Enzimas de Purificación: Métodos y Técnicas PDF

TEMA 4: MATERIAL DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS La Producción y purificación de enzimas no será igual si se hace en un Laboratorio (con un biorreactor de 3L) o de forma Industrial (con un biorreactor de 25.000L). 1. ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS: No existe una estrategia general para todas l...

TEMA 4: MATERIAL DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS La Producción y purificación de enzimas no será igual si se hace en un Laboratorio (con un biorreactor de 3L) o de forma Industrial (con un biorreactor de 25.000L). 1. ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS: No existe una estrategia general para todas las enzimas, por lo que depende de la propia enzima dicho proceso. Esta estrategia depende de: - Características de la enzima. - Pureza requerida. - Rendimiento. - Concentración inicial (más o menos abundante). Para realizar la purificación se encadenan métodos que implican: ➔ Una Rotura celular (en enzimas intracelulares) - Una etapa inicial de concentración (centrifugación, salting out, ultrafiltración) ➔ Una 1ª Cromatografía de intercambio iónico, de intercambio hidrofóbico y elección. ➔ Concentración de la enzima por ultrafiltración. ➔ Una 2ª Cromatografía (de filtración de gel, etc) ➔ Se vuelve a concentrar con una ultrafiltración final (a pequeña escala). 1.1 ESQUEMA GENERAL DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS Va a ver un seguimiento del proceso en cada etapa por medio de medir correctamente la cantidad total de proteína recuperada y la actividad enzimática recuperada. Se hará una electroforesis en gel. Ejemplo: proceso real de la producción de quimosina:  2. TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN DE ENZIMAS: 2.1. ELIMINACIÓN DE PARTÍCULAS SÓLIDAS: Se va a dar la eliminación de ácidos nucleicos que pueden precipitar, de restos celulares, de fragmentos de membranas y de células parcialmente lisadas. 2.1.1. Centrifugación: Se emplea en las etapas iniciales donde hay grandes volúmenes a tratar. Los equipos que se emplean son de diversas capacidades, diseños y con diferentes fuerzas centrífugas. Se dará la eliminación continuada de sobrenadante clarificado: de tal manera que hay una continua entrada del líquido que queramos centrifugar Las centrífugas utilizadas son las de Flujo Continuo, ya que nos permite trabajar con grandes volúmenes de material (de disco, de rotor tubular, cestillo). Todo el líquido que va entrando se va depositando y llenando la cámara, quedando lo de mayoer densidad abajo y lo de menor densidad arriba. Se crea una corriente de densidad. Lo más denso (restos celulares, precipitados…) sale al exterior y el líquido se va clarificando. Nunca se mezcla el líquido que ya se ha centrifugado con el que entra para centrifugar, esto nos permite trabajar de forma continua. 2.1.2. Filtración: Eliminación de partículas sólidas Los volúmenes de líquido que se filtran son muy grandes y se da a través de un medio filtrante y una retención del material sólido. La velocidad de filtración depende de la diferencia de presión, la resistencia al paso de líquido (si es muy viscoso ejerce más resistencia), la velocidad del líquido y la resistencia del material de depósito (torta de filtración). Los agentes filtrantes utilizados son: tierra de diatomeas, tejidos naturales o sintéticos y polímeros. Los tipos de medios de filtración son: placas, prensa o tambor giratorio.  Filtros de Tambor Rotatorio: Al principio se filtra de forma muy rápida, sin embargo, cuando ya se va formando la torta de filtración (lo que va quedando en el filtro) va a ofrecer una gran resistencia. Hay una cuchilla raspadora, una zona de lavado y otra de reciclado de sólidos (la que recicla la torta de filtración). Lo que se va a recuperar es el líquido y retirando el sólido evitaremos que se saturen los poros. 2.1.3. Filtración Tangencial: El flujo de líquido a filtrar forma un ángulo recto con la dirección de filtración. Lo que minimiza el bloqueo del filtrado por una velocidad insuficiente del flujo. Los tipos de membranas para la filtración tangencial son: - Isotrópicas: propensas al bloqueo por proteínas y detritus. - Estructura asimétrica: menor propensión al bloqueo y ensuciamiento. 2.1.4 Floculación: Se añade un agente floculante para unir las partículas para formar agregados. Éste está presente desde el principio del proceso o es adicionado más tarde. Se aplica para la eliminación de células enteras. Este proceso se va a combinar con procesos de centrifugación. Algunos agentes floculantes son: - Polímeros naturales: gelatinas. - Polímeros sintéticos: poliacrilamida o sulfato de poliestireno. - Sales inorgánicas de aluminio, hierro, calcio (CaCl2) Los Criterios para elegir un agente floculante son: - Agente floculante de pequeño tamaño. - Que no produzca inhibición/inactivación de la enzima. - Que no produzca interferencia con procesos posteriores (inmovilización). 2.1.5. Coagulación: Parecido a la floculación, lo que pasa es que aquí se unen las partículas en función de las cargas: Adhesión de unas partículas a otras directamente por neutralización de cargas, interacciones electrostáticas entre unas partículas y otras. Este proceso se va a combinar con procesos de filtración. Se añaden agentes coagulantes como ácidos tánicos (0.1%-1%). Estos agentes tienen que evitar que puedan insolubilizar las enzimas. Las aplicaciones de este método son la eliminación de células enteras, restos celulares y proteínas solubles. 2.2. ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: Los ácidos nucleicos como el ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN (ácido ribonucleico) van a actuar como contaminantes. Son polímeros solubles y van a incrementar la viscosidad del medio y va a haber una dificultad a la hora de manipular los materiales. Sus métodos de eliminación son: desnaturalización, precipitación y nucleasas. 2.2.1. Desnaturalización: Los mecanismos de actuación de los fenómenos de desnaturalización son por fenómenos físicos: fuerza de cizalla (agitación), pH elevado y baja fuerza iónica. 2.2.2. Precipitación: Formación de complejos con grupos fosfato (-) del ácido nucleico y grupos (+) del agente precipitante. Para eliminar el precipitado formado, se realiza una centrifugación. Hay diferentes tipos: 1. Bromuro de centrimetilamonio: es un detergente catiónico y su acción depende del pH, de la concentración que haya y de la relación: [ácido nucléico]/[Bromuro de cetrimetilamonio] Por ejemplo: 500mg; pH 7.0; Tº 20ºC y Ratio 1-2. 2. Sulfato de estreptomicina, sulfato de protamina, cloruro de magnesio: Su acción depende de la concentración de sal. 3. Polietilenoimina (otro polímero catiónico) el cual es muy eficaz en la precipitación de ADN-ARN (96%-89%). 2.2.3. Nucleasas: Hidrólisis de ADN (DNAsa)y ARN (RNAsa) hasta nucleótidos. 2.3. PRECIPITACIÓN/CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS: 2.3.1. Ajustes de pH: Un ajuste de pH va a poder provocar la destrucción de la carga eléctrica de la enzima y por tanto, la destrucción de la capacidad de interactuar con el agua. Cada enzima presenta un punto isoeléctrico (pi) específico (pH específico en la cual la carga neta es 0). - Las proteínas son moléculas anfotéricas, por lo que pueden aportar cargas positivas, negativas o carga neta dependiendo del pH del medio. - La carga neta de la enzima depende del pH del medio, así como de su efecto sobre los grupos ionizables. A pH>pi 🡪 Los aminoácidos forman aniones. A pH0ºC, en soluciones concentradas disminuye la solubilidad Sulfato amónico (NH4)2SO4: La finalidad de usar esta sal es la purificación de las enzimas, la concentración de enzimas y la precipitación selectiva. Puede emplearse como un paso inicial en los que los esquemas de purificación y reducir el volumen de proteína no deseada. Se emplea por sus características: Gran solubilidad, ausencia de efectos perjudiciales para las enzimas, bajo coste y un cierto efecto estabilizante de las enzimas. Se añade lentamente a una mezcla que contiene las proteínas de interés. Salting-In: A bajas concentraciones, la sal añadida normalmente incrementa la solubilidad de las macromoléculas cargadas debido a que la sal reduce las interacciones electrostáticas. Bajas concentraciones de sal previenen la agregación y por tanto la precipitación de las proteínas. A medida que la concentración de sal aumenta, la proteína se hace MÁS soluble.  Salting-Out: A altas concentraciones la sal añadida disminuye la solubilidad de las macromoléculas debido a que compite por el solvente (H20) necesario para solvatar las macromoléculas. Altas concentraciones de sal eliminan la esfera de solvatación de las moléculas de proteína y precipitan. Una adición adicional de sal REDUCE la solubilidad de las proteínas. Otras Sales: Sulfato Sódico (Na2SO4). No es corrosivo y presenta una menor solubilidad (aumento de la TºC a 35ºC para conseguir una solubilización similar al sulfato amónico). *Diferentes proteínas precipitan a diferentes concentraciones de sal. Factores que dependen de la precipitación de proteínas: pH, Temperatura, Concentración de proteínas y sal empleada. ○ Inconvenientes: corrosión de materiales a altas concentraciones, con lo que hay necesidad de eliminarlos con procesos de diálisis y ultrafiltración. ○ Otras sales → Sulfato sódico (Na2SO4): no es corrosivo, tiene menor solubilidad (aumento de temperatura a 35ºC para conseguir una solubilización similar al sulfato afónico) 2.3.3. Solventes: La reducción de la constante dieléctrica del medio conlleva un incremento las fuerzas de atracción entre proteínas y hace que precipiten. La Solvatación es la sustitución del agua de la esfera de hidratación de la enzima. Se da una disminución de la solubilidad. La deshidratación se dará por la interacción disolvente-agua. Algunos solventes son: metanol, 2-propanol, etanol, acetona y dietiléter. Las características de estos solventes son: - Necesidad de trabajar a bajas temperaturas ( SO42- > CH3COO- > Cl- > Br- > NO3- >>> SCN- Cationes, NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ >>>> Mg2+ > Ca2+ > Ba2+. (NH4)2SO4 es la sal más usada para aumentar las uniones hidrofóbicas. Es una cromatografía muy específica por lo que al principio se eluye todo lo demás y al final se eluye nuestra proteína de interés. Al ser tan específica no se va a usar de forma industrial. 2.5. SEPARACIÓN ACUOSA BIFÁSICA: Son sistemas acuosos en dos fases: - Solución acuosa de dos polímeros (PEG y dextrano) - Solución acuosa de un polímero y una sal (PEG y fosfáto potásico) En la fase superior (Rica en PEG) se presentan las proteínas hidrofóbicas y en la fase inferior las proteínas hidrofílicas. Las aplicaciones de la separación bifásica son: - Separación de restos celulares. - Enriquecimiento para posteriores pasos de purificación. - Concentración y purificación de proteínas en baja concentración de solución. La operación a seguir es: Mezcla y equilibrado y finalmente una separación. Kpart = Ctop/Cbottom In Kpart = ln Keléctrica + ln Khidrofóbica + ln Khidrofílica + ln Kconformación + ln Kde otros factores 3. PREGUNTAS EXAMEN: Pregunta tipo test: Tenemos una proteína o una enzima que queremos ayudar y mediante un mecanismo de adición de sales precipitan las proteínas. Mido la actividad en el sobrenadante, detectó la presencia de proteínas pero no hay actividad enzimática. ¿Qué hago? Continuar con el sobrenadante Continuar con el sedimento Empezar desde el principio Retirarse del laboratorio Si veo que hay proteína pero no actividad, lo que hay que hacer es continuar con el sedimento. Después habrá que buscar otra técnica para determinar la actividad de la enzima.  TEMA 5: BIORREACTORES ENZIMÁTICOS 1. BIOREACTOR El biorreactor es un recipiente en el que tiene lugar una reacción catalizada por enzimas libres o inmovilizadas y en el que existen sistemas para la toma de muestras y el control de la reacción. Las consideraciones para el diseño de un biorreactor son: El biorreactor debe permitir un control de pH y temperatura, para hacer que las enzimas trabajen a máximo rendimiento. Tiene que ser capaz de eliminar gases que se puedan producir durante la reacción o en el caso de que se necesite aire que lo pueda proporcionar. Es decir, tiene que ser capaz de suministrar y eliminar compuestos gaseosos. Posible presencia de partículas sólidas. En el caso de que haya una enzima inmovilizada sobre partícula sólida, hay que tener en cuenta que esto va a estar dentro del bioreactor. No es lo mismo biorreactor de lecho empaquetado o de tanque agitado, en el biorreactor de tanque agitado el choque entre palas de agitación y partículas sólidas puede hacer no solo que se rompa la partícula sólida sino también que la enzima deje de estar inmovilizada y se separe de soporte. Hay que tener en cuenta la estabilidad química y biológica de sustratos y productos. En la formación de jarabes de fructosa o glucosa nos encontramos que las reacciones que se catalizan son muy fáciles de visualizar, una amilosa o una amilopectina, y en la siguiente etapa encontraremos que nuestras dextrinas van a ser hidrolizadas hacia la formación de glucosa, en condiciones adecuadas la formación de producto irá desde dextrina a glucosa, pero en el caso de que las condiciones tanto tiempo de reacción como dosis de enzima se alteren y no sean las óptimas se forman productos de reversión haciendo que se reduzca la eficacia de nuestro bioreactor. En el caso de trabajar con enzimas inmovilizadas hay que pensar cómo mantener la productividad constante, esto lo conseguimos si en nuestro biorreactor hay posibilidad de recambio de biocatalizador, evitando quedarnos sin enzima o que ésta se separe del soporte. También hay que tener en cuenta a la hora de diseñar un bio-reactor la existencia de inhibición por sustrato o productos. En la imagen aparece un tanque agitado no hay inhibición por producto, en un lecho empaquetado sí que hay. También hay que tener en cuenta el tamaño de la operación y el uso del producto a la hora de elegir el bio-reactor. Sus funciones son por tanto retener la enzima libre o el complejo inmovilizado una vez que termina la reacción y asegurar un contacto eficiente y controlado entre catalizador y sustrato. Su finalidad es conseguir una máxima formación de producto en poco tiempo, con el reactor del menor tamaño posible y con coste mínimo. Obtener gran cantidad de producto en el menor tiempo, coste y volumen. Los biorreactores trabajan a temperatura y presión bajas, consumen poca energía. 2. DIFERENCIAS ENTRE REACTOR QUÍMICO, REACTOR ENZIMÁTICO Y FERMENTADOR Las características fundamentales de un reactor enzimático es que trabajan a temperatura (las enzimas sin llegar a hablar de extremozimas trabajan entre 35-40ºC) y presión moderadas y consumen poca energía. Además no son autocatalíticos. No hay que confundir un reactor químico con un reactor enzimático ni con un fermentador, ya que el reactor químico funciona a altas temperaturas y a altas presiones para que la reacción sea más rápida; y el fermentador funciona a temperaturas y presiones moderada y es autocatalítico (el propio crecimiento microbiano hace que tenga esa curva característica). 3. CLASIFICACIÓN DE LOS BIO-REACTORES A) Según el contenido del bio-reactor se puede clasificar en: Homogéneo, misma fase de reacción. Heterogéneo, hay más de una fase, puede darse en aquellos en los que tenemos nuestro medio de reacción y la enzima inmovilizada. B) Según su modo de operación: Discontinuo: trabajan ‘por cargas’, primero se llena el bio-reactor con el medio de reacción , se añade la enzima que se encuentra inmovilizada en el biorreactor, se deja que transcurra la reacción durante un tiempo y se recoge el producto. Continuos: en ellos se forman los productos y a medida que se van formando van saliendo. Son los ideales. La reacción se da de manera continua. C) Según su geometría se clasifican en: Tanque. Columna, en los cuales el catalizador se encuentra inmovilizado D) Grado de mezcla. En función de esto se clasifican en: Mezcla completa. En este bio-reactor hay un constante estado de agitación. La composición de reactivos varía con el tiempo, no con la posición. A medida que pasa el tiempo y la reacción se va produciendo la concentración de sustrato disminuye, la de productos aumenta y la efectividad también va disminuyendo debido a la disminución de reactivos.  Flujo de pistón. En este bio-reactor hay un movimiento fluido a lo largo del reactor. La composición varía con la posición, no es dependiente del tiempo. A medida que la posición va cambiando y va atravesando el reactor la efectividad va disminuyendo debido al descenso de la concentración de sustrato. A medