Leishmanioses-conceitos gerais_aula alunos_2024 PDF

Mestrado em Parasitologia Médica Leishmanioses 10.12.2019 Conceitos gerais,...

Mestrado em Parasitologia Médica Leishmanioses 10.12.2019 Conceitos gerais, epidemiologia, clínica, diagnóstico e tratamento Sofia Cortes ([email protected]) Unidade de Parasitologia Médica 2 Sumário Dados históricos Transmissão e ciclo de vida de Leishmania Leishmanioses- epidemiologia Manifestações clínicas Diagnóstico Tratamento e controlo 3 Leishmanioses Grupo de doenças parasitárias zoonóticas ou antroponóticas, causadas por diferentes espécies de protozoários do género Leishmania transmitidos por insetos vetores flebotomíneos. 4 Primeiros registos históricos Estudos paleoparasitológicos indicam que o parasita Leishmania estará presente desde a Era Mesozóica. O primeiro fóssil Leishmania-like foi encontrado no trato digestivo de uma fêmea de flebótomo extinta- Palaeomyia burmitis- preservada em âmbar Birmanês do Cretáceo de há 65 Ma. Sec. V-III a.C. Primeiros registos etno-históricos revelaram que a leishmaniose tegumentar Americana surgiu na Amazónia em tempos arqueológicos disseminando-se, mais tarde, em direcção às regiões das Terras Altas e Andes, mantendo-se a endemia durante o Império Inca. (revisto em Steverding, 2017) 5 Séc. XVI ao XX ✓ séc. XVIII, Alexander Russell → valioso legado no que respeita à história natural da leishmaniose cutânea no Médio Oriente (Botão do Oriente) → exerceu medicina em Alepo (Síria) e em 1756 publicou um volume sobre a vida em Alepo, descrevendo detalhadamente a úlcera de Alepo (Mal de Alepo) *Russell A. The Natural History of Aleppo, and Parts Adjacent. London: A. Millar; 1756. p. 262–6. (317-321) 6 ✓ Em 1901, William Leishman identificou os parasitas em esfregaços de baço de um soldado inglês que havia morrido de “Dum- dum fever” em Calcutá, Índia; designou de “Leishman bodies”. Formas dos “Leishman bodies” desenhadas por W. Leishman após cultivo dos parasitas. 7 Em 1901 Charles Donovan, professor de fisiologia no “Madras Medical College” (extremo Sul da Índia), publicou um artigo relatando corpos semelhantes em amostras esplénicas obtidas de indivíduos nativos indianos Achou que os corpos ovóides eram um novo parasita, distinto de Trypanosoma. 8 ✓ Ronald Ross, em 1903, → concluiu que era um novo microorganismo e que o quadro clínico dos doentes se assemelhava ao do kala-azar. ✓ Em homenagem aos dois médicos, Ross propôs o nome da espécie de Leishmania donovani 9 Taxonomia REINO...............PROTISTA SUBREINO.......PROTOZOA FILO..................SARCOMASTIGOPHORA SUBFILO..........MASTIGOPHORA CLASSE............ZOOMASTIGOPHOREA ORDEM.............KINETOPLASTIDA SUBORDEM.....TRYPANOSOMATINA FAMÍLIA...........TRYPANOSOMATIDAE GÉNERO............Leishmania Trypanosoma Levine et al., 1980  Leishmania- transmissão Homem Leishmania sp Hospedeiro Parasitas vertebrado Flebotomíneos Mamíferos/ répteis Phlebotomus Hospedeiro Lutzomyia vertebrado/ reservatório Hospedeiro invertebrado/ vetor  Leishmania - formas do parasita Promastigota Amastigota ✓ Eucariotas, unicelulares, intracelulares ✓ Presença de DNA nuclear e cinetoplastideal (no cinetoplasto)- Ordem Kinetoplatida ✓ Ergoterol na membrana plasmática  Amastigotas- formas imóveis no Promastigotas- formas hospedeiro vertebrado móveis no vetor ✓ Formas amastigotas- 3-5 µm comprimento ✓ Formas promastigotas (móveis)- 10-15 µm comprimento ✓ Promastigotas metacíclicos- formas infeciosas ✓ Multiplicação clonal por divisão binária mas… ✓ Evidências de recombinação genética nos promastigotas A: 1000x A: 400x Promastigotas em cultura (video S. Cortes) Leishmania – ciclo de vida 1. Ingestão das células parasitadas pelo flebotomíneo durante uma refeição sanguínea no hospedeiro; 2. Modificação de amastigotas para promastigotas; Multiplicação no intestino médio; 3. Migração para o probóscide do insecto e inoculação dos promastigotas (promastigotas metacíclicos) num novo hospedeiro vertebrado durante a refeição sanguínea; 4. Invasão das céulas mononucleares; 5. Modificação de promastigotas para amastigotas; Multiplicação dos parasitas no interior do macrófago conduzindo ao seu rebentamento; 6. Invasão de outras células. macrófagos: células alvo 15 Leishmanioses- formas clínicas Visceral Cutânea Mucocutânea Afecta os orgãos do Afecta a pele Afeta pele e as sistema mononuclear mucosas nasais fagocítico L. Campino/ IHMT/ UNL 13-Nov-23 16 Leishmanioses humanas- impacto global 1000 milhões de pessoas em risco 0.7 a 1 milhão de novos casos/ ano 50 000 a 90 000 de leishmaniose visceral (LV) 600 000 a 1 milhão de leishmaniose cutânea (CL) (WHO, 2020)  Endemicidade da leishmanioses visceral, 2020 Global Health Observatory, WHO, 2020 95% dos novos casos de LV ocorrem em 10 países: Bangladesh, Brasil, China, Etiopia, India, Kénia, Nepal, Somalia, Sudão Sul, Sudão. 18 Postigo et al. 2022.WHO. Weekly Epidemiological Record, No 35 19 Endemicidade da leishmanioses cutânea, 2020 Global Health Observatory, WHO, 2020 95% dos novos casos de LC ocorrem em 6 países: Afganistão, Algéria, Brasil, Colombia, Irão, Iraque e Síria. 95% da LMC ocorrem no Brasil, Bolívia e Perú. 20 Postigo et al. 2022.WHO. Weekly Epidemiological Record, No 35 21 Leishmaniose Visceral na Bacia Mediterrânica Leishmaniose visceral zoonótica (LVZ) Causada por L. infantum Transmitida por Phlebotomus (várias espécies) O cão é o principal reservatório Prevalência considerável nos indivíduos imunocomprometidos (HIV+) LV na maioria dos países Europeus é de notificação obrigatória (sub-notificada!) No caso de doença infantil Mais de 90% das crianças têm idade inferior a 5 anos  LEISHMANIOSE VISCERAL Leishmania donovani → China e África Oriental (Sudão, Sudão Sul, Etiópia), sub-continente Indiano, Grécia, Chipre → É uma antroponose → Raramente descritos cães infectados com esta espécie → Causa de leishmaniaose dérmica post-kala azar (PKDL) Leishmania infantum → países da bacia mediterrânica, China, Ásia Central, África Oriental e América do Sul (Brasil) → É uma zoonose: canídeos (cães, raposas e chacais) e em algumas regiões roedores (R. rattus e R. norvegicus na Toscânia, Itália e Sudão) 23 Países endémicos para leishmaniose humana e animal na Europa e países vizinhos Barritua et al. 2021, EID, 27: 1323-7. 24 Infecção dos orgãos do sistema mononuclear fagocítico (baço, fígado, gânglios linfáticos e medula óssea) e outros órgãos (intestino, pulmões...) e tecidos (pele) Em casos avançados e de imunossupressão, todos os órgãos podem ficar infectados Pancitopénia (diminuição global de elementos celulares do sangue) Alterações celulares e bioquímicas no sangue: aumento das globulinas, IgG e IgM anticorpos anti-Leishmania; auto-anticorpos contra várias proteínas, haptenos e antigénios nucleares bem como citoplasmáticos (resultado da activação policlonal dos linfócitos B). 25 Leishmaniose visceral ou Kala-azar Fatal se não for tratada (mortalidade inferior a 10% com tratamento adequado) Proliferação dos parasitas, a partir da lesão cutânea inicial, para o baço, fígado e medula Período de incubação: 2 a 6 meses (…anos) Início dos sintomas insidioso com progressão lenta WHO, 2019 26 Leishmaniose visceral ou Kala-azar Sinais / sintomas Febre irregular Perda de peso substancial Astenia Hepatoesplenomegália Anemia Leucopénia Trombocitopénia WHO, 2019  Leishmaniose dérmica pós-kala-azar “Post-kala-azar-dermal-leishmaniasis” (PKDL) Manifestação cutânea secundária Surge 1 a 20 anos após recuperação de LV Agente etiológico: L. donovani Doença progressiva e severa Ocorre maioritariamente no Sudão e Índia (5-30% prev.) WHO, 2019 Sinais / sintomas Proliferação de parasitas na pele: rash, lesões nodulares, papulares ou maculo- papulares Nódulos contêm parasitas  LEISHMANIOSE CUTÂNEA Velho Mundo Leishmania tropica → Ocorre nas regiões áridas da África e da Ásia → pode ser antroponose (Síria, Afeganistão, Marrocos, Tunísia, Turquia, Iraque, Líbano, Israel, ex-URSS, Grécia) ou menos frequentemente zoonose (Jordânia e Israel) Leishmania major → Ocorre na Líbia, Marrocos, Tunísia, Argélia, Turquia, Irão e ex-URSS → É uma zoonose - reservatórios: Roedores (Rhombomys opimus, Psammomys obesus) Leishmania infantum (Norte de África e Sul da Europa) Leishmania aethiopica (Etiópia) e tem como reservatório hyraxes  LEISHMANIOSE CUTÂNEA Novo Mundo Leishmania braziliensis → causa mais comum e mais grave de LC e Leishmaniose mucocutânea e ocorre na América Central e do Sul (Espúndia) → Zoonose com reservatório urbano (cão e cavalo) e silvático (roedores) Leishmania guyanensis → Zoonose, ocorre na Guiana Francesa e Brasil Leishmania peruviana → Ocorre no Peru e Argentina e é zoonose (preguiças)  LEISHMANIOSE CUTÂNEA Novo Mundo Leishmania mexicana (México (Yucatan), Guatemala, Honduras, Panamá, Colombia) Leishmania amazonensis (floresta amazónica do Brasil, Bolívia, Colômbia, Equador, Peru, Guiana Francesa, Venezuela) → Zoonose: roedores (Cuniculus paca)  Manifestações clínicas 31 Leishmaniose cutânea Forma simples: localizada Formas graves: difusa, recidivante Lesões únicas ou múltiplas Abanima, 2010 Tempo de incubação: semanas a meses A cura geralmente é espontânea (meses a anos); nos casos de difusa o tratamento pode ser muito moroso 32 Leishmaniose cutânea Sinais / sintomas Lesão papular no local da “picada” não ulceratva →→ úlcera com limites duros Podem ocorrer diversas lesões limitadas a múltiplas lesões nodulares em localizações distintas Zonas mais afetadas: face, pesçoco, braços e pernas Aumento dos nodos linfáticos perto das lesões Leishmaniose cutânea recidivante: após lesão inicial surgem novas pápulas em redor da cicatriz inicial (espécie responsável L. tropica) A.Silva, 2017  Leishmaniose mucocutânea Extensão das lesões cutâneas às mucosas; meses/anos após resolução da lesão cutânea primária Lesões mutilantes e desfigurantes Infeção crónica com destruição da mucosa – nariz, oro e nasofaringe e pálpebras (dificuldades respiratórias) Refratária à terapêutica Estigma nas pessoas afetadas WHO, 2019 34 Vetores Flebótomos (Diptera: Psychodidae, Phlebotominae) pequenos insectos de 2–4 mm de comprimento 70 sps. Comprovadamente vetores de Leishmania sp. Velho Mundo Phlebotomus, exs: P. argentipes → L. donovani P. perniciosus, P. ariasi, → L. infantum P. sergenti → L. tropica P. papatasi → L. major P. argentipes. In: Mansons, 2014 Novo Mundo Culex sp. Lutzomyia, ex: Lu. longipalpis → L. infantum P. perniciosus Lu. witmani → L. braziliensis 35 Tabela resumo Leishmania spp. Geographic distribution Pathology Antroponotic Zoonotic Vector Old world New world Phlebotomus L. donovani Asia,Africa VL, PKDL India, Sudan argentipes Europe, P. perniciosus, P. L. infantum Asia (S. VL, CL canids ariasi (L. (L. chagasi) America) longipalpis) Asia,Africa, L. major CL rodents P. papatasi Europe Asia, L. tropica CL, recidivans Syria, Afganistan rodents P. sergenti Europe L. aethiopica Ethiopia CL, DCL hyrax P. longipes L. mexicana C. America CL rodents Lutzomyia spp. C. and S. L. amazonensis CL, DCL rodents Lutzomia spp. America L. intermedia, L. L. braziliensis S. America CL, MCL rodents, marsupial whitmani C. and S. L. panamensis CL, MCL (rare) edentate, rodents L. trapidoi America L. umbratilis; L. L. guyanensis S. America CL, MCL (rare) rodents, edentates whitmani L. peruviana S. America CL canids(dogs) L. peruensis VL, visceral leishmaniasis; PKDL, post-kala azar dermal leishmaniasis; CL, cutaneous leishmaniasis; DCL, dessiminated cutaneous leishmaniasis; MCL, muco-cutaneous leishmaniasis; 36 Fatores de risco Imunossupressão / Co-infeção HIV Ineficácia ou ausência dos planos de controlo Resistência dos parasitas e vectores a fármacos e insecticidas Alterações ecológicas e demográficas: Migração das populações Condições Sociais Desflorestação Urbanização Malnutrição 37 Diagnóstico laboratorial Técnicas parasitológicas Técnicas serológicas Técnicas moleculares 38 Técnicas parasitológicas Exame microscópico direto em lâminas coradas (Giemsa, Diff-Quik) (A= 1000x) Isolamento do parasita em cultura  Exame direto em esfregaços/ decalques Tempo de coloração ☺ Pessoal treinado para identificação microscópica de amastigotes de Leishmania (obj.100x)  Moroso  As lâminas podem ser mantidas por anos e usadas para outras técnicas (ex: PCR) ☺ S.Cortes 40 Culturas Meio NNN (Novy, MacNeal e Nicolle) Meio standard para isolamento de leishmania Meio bifásico Passagens semanais Meios líquidos (exs: M199, Schneider, RPMI, MEM) Menos frequente para isolamento Leishmania pode crescer diferentemente em diferentes meios e frascos Caro (frascos, aditivos, meio) Incubação a 24-26oC Culturas É necessária esterilidade do material biológico  Passagens semanais para um novo meio NNN (até 4 semanas antes de ser descartado)- moroso  Identificação microscópica fácil de promastigotas (obj.40x) ☺ 42 Técnicas serológicas Imunofluorescência indireta (IFI) Teste de aglutinação direto (DAT) Teste rápido rk39 Contra-imunoelectroforese (CIE) Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) Western blot (Immunoblot) ZACaLeish Metting S.Cortes 43 IFI – Imunofluorescência indireta Sensível e específica (limitações nos soros de pacientes e crianças imunocomprometidos) Técnica semi-quantitativa (títulos de anticorpos) Várias etapas de preparação, mas fáceis de manusear Deve ser interpretado por pessoal treinado Custo médio Determinação do cut-off (título a partir do qual o resultado é considerado positivo) Mais aprofundado na UC Investigação em Leishmanioses ZACaLeish Metting S.Cortes 44 Teste rápido rK39 Detecta anticorpos contra Leishmania em soros humanos (técnica qualitativa) Ag recombinante (repetição de 39 a.a. de uma proteína de 230 kD codificada por um gene semelhante a cinesina de L. infantum) Boa sensibilidade e especificidade, mas maus resultados na África Oriental Resultados em 10 min. Vários formatos de teste disponíveis Diagnóstico serológico Vantagens: Testes rápidos e fáceis de aplicar em campo (alguns) Pesquisa individual e em populações Possibilidade de aumento da especificidade/ sensibilidade - sub- classes de Ig Desvantagens: Não é possível distinguir infeções presentes e passadas Infeções cruzadas 45 46 Técnicas moleculares PCR qPCR (= PCR quantitativo; PCR em tempo real) 47 PCR Amplificação e detecção de DNA previamente extraido de uma amostra - Utiliza sequências iniciadoras ou “primers” específicos - 1 cópia de dsDNA origina 109 cópias após 30 ciclos de amplificação Para a deteção de Leishmania são utilizados diferentes alvos moleculares Vantagens ✓ O DNA pode ser extraído a partir de vários tipos de amostras: - sangue, medula óssea, gânglio linfático, pele, baço, fígado,… ✓ Não necessita de esterilidade da amostra (utiliza sequências específicas do organismo em estudo) 48 Vantagens (cont.) ✓ Resolve alguns dos problemas relacionados aos métodos diagnósticos clássicos (contaminação microbiana, sensibilidade, tempo, anticorpos...) ✓ Na LC e LMC: melhora os resultados obtidos por microscopia e cultura (até 100% de sensibilidade) ✓ Flexibilidade: - Combinação com outras técnicas, como RFLP (“restriction frgment lenght polimorphisms”), hibridação com sondas específicas, sequenciamento,… Visualização das bandas dos produtos de PCR amplificados ZACaLeish Metting S.Cortes 50 O PCR pode ser combinado com outras metodologias qPCR Monitorizaçãomcontínua dos produtos de amplificação, devido à devido à incorporação de corantes fluorescentes … Vantagens: Rápido Análise simultânea de alto número de amostra Não há necessidade de manipulação pós-PCR Alta sensibilidade e especificidade Desvantagens: Equipamento caro Reagentes caros 51 Outros testes moleculares ▪ Oligocromatográficos ▪ LAMP (“loop-mediated isothermal amplification assay”) ▪ NASBA (“nucleic acid sequence based assay”) ▪ … August 2010 | Volume 4 | Issue 8 | e776 52 Protocolos com base no PCR necessitam urgentemente de optimização e estandardização utilização de controlos de extracção controlos internos controlo standard de Leishmania ensaios replicados participação em programas de controlo de qualidade externos 53 O diagnóstico preciso e rápido da leishmaniose é importante para se iniciar o tratamento apropriado de forma a evitar: ▪ Mortalidade / morbidade (LV) ▪ Desfiguração (MCL) ▪ Doenças secundárias - infecções bacterianas (CL) ▪ Uso errado de medicação ▪ O desenvolvimento de resistências ▪ Custos para o paciente e para o sistema de saúde 54 TRATAMENTO- Considerações ✓ Inexistência de vacinas para a leishmaniose humana; 2 vacinas caninas com eficácia limitada ✓Terapêutica: - Limitada, onerosa, elevada tocixidade ✓ Falta de eficácia em alguns dos fármacos existente → estirpes/espécies com diferentes sensibilidades ✓ Aparecimento de resistências Problema Saúde Pública 55 Terapêutica A quimioterapia atualmente em uso para a leishmaniose visceral conta com quatro fármacos principais: ▪Anfotericina B liposomica (1ª linha) ▪Antimoniais pentavalentes (estibogluconato de sódio) ▪ Miltefosina ▪ Pentamidina 56 Hussain et al., 2014. Chem Rev. 22;114(20):10369-428 Efeitos secundários mais frequentes dos medicamentos em uso: Dor no local da injeção Perturbações gastrointestinais Arritmia cardíaca Mialgia, Artralgia Febre, tosse, dor de cabeça Tontura Nefrotoxicidade Toxicidade pancreática Hendrickx et al. (2019) Need for sustainable approaches in antileishmanial drug discovery. Parasitol Res 118:2743–2752  Prevenção e controle ✓ Diagnóstico precoce e o tratamento efetivo e imediato ✓ Controle vetorial Redução ou interrupção na transmissão da doença → diminuição do número de flebotomíneos (exs: sprays inseticida, uso de redes tratadas com inseticida) ✓ Controle de hospedeiros animais reservatórios Pode ser complexo e deve ser adaptado à situação local; uso de coleiras inseticidas, hábitos com os animais… ✓ Mobilização social e fortalecimento de parcerias Mobilização e educação da comunidade com intervenções efetivas; Programas de controle de doenças transmitidas por vetores é fundamental ✓ Vigilância eficaz da doença 60 Vamos testar a vossa atenção com umas questões sobre a aula de hoje … ☺ Dúvidas? Questões? Comentários? Não esquecer de efetuar os exercícios no moodle (contam para a avaliação)