Wzrost Drobnoustrojów - PDF

WZROST DROBNOUSTROJÓW 1. Typy wzrostu bakterii w hodowlach płynnych Typ wzrostu zależy od cech gatunkowych bakterii, dlatego aspekt ten bywa wykorzystywany w diagnostyce laboratoryjnej. Wiele bakterii rośnie w płynie w rozproszeniu, oddzielne komórki są zawieszone równomiernie w...

WZROST DROBNOUSTROJÓW 1. Typy wzrostu bakterii w hodowlach płynnych Typ wzrostu zależy od cech gatunkowych bakterii, dlatego aspekt ten bywa wykorzystywany w diagnostyce laboratoryjnej. Wiele bakterii rośnie w płynie w rozproszeniu, oddzielne komórki są zawieszone równomiernie w całej kolumnie płynu. Taki wzrost nazywamy dyfuzyjnym (np: E. coli, S. aureus ) (ryc. 2 c)). Bakterie które po podziale są połączone w agregaty rosną w postaci osadu na dnie podłoża, a płyn nad osadem zawiera ich niewiele i jest przejrzysty (np. paciorkowce) (ryc. 2 b)). Liczne bakterie tlenowe zwłaszcza te, które zawierają więcej substancji hydrofobowych w ścianie komórki, mają tendencję do wzrostu w postaci błonki lub kożuszka (ryc. 2 a)) (np. laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus oraz pałeczki Pseudomonas). Typ wzrostu zależy także od czynników środowiska: natlenienie podłoża, stężenia jonów wodorowych, oraz od napięcia powierzchniowego płynu. Jeśli obniżymy napięcie powierzchniowe np. dodając detergentu bakterie, które rosnąc tworzyły kożuszek, będą rosły dyfuzyjnie. Ryc. 2 Typy wzrostu bakterii w hodowlach płynnych: a) wzrost w postaci błonki lub kożuszka b) wzrost w postaci osadu c) wzrost dyfuzyjny. 2. Morfologia kolonii na pożywkach stałych Bakterie dzieląc się tworzą widoczne gołym okiem skupiska o budowie charakterystycznej dla gatunku i zależnej od składu podłoża, nazywamy je koloniami bakteryjnymi. Jeśli znajdują się w głębi stałego podłoża - koloniami wgłębnymi, jeśli na powierzchni koloniami powierzchniowymi. Kształt i zewnętrzna struktura kolonii powierzchniowych mogą być różne, wyróżniamy kolonie gładkie (S – smooth) i szorstkie (R- rough), różnica ta jest związana z budową powierzchniowych warstw komórki. W komórkach tworzących kolonie szorstkie brak jest kompleksów lipidowo-polisacharydowych (LPS) w błonie zewnętrznej. Dlatego bakterie dające kolonie szorstkie są zazwyczaj niechorobotwórcze. Bakterie wytwarzające duże ilości śluzu rosną w postaci kolonii śluzowych np. Klebsiella pneumoniae. Liczne bakterie wydzielają barwniki nierozpuszczalne w wodzie, wówczas ich kolonie są zabarwione np. kolonie Micrococcus luteus są żółte (cytrynowe), a Serratia marcescens czerwone. Niektóre bakterie wydzielają do podłoża barwniki rozpuszczalne w wodzie ( np.:zielony, niebieski, fioletowy) i barwiąc tym samym podłoże a nie kolonie np. Pseudomonas aeruginosa. Bakterie silnie ruchliwe (urzęsione) tworzą kolonie pełzające po podłożu np. Proteus mirabilis. Cechy kolonii bakteryjnej: - wymiary – średnica kolonii w [mm], - kształt – okrągły, owalny, wydłużony, rozlany, nieregularny, - barwa – bezbarwne, białe, żółte, kremowe itd... - wyniosłość – płaska, wyniosła, pęcherzykowata, brodawkowata, - powierzchnia – gładka, błyszcząca, matowa, szorstka, pomarszczona, - struktura – luźna, mazista, sucha, - brzegi – regularne, faliste, strzępiaste, ząbkowane, - przezroczystość – przezroczyste, półprzezroczyste, nieprzezroczyste, - zapach – np. jaśminowy, drożdży itd... Ryc. 3. Cechy kolonii bakteryjnej. [Mikrobiologia żywności. Krystyna Trojanowska, Helena Giebel, Barbara