfi 1960 Restriksiyon endonukleazların bulunması 1961 Genetik kodun işleyişi belirlenmesi 1966 20 amino asiti şifreleyen genetik kodların bulunması 1969 E. coli 'de EcoRI‘ RE’nin varlığının belirlenmesi 1970 Revers transkriptaz enziminin saptanması 1972 İlk rekombinant DNA molekülünün hazırlanması 1973 Plazmidlerin gen klonlamasında kullanılması 1975 Gen spesifik problarla parental DNA'nın saptanması 1976 Termal sulardaki bakterilerden yüksek ısıya dayanıklı Taq DNA Polimeraz enziminin eldesi 1977 Genlerde İntron ve exon bölgelerinin varlığının tesbiti 1978 İnsan genomik kütüphanesinin hazırlanması 1982 İnsan insülinin E. coli 'de klonlanması ve ticarete sunulması -İnsan kanser genin izolasyonu, klonlanması ve karakterizasyonu -Rat büyüme hormonunun fare embriyosuna transferi 1985 Tütün bitkisinin herbisite dirençli hale getirilmesi -PCR tekniğinin geliştirilmesi 1987 Farelerde genetik bir hastalığın (shiverer mutasyon) yabanıl genin fare embriyolarına verilmesi ile tedavisi 1988 Genetik manipulasyonla elde edilen soya fasulyesinin üretimi (GDO) -Gen tabancasının (gene gun) geliştirilmesi 1990 İlk fertil mısırın üretimi 1991 Transgenik domuz ve keçinin elde edilmesi (insan hemoglobini üreten) - İnsanlarda kanserin tedavisinde genlerin kullanılması 1997 Nükleer transfer süreci kullanılarak yetişkin somatik bir hücreden klonlanan ilk hayvan (Dolly)  Klon/Koloni İn vitro şartlarda 1 tek hücreden mitoz bölünme ile üretilen ve genetik olarak birbirinin aynı hücreler grubu Rekombinant DNA (rDNA) Teknolojisi (Klonlama) Rekombinant DNA’nın elde edildikten sonra bir konak hücreye aktarılması ve hücrelerin bölünerek çoğalması sırasında rDNA moleküllerinin ve rProteinlerin saf ve yüksek miktarda elde edilmesini sağlayan yöntem  Klonlama Tipleri DNA/Gen/Protein düzeyinde klonlama Hücre düzeyinde klonlama Organizma/çekirdek düzeyinde klonlama  Klonlamanın Tarihçesi 1875 Deniz hayvanlarında döllenme 1878 İlk kez anne rahmi dışında döllenme 1944 Tüp ortamında insan yumurta hücresi döllendi 1952 Dondurulmuş sperm ile inek yumurtası döllendi 1959 Deney tüpünde döllenen bir memeli yavru doğdu 1972 Dondurulmuş embriyodan yavru fareler elde edildi 1978 Yumurta ve spermin in vitro döllendi, anne rahmine yerleştirildi, ilk Tüp Bebek Louise Brown dünyaya geldi 1984 Avusturalya’da donmuş embriyodan sağlıklı bir kız çocuğu doğdu 1987 Embriyo hücrelerinin çoğaltılmasıyla çok sayıda kuzu elde edildi 1993 İnsan embriyosu klonlandı çok tepki aldı 1997 Dolly klonlandı Ian Wilmut 1999 Fransada bir dananın 63 klonu elde edildi 2000 Totipotent stem hücrelerinden deneysel organogenezis 2001 Farede gen klonlama yöntemiyle insan kulağı gelişimi sağlandı 2002 Amerika’da ex vivo yapay rahim geliştirildi Gen Klonlamanın Başarılı olması için gereken şartlar Klonlanacak genin hücresel kromozomdan bağımsız şekilde replike olabilen bir Taşıyıcı DNA molekülüne (vektöre) yerleştirilmesi Rekombinant Vektör DNA’nın transfer edileceği ve çoğaltılabileceği uygun bir Konak hücre bulunması Rekombinant ve non-rekombinant konak hücre klonlarının kolayca seleksiyonun yapılması Gen Klonlama şeması Gen klonlamasının temel aşamaları  Genomik DNA'nın saf olarak elde edilmesi - 1 1. Aşama: Hücre (Duvarı) ve Membranının Parçalanması (Lizis) DNA’ya ulaşmak için önce varsa hücre duvarı ve sonra hücre membranın parçalanması fiziksel ve kimyasal yöntemlerle sağlanır. Fiziksel parçalama (ısıtma, dondur-çöz ve homojenizatör kullanımı) Kimyasal parçalama (hücre duvarını parçalayan lizozim enzimi, membran proteinlerini denatüre ederek hücre zarının yapısını bozan deterjan tipi ajanlar kullanımı) Kimyasal parçalamada kullanılan Lizis tamponu içinde bulunan: Deterjan (SDS), hücre zarının yapısını bozar. Tuz, protein-DNA etkileşimini bozar, ayrışmayı kolaylaştırır. ++ EDTA, Mg bağlayarak DNaz enzimini inhibe eder, DNA’nın stabil kalmasını sağlar. Proteinaz K enzimi, Histonları ve hücresel denatüre proteinleri parçalar RNaz A enzimi, hücredeki RNA’lardan kurtulmak için kullanılır. 2. Aşama: DNA Ekstraksiyonu (Protein ve Diğer Moleküllerden Arındırma) Son yıllarda, Lizis aşamasında parçalanan hücresel atıkların uzaklaştırılması için DNA’yı tutma özellikli spin kolonlar içeren saflandırma kitleri kullanılarak saf gDNA elde edilir. 1. Saflandırma kit’indeki Lizis Tamponu (Deterjan, Tuz, EDTA) içersinde hücreler parçalanır. Bu karışma Proteinaz K ve RNaz A enzimleri eklenerek proteinlerin ve RNA’ların da parçalanması sağlanır. gDNA dışındaki hücresel moleküllerin parçalanmış halde bulunduğu bu karışıma Lizat adı verilir. 2.Hücre lizatı, tabanında sadece DNA’nın tutunabildiği bir membran bulunan ve kolon adı verilen özel tüpe aktarılır. 3.Kolon santrifüj edilir: matrikse tutunan DNA haricindeki parçalanmış atık hücresel moleküller bu aşamada kolondan uzaklaştırılır. 4.Spin kolona Yıkama tamponu eklenir ve tekrar santrifüj edilir: DNA harici maddeler yıkanarak membrandan tamamen uzaklaştırılır. 5.Son aşamada, kolona membran-DNA etkileşimini bozan Elüsyon tamponu eklenir ve santrifüj ile kolondan saf gDNA’nın kazanımı sağlanır.  Genomik DNA İzolasyon KİTİ Spin kolon ve Toplama tüpü gDNA İzolasyon Şeması Gen klonlamasının temel aşamaları  Genomik DNA’dan hedef genin eldesi -2 2 farklı yöntemle gerçekleştirilebilir 1. Genomik DNA’nın büyük parçalar halinde kesilmesi Restriksiyon endonükleaz enzimleri (RE) kullanılır 2-Hedef genin veya gen bölgesinin Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile çoğaltılması gDNA’dan herhangi bir gen bölgesinin milyonlarca kopyası elde edilebilir. Hedef gen dizisinin, en azından bir kısmının önceden bilinmesi gerekir PCR için: Kalıp DNA, sentetik 1 çift primer (~20 oligonükleotidlik), Taq DNA polimeraz enzimi, dNTP’ler (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), uygun tampon çözeltisi ve PCR cihazına ihtiyaç vardır. Klonlamada Tip II RE’leri kullanılır Spesifik bir nükleotit çifti dizisini tanır ve bu dizi içinde spesifik kesim yaparlar Tanıma dizileri 4, 5, 6, 7 ve 13 nükleotit uzunluğunda olabilir 5´-GAATTC-3´ Tanıma dizileri Palindromik / ters tekrar şeklindedir 3´-CTTAAG-5´ Tip II enzimleri DNA’da 2 farklı tipte kesim yapabilirler: Küt uçlu kesim: iki iplikteki kesim noktası karşılıklıdır (SİMETRİK) Kesim sonucu çift iplikli DNA’nın her iki ipliğinde küt uçlar oluşur 2. Yapışkan uçlu kesim, iki iplikte kesim noktaları farklıdır (ASİMETRİK) Kesim sonucu çift iplikli DNA’nın her iki ipliğinin ucunda birbirine komplementer tek iplikli DNA kuyrukları (yapışkan uçlar) oluşur. Genomik DNA ve vektör DNA’nın aynı RE ile kesilmesi  ÖRNEK: gDNA molekülünün BglII RE ile kesim reaksiyonu RE ile kesilen DNA’ların analizi için AGAROZ JEL ELEKTROFOREZ yöntemi kullanılır. Gen klonlamasının temel aşamaları Genomik DNA fragmanları ve Taşıyıcı vektör DNA’larının birleştirilmesi DNA Ligaz enzimi ile vektör ve genomik DNA parçalarının birleştirilmesi  Klonlamada taşıyıcı olarak kullanılan Vektörlerin genel özellikleri Kendini bağımsız olarak replike edebilmeli Vektörün çoğaltılabileceği uygun bir Konak hücresi olmalı Seçilebilir belirleyici (muhbir gen-selection marker) bölge/ bölgeleri taşımalıdır (antibiyotik direnç genleri). Bu sayede rDNA’yı taşıyan/taşımayan (non-rekombinant) konak hücreler ayırt edilebilir Vektör istendiğinde konak hücreden kolayca izole edilebilmeli  Klonlamada Kullanılan Vektör çeşitleri Yapılacak klonlama çalışmasının amacına uygun bir vektör seçilmelidir: Klonlanacak genin büyüklüğü, Konak hücrenin tipi, Klonlanan genden protein ürünü elde edilme ihtiyacı vs. Plazmidler Bakteriyofajlar Virüsler Baculovirus Lentivirus Cosmid vektörler Mekik vektörler Gen ekspresyon vektörleri YAC (yeast artificial chromosome) BAC (Bacterial artificial chromosome)  Plazmitler bakterilerde doğal olarak bulunan kromozom dışı DNA molekülleridir. Dairesel ve çift sarmal yapıdadırlar. Hücrede genellikle tek kopya halinde bulunurlar (çok kopyalılar da vardır). Restriksiyon enzimleri ile kesilip yabancı DNA parçası eklenerek rekombinant plazmitler elde edilebilir. 5–10 kb uzunluğunda gen taşıyabilirler.  pUC18’e gen klonlama şeması X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside) ß-galaktozidaz enziminin subsratıdır ve X-Gal’ı parçaladığında mavi renk oluşur. *Rekombinant ve non-rekombinant bakteri kolonilerinin ayırt edilmesinde kullanılır. Lambda (λ) Bakteriyofaj Vektörü Kozmid Vektörler  Mekik (Shuttle) Vektörler Birden fazla konakçı hücrede replike olabilir (hem maya hem bakteri). *Bir organizmadan diğerine gen taşımak için yaygın olarak kullanılır.  Gen Ekspresyon Vektörleri Promotor bölgesi bulunan vektörlerdir (plazmit, mekik, vs olabilir). Rekombinant proteini yüksek miktarda üretmek için kullanılır.  Bakteri Yapay Kromozomları Bacterial Artifical Chromosomes (BAC) 100-500 kb DNA taşıyabilir ! Antibiyotik direnç geni, RE bölgeleri içermektedir. Genom sekanslama projeleri için uygundur.  Maya Yapay Kromozomları Yeast Artificial Chromosomes (YAC) Kendine ait sentromer ve her iki uçta telomerlerin bulunması kromozom özelliği katmaktadır Kendini replike eden sekansa (ARS: Autonomously Replicating Sequence) sahiptir Seçici maya genleri içerir RE kesim bölgesi bulunur 1 Mbp DNA taşıyabilir ! Maya hücresinde çoğalabilir İnsan Genom Projesinde kullanılmıştır Gen klonlamasının temel aşamaları  Rekombinant vektör DNA‘sının konak hücreye aktarılmasında kullanılan yöntemler (transfeksiyon) Elektroporasyon Hücrelerin bulunduğu çözeltiye kısa elektrik akımları verilir. Akım, plazma zarında geçici açıklıklar oluşturarak vektör DNA’nın hücreye girişini kolaylaştırır Mikroenjeksiyon rVektör ökaryotik hücrelere, mikroskobik boyuttaki ince iğneler kullanılarak aktarılabilir Partikül bombardımanı (gun shot) rVektör nanoboyutta metal parçacıklarına tutturulur ve bir tabanca yardımıyla bitki hücrelerine gönderilir Lipofeksiyon rVektör lipid vesiküllere hapsedilir ve bu vesiküller hücre memranı ile etkileşerek vektörün hücreye aktarılması sağlanır Gen klonlamasının temel aşamaları Plazmite Klonlama ve rekombinant klon seçimi (X-GAL yöntemi) Rekombinant vektörü taşıyan Bakteri hücrelerinin (klonların) X-Gal seleksiyonu Mavi-beyaz kolonilerin oluşumu (beyaz-rekombinant bakteri kolonileri) Gen klonlamasının temel aşamaları  Gen ürününün (protein) elde edilişi ve kontrol edilmesi Bakteri içinde veya salgılanıyorsa besiyeri ortamında bulunan gen ürünü protein molekülleri, bakterilere ait endo ve ekzo proteinlerle, toksin veya toksik maddelerle, enzimlerle, metabolitler vs. gibi maddelerle kontamine olabilirler. Bu nedenle rekombinant teknoloji ile üretilen proteinlerin bunlardan ayrılması ve saf olarak elde edilmesi (pürifikasyon) gereklidir. Pürifikasyon sonrasında rProteinin doğal yolla üretilen ile aynı yapısal ve fonksiyonel özelliklere sahip olup olmadğı çeşitli biyokimyasal testlerle ispatlandıktan sonra kullanıma sunulur. Klonlamada RE kullanımı https://www.youtube.com/watch? app=desktop&v=aA5fyWJh5S0&ab_channel=WEHImovies https://www.youtube.com/watch?v=Ik_Pxht1LM0&ab_channel=KatiePorter Klonlama Özeti https://www.youtube.com/watch?v=NoyeCMmP5tw https://www.youtube.com/watch?v=MIfDx417SDs  Organizma/çekirdek düzeyinde klonlama Nükleer Klonlama/Transplantasyon Ian Wilmut ve arkadaşları: donör hücre olarak 6 yaşında sağlıklı dişi bir koyunun meme epitel hücresinin yalnızca çekirdeğini aldılar ve bir başka dişi koyunun metafaz II evresinde bekletilmiş çekirdeği çıkartılmış yumurta hücresine transfer ederek zigot elde ettiler. Bir başka dişi koyunun rahmine transfer edilen zigotun gelişmesiyle annesiyle %100 aynı genotip ve fenotipte sağlıklı bir kuzu elde edildi.  Nükleer Klonlamanın Önemi Yumurta hücresinin embriyogenezde spermden farklı artı(+) öneminin olduğu, Bir gen yerine çekirdeğin tamamının aktarılabileceği Memelilerde eşeysiz üremenin mümkün olduğu gösterildi. Bu çalışmanın bilime en önemli katkısı ise: farklılaşmasını tamamlamış yetişkin memeli hücrelerinin yeniden programlanabileceğinin gösterilmesi olmuştur. Sonraki yıllarda Kök hücre çalışmaları hız kazanmıştır. Erişkin fare hücrelerinden kök hücre elde edilerek, tedavi amaçlı embriyonik kök hücrelere olan ihtiyaç azalmıştır. Shinya Yamanaki ve John B. Gurdon 2012 Nobel Fizyoloji/Tıp Ödülü