Gołębiowska] WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYCZNYCH NA DROBNOUSTROJE Efekt działania czynników zewnętrznych na drobnoustroje zależy od: natężenia czasu działania gatunku drobnoustroju Rodzaje oddziaływania czynników zewnętrznych na drobnoustroje: statyczne – hamujące namnażanie się drobnoustrojów zabójcze (nieodwracalne) – prowadzące do utraty zdolności wzrostu, namnażania się i śmierci komórki 1. Wpływ wilgotności: 2. Wpływ temperatury: Ze względu na optymalną temperaturę wzrostu komórki bakteryjnej bakterie dzielimy na: psychrofilne – zimnolubne, najlepiej rosną w temperaturze 00C – 200C np.: Listeria monocytogenes, Flavibacterium spp. mezofilne – najlepiej rosną w temperaturze 200C – 400C, należy do nich większość bakterii patogennych dla człowieka np.: E. coli, S. aureus, termofilne – ciepłolubne, najlepiej rosną w temperaturze 500C – 600C np.: Geobacillus stearothermophilus. 3. Wpływ stężenia jonów wodorowych: Podział bakterii ze względu na optymalne wymagania stężenia jonów wodorowych: acidofilne - optymalne pH 2 - 4, np. Lactobacillus spp., bakterie siarkowe neutrofilne - optymalne pH 6 - 8, np. bakterie z rodziny Enterobacteriaceae alkalofilne - optymalne pH 9 - 11, np. Vibrio cholerae 4. Podział bakterii w zależności od ich zapotrzebowania na tlen i CO2: a) bezwzględne tlenowce (aeroby), które żyją tylko w obecności tlenu atmosferycznego, uwalniają energię przy pomocy tlenu z wydzielaniem CO2 i wody: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + energia Rosną wyłącznie powierzchniowo np.: Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas spp., Micrococcus spp. (ryc. 4 a)) b) Względne beztlenowce (anaeroby) przeżywają przy niewielkich stężeniach tlenu, mogą wzrastać w warunkach tlenowych i beztlenowych, jednak energie czerpią z oddychania beztlenowego poprzez proces fermentacji np.: E. coli (ryc. 4 b)) Fermentacja jest częściowym rozłożeniem związków organicznych do prostych kwasów organicznych, alkoholi lub węglowodanów z uzyskaniem energii. Proces ten wykorzystywany jest często przez ludzi do otrzymywania specyficznych walorów żywności, np.: fermentacja mlekowa (jogurty, sery, kiszona kapusta czy ogórki) fermentacja alkoholowa (wino, piwo) c) Bezwzględne beztlenowce mogą rozwijać się tylko w środowisku pozbawionym tlenu, dla których jest on toksyczny. Zamiast tlenu zużywają substancje nieorganiczne np. azot jako końcowe akceptory elektronów np.: Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi (ryc. 4 c)) d) Bakterie mikroaerofilne potrzebują do wzrostu do 5% tlenu np.: Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni (ryc. 4 d)) e) Bakterie kapnofilne do wzrostu potrzebują 5-10% CO2 np.: Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae  Ryc. 4 Typy wzrostu bakterii w zależności od ich wymagań tlenowych METABOLIZM DROBNOUSTROJÓW Metabolizmem określamy całokształt reakcji i przemian chemicznych, które zachodzą w komórkach. Wyróżniamy dwa podstawowe typy procesów metabolicznych: katabolizm i anabolizm. Katabolizm dostarcza energii z reakcji chemicznego rozkładu związków nieorganicznych i organicznych oraz związków wyjściowych (prekursorów) do procesów biosyntezy materiału komórkowego. Anabolizm to proces reakcji biosyntetycznych prowadzących do wytworzenia prostych związków (cukry, aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe, kwasy tłuszczowe) oraz ich polimerów (wielocukry, białka, RNA, DNA, lipidy). Reakcje te wymagają nakładu energii. Produktami syntezy mogą być: wielocukry, białka, lipidy, kwasy nukleinowe, mukopeptydy, również enzymy, koenzymy, witaminy, barwniki , antybiotyki. Produktami katabolizmu mogą być: wodór, azot, metan, dwutlenek węgla, siarkowodór, amoniak, tlenki, alkohole, kwasy organiczne, aminy, indol, acetoina, inne.. Reakcje kataboliczne (przykłady) Organiczne substraty są katabolizowane w procesach enzymatycznych: trawienie – rozkład przez egzoenzymybbakteryjne na mniejsze cząsteczki pobieranie – transport przez błony cytoplazmatyczne, lub bierna dyfuzja utlenianie – usuwanie elektronów i jonów H+ oddychanie tlenowe oddychanie beztlenowe Reakcje anaboliczne (przykłady) synteza tłuszczów  glukoneogeneza glikogeneza biosynteza białek biosynteza DNA i RNA ODŻYWIANIE Istotą odżywiania jest pobieranie przez organizm substancji potrzebnych do utrzymania funkcji życiowych, a także wzrostu i rozwoju. Ponieważ bakterie nie mają zdolności do fagocytozy i pinocytozy, dlatego sam pokarm jest pobierany pobierany przez osłony komórkowe. Ten sposób ogranicza wielkość cząsteczek jakie mogą być pobierane przez bakterie. Natomiast składniki pokarmowe są najczęściej dostępne w postaci makrocząsteczek. W związku z tym konieczne jest ich rozbicie na mniejsze elementy. Makrocząsteczki mogą być rozbijane zewnątrzkomórkowo przez enzymy bakteryjne wydzielane poza komórkę np. estrazy, nukleazy, lipazy, proteazy, itd. Wachlarz ektoenzymów produkowanych przez komórkę będzie zależał m. in. od gatunku czy środowiska występowania. Oprócz enzymów wydzielanych pozakomórkowo, istotną role odgrywają również enzymy peryplazmatyczne odkładane a błonie komórkowej. Wśród tych enzymów występują m. in. nukleazy, fosfatazy i peptydazy. W pobieraniu związków drobnocząsteczkowych uczestniczą białka porynowe znajdujące się w błonie komórkowej. Większość bakterii to organizmy cudzożywne – heterotroficzne. Do wzrostu wymagają złożonych składników organicznych takich jak: węglowodany, aminokwasy. Odżywianie heterotroficzne polega na pobieraniu gotowej materii organicznej wytwarzanej przez inne organizmy. Większość bakterii wykorzystuje w tym celu martwą materię organiczną. Tę grupę bakterii cudzożywnych nazywamy saprobiontami. Do saprobiontów należą również bakterie, które rozkładają produkty żywnościowe, powodując ich psucie. Bakterie samożywne – autotroficzne samodzielnie wytwarzają materię organiczną z materii nieorganicznej. Synteza potrzebnych składników z substancji pokarmowych jest procesem energochłonnym, dlatego komórka musi korzystać z źródła energii. Organizmy przekształcające energię świetlną w energię wiązań chemicznych są nazywane fototrofami. Natomiast organizmy wykorzystujące energię chemiczną to chemotrofy. Energia ta może powstawać w wyniku utleniania nieorganicznych związków chemicznych (chemolitotrofy) lub wykorzystywać energię pochodzącą z rozkładu związków organicznych (chemoorganotrofy). Chemosynteza przeprowadzana jest przez bakterie azotowe, siarkowe, żelaziste czy wodorowe i składa się zawsze z dwóch etapów: utleniania substratu mineralnego w celu pozyskania energii chemicznej, asymilacji dwutlenku węgla z wykorzystaniem uwolnionej wcześniej energii. Przemiany chemosyntetyczne w innych bakteriach przebiegają podobnie i dlatego proces ten odgrywa ważną rolę w krążeniu w biosferze takich pierwiastków jak azot, siarka, żelazo czy wodór. Wśród chemoautotrofów wyróżnia się: bakterie siarkowe: H2S + O2 → S (H2SO4) + energia chemiczna bakterie azotowe (nitryfikacyjne): NH3 + O2 → N (HNO2, HNO3) + energia chem. bakterie żelazowe: (Fe2+ → Fe3+), utleniają sole żelazawe do żelazowych bakterie metanowe: związek organiczny → metan bakterie wodorowe: utlenianie wodoru cząsteczkowego Bakterie chorobotwórcze dla ludzi należą wyłącznie do chemosyntetyzujących bakterii organotroficznych.  ODDYCHANIE Organizmy żywe korzystają z dwóch źródeł energii: świetlnej i chemicznej. Z energii świetlnej potrafią korzystać jedynie organizmy fototroficzne, reszta zaliczana jest do heterotrofów. W oddychaniu komórkowym energia chemiczna utlenianego substratu organicznego zostaje wyzwolona i wykorzystana przez organizm w reakcjach endoergicznych lub przekształcana w energię użyteczną biologicznie. Substratami w procesie oddychania są głównie węglowodany, ale również białka i tłuszcze oraz inne związki organiczne. Dla tego procesu wyróżniane są następujące podstawowe mechanizmy: − oddychanie tlenowe: ostatecznym biorcą elektronów jest tlen cząsteczkowy − fermentacja: energia pochodzi w w większości przypadków z fosforylacji substratowej. Cześć bakterii przeprowadza procesy homofermentacji, gdzie głównym produktem jest kwas mlekowy. Natomiast na drodze heterofermentacjiwydzielają także kwas mrówkowy i octowy, dwutlenek węgla, oraz etanol. Homofermentacja opiera się na degradacji glukozy szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (EMP), a najważniejszym enzymem w powstawaniu produktu głównego jest dehydrogenaza mleczanowa. Na skutek dekarboksylacji pirogronianu powstają produkty uboczne, takie jak: dwutlenek węgla, octan i etanol, a ich ilość zależy od dostępu tlenu. Natomiast w procesie heterofermentacji rozkład glukozy przebiega zgodnie ze szlakiem pentozofosforanowym. Zdolność do heterofermentacji u bakterii mlekowych wynika z braku niektórych enzymów szlaku EMP, izomerazy trifosforanowej i aldolazy. − oddychanie beztlenowe: akceptorem elektronów są związki nieorganiczne takie jak siarczany, azotany i inne Rozkład węglowodanów Węglowodany są rozkładane w procesach, w których jony wodorowe (elektrony) są stopniowo przenoszone na składniki o wyższym potencjale oksydoredukcyjnym, z wydzieleniem energii gromadzonej w formie ATP. Drobnoustroje tlenowe wykorzystują tlen jako akceptor wodoru, natomiast beztlenowe muszą w tym celu wykorzystywać inne związki. Glukoza jest głównym źródłem energii dla drobnoustrojów. Jej rozkład przebiega według trzech podstawowych cykli (szlaków) metabolicznych: Glikoliza - szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (EMP) – to pierwszy etap utleniania heksoz. Najczęściej dotyczy glukozy, jednak inne cukry sześciowęglowe mogą wziąć udział w glikolizie. Jest charakterystyczna dla bakterii względnie beztlenowych (np. pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae) i beztlenowych. Poszczególne etapy drogi EMP powodują rozkład jednej cząsteczki glukozy do dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego, który jest kluczowym związkiem pośrednim w przemianach metabolicznych. Wpierw glikolizę poprzedza fosforylacja i wewnętrzna przebudowa cząsteczki glukozy, w wyniku czego staje się podatna na działanie enzymu rozszczepiającego ją na dwie cząsteczki cukrów trójwęglowych. Powstały w wyniku tego procesu aldehyd fosfoglicerynowy zostaje odwodorowany wskutek działania dehydrogenazy, która przenosi elektrony na NAD. W kolejnych krokach obejmujących fosforylację, uwodnienie i izomeryzację powstaje kwas pirogronowy. Podczas rozkładu jednej cząsteczki glukozy wytwarzane są cztery cząsteczki ATP. Jednak wstępne etapy przemian, fosforylacje cukru zużywają dwie cząsteczki ATP, ostateczny zysk netto to dwie cząsteczki ATP. Oddychanie tlenowe – cykl kwasów trikarboksylowych (cykl Krebsa) Najbardziej wydajnym energetycznie procesem jest, angażujące cykl Krebsa, oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do  oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha oddechowego. Kwas pirogronowy jest przekształcany do kwasu mlekowego oraz alkoholu etylowego i innych kwasów organicznych. Dochodzi do zakwaszenia środowiska, wydziela się przyjemny zapach, mogą powstawać duże ilości gazu (C02 i H2). W zależności od rodzaju produktu końcowego wyróżniamy fermentację mlekową, etanolową, octową, masłową, propionową, metanową i inne. Zdolność drobnoustrojów do fermentacji powinna być badana w testach bez dostępu tlenu. Przy identyfikacji wykorzystuje się fakt obniżenia pH i obecność gazu. Proces fermentacji jest bardziej złożony w przypadku wielocukrów. Wielocukry, za pomocą zewnątrzkomórkowych enzymów hydrolitycznych, są rozszczepiane do cukrów prostych, które dopiero po przejściu do wnętrza komórki ulegają przekształceniu w kwas pirogronowy. W przypadku laktozy (dwucukier złożony z glukozy i galaktozy połączonych wiązaniem galaktozydowym), bakterie wykorzystujące ten cukier (np. E. coli) muszą posiadać 2 enzymy: permeazę beta-galaktozydową, - enzym odpowiedzialny za transport galaktozydów przez ścianę komórki oraz beta-galaktozydazę- enzym hydrolizujący wiązanie beta- galaktozydowe. Uwolniona glukoza zostaje rozłożona na drodze EMP. Oznacza to, że bakterie niezdolne do fermentacji glukozy nie wytwarzają kwasu z laktozy. Natomiast bakterie nie fermentujące laktozy nie wytwarzają beta-galaktozydazy lub nie mogą rozłożyć glukozy. Bakterie określane jako tzw. późno fermentujące laktozę, wytwarzają beta-galaktozydazę, natomiast niska jest u nich aktywność permeazy beta- galaktozydowej. Szlak Entnera-Doudoroffa (ED) – stanowi szereg reakcji biochemicznych prowadzący do przekształcenia cząsteczki glukozy do dwóch cząsteczek pirogronianu. Jest to szlak alternatywny do glikolizy. W wyniku takiego przekształcenia powstaje po jednej cząsteczce ATP, NADH i NADPH. Końcowym produktem rozkładu glukozy jest woda. Nie powstaje gaz, a kwas glukuronowy i jego pochodne oraz kwasy wytwarzane w cyklu Krebsa (kwas cytrynowy i jego pochodne) nie są w stanie zmienić pH wskaźników stosowanych przy badaniu bakterii fermentujących. Występuje u niektórych bakterii, m.in. w obrębie rodzaju rodzaju Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Rhizobium oraz E. coli. Dzięki ED bakterie nie posiadające enzymów szlaku glikolizy mogą metabolizować glukozę, a ponadto umożliwia metabolizm takich związków jak glukoniany, które mogą być zużywane nawet w obecności glukozy. Szlak pentozofosforanowy (szlak Warburga-Dickensa-Horeckera) - szlak metaboliczny w którym glukozo-6- fosforan jest utleniany do rybulozo-5-fosforanu oraz wytwarzany jest NADPH. Szlak ten charakterystyczny dla bakterii, które mogą rosnąć w obecności tlenu (bakterie tolerujące tlen), ale nie wykorzystują tlenu w procesach metabolicznych (np. Lactobacillus spp., Leuconostoc spp.).  Badanie metabolizmu drobnoustrojów Produkty metabolizmu i aktywność niektórych enzymów są pomocne w diagnostyce mikrobiologicznej. Do ich wykrycia stosuje się specjalne pożywki zawierające odpowiedni substrat i wskaźnik, który pozwala rozpoznać czy nastąpił rozkład badanego związku. Najczęściej stosowane wskaźniki przedstawia Tabela 1. Tabela 1: Wybrane stosowane do wykrywania zmian pH środowiska Wskaźnik Zabarwienie w zależności od wartości pH podłoża środowisko kwaśne środowisko obojętne środowisko zasadowe Błękit bromotymolowy żółty zielony niebieski Czerwień fenolowa żółta amarantowa czerwona Czerwień obojętna czerwona bezbarwna żółta Czerwień metylowa czerwona żółta Czerwień krezolowa bezbarwna bezbarwna fioletowa Purpura bromo-krezolowa żółta fioletowa Przykłady: 1. Zdolność do rozkładu węglowodanów wykrywa się na podłożach płynnych lub stałych. Kwaśne produkty fermentacji powodują zmiany zabarwienia charakterystyczne dla danego wskaźnika, natomiast produkty gazowe (CO2,H2) można zaobserwować w dodanej do podłoża płynnego probówce Durhama (pęcherzyk gazu) (Ryc. 5). Podłoże zawiera składniki odżywcze niezbędne do wzrostu bakterii, węglowodany służące do określenia zdolności fermentacyjnych mikroorganizmów oraz błękit bromotymolowy jako wskaźnik pH. Podłoże ma barwę niebieską w pH 7 oraz zmienia się do żółtej w lekko kwaśnym pH 6,8. Po inkubacji węglowodany, które uległy fermentacji powodują zakwaszenie i zmianę barwy wskaźnika na żółtą, co oznacza reakcję pozytywną. W niektórych przypadkach, produkcji kwasu towarzyszy wydzielanie gazu (C02), które będzie widoczne w bąbelku w dole rurki Durhama. Drobnoustroje, które nie są zdolne do fermentacji węglowodanów nie zmienią zabarwienia wskaźnika, podłoże pozostanie niebieskie, nie będzie jednoczesnego wydzielania się gazu. Jest to negatywna reakcja. Rozkład cukru z Bulion do określania Brak rozkładu cukru wytworzeniem gazu zdolności fermentacyjny z probówką Durhama Wykrywanie zdolności do rozkładu cukrów i wytwarzania gazu. 2. Badanie zdolności rozkładu glukozy i laktozy oraz wytwarzanie siarkowodoru na podłożu Kliglera. Podłoże zawiera glukozę i laktozę, tiosiarczan i jony żelaza, które są wskaźnikiem wytwarzania H2S, oraz wskaźnik pH. Rozkład cukrów przejawia się zakwaszeniem i zażółceniem wyjściowo łososiowego podłoża. Skos łososiowy + słupek żółty = rozkład glukozy, skos żółty + słupek żółty = rozkład laktozy. Wytwarzanie w czasie fermentacji cukrów dużej ilości CO2 lub H2 uwidacznia się przez rozerwanie lub unoszenie podłoża. Tworzenie H2S z tiosiarczanu powoduje powstanie czarnego strątu siarczku żelaza. Badanie zdolności rozkładu glukozy i laktozy oraz wytwarzanie siarkowodoru na podłożu Kliglera. Probówka: 1 – rozkład glukozy i laktozy, obecność gazu; 2 – rozkład glukozy; 3 – wytwarzanie H2S. 3. Wytwarzanie amoniaku, który jest produktem rozkładu mocznika przez ureazę bakteryjną można wykryć na podłożu Christensena. Bakterie wytwarzające enzym ureazę rozkładają mocznik do NH3 oraz CO2, w wyniku czego następuje alkalizacja podłoża i zmiana zabarwienia wskaźnika - czerwieni fenolowej z żółtej na amarantową. Identyfikacja wytwarzania ureazy na podłożu Christensena przez komórki bakteryjne. Probówka: 1 – brak wytwarzania ureazy; 2 – wytwarzanie ureazy. 4. Wykrywanie rozkładu tryptofanu do indolu. Zawarty w podłożu tryptofan za pośrednictwem tryptofanazy przekształcany jest w indol, kwas pirogronowy i NH3. Indol wykrywa się metodą Kovacsa nakrapiając po 24 godzinnej inkubacji, na hodowlę odczynnik Ehrlicha. Pojawienie się czerwonej obrączki świadczy o dodatniej reakcji. Badanie wytwarzania tryptofanazyprzez komórki bakteryjne. Probówka: 1 – kontrola; 2 – wytwarzanie tryptofanazy 5. Badanie właściwości sacharolitycznych. Próbę przeprowadza się na buforowanym podłożu Hugha-Leifsona. Podłoże zawiera 1% węglowodanu i błękit bromotymolowy, który w obojętnym pH ma barwę zieloną. Badany szczep posiewa się do dwóch probówek z podłożem, jedną z nich pokrywa się parafiną. Zmiana barwy (po inkubacji) pożywki z zielonej na żółtą w probówce nie pokrytej parafiną – warunki tlenowe i brak zmian w probówce pokrytej parafiną (warunki beztlenowe) świadczy o utlenianiu węglowodanu. Zmiana barwy na żółtą w obu probówkach to wykorzystanie cukru na drodze fermentacji. Proces ten jest niezależny od tlenu i zachodzi zarówno w warunkach tlenowych i beztlenowych. Badanie właściwości sacharolitycznych na podłożu Hugh-Leifsona. Probówka: 1 i 2 - reakcja ujemna 3 i 4 –.reakcja dodatnia (fermentacja)  PODŁOŻA BAKTERIOLOGICZNE W laboratorium mikrobiologicznym do hodowli i diagnostyki drobnoustrojów stosuje się różne podłoża – mieszaniny związków chemicznych, w których lub na których rozmnażają się drobnoustroje. Możemy je podzielić: 1. W zależności od konsystencji na: Płynne np.: bulion mózgowo-sercowy (BHI), bulion tryptozowo-sojowy (TSB) Półpłynne (agar 0,25%) Stałe (agar 2,5%, żelatyna 10%) 2. W zależności od składu na: Syntetyczne – znany skład ilościowy i jakościowy Półsyntetyczne – znany skład związków nieorganicznych często są to podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych lub zwierzęcych Naturalne – skład jakościowy i ilościowy znany w przybliżeniu, przygotowane wprost z surowca roślinnego lub zwierzęcego 3. W zależności od ilości i jakości składników odżywczych na: Proste (podstawowe) – bulion zwykły, woda peptonowa Wzbogacone – zawierające substancje wzbogacające, np.: bulion z 2% glukozy; bulion z krwią baranią Wybiórczo-namnażające – zawierają składniki hamujące wzrost niektórych gatunków bakterii i stwarzające korzystne warunki rozwoju innym gatunkom bakterii np.: bulion z żółcią (dla pałeczek Salmonella spp.), Wybiórczo-różnicujące – umożliwiają określenie swoistych cech biochemicznych gatunków drobnoustrojów. Pożywki stałe zawierające odpowiednie wskaźniki dzięki czemu kolonie drobnoustrojów mają różne kolory. Bakterie wykazują różnice wynikające z właściwości metabolicznych, np. podłoże Chapmana – dla gronkowców, podłoże MacConkeya – dla pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae, podłoże SS dla pałeczek z rodzaju Salmonella, podłoże Endo – dla pałeczek Escherichia coli Specjalne –– z dodatkiem weglowodanów lub innych specyficznych substratów, przeznaczone do hodowli bardzo wybrednych drobnoustrojów np.: pożywka Lőwensteina – Jensena – dla prątków gruźlicy, Lőfflera – dla maczugowców błonicy Inne: podłoża transportowe – stałe lub półpłynne, stosowane przy przesyłaniu materiałów klinicznych do laboratorium. Zawierają sole mineralne i bufory, które zabezpieczają żywotność drobnoustrojów obecnych w materiale, bez wpływania na ich skuteczność. podłoża transportowo-wzrostowe – służą do bezpiecznego transportu materiałów oraz namnażania bakterii. podłoża do hodowli bakterii beztlenowych – są wzbogacone i mają zdolność redukcji tlenu cząsteczkowego np. podłoże z tioglikolanem sodu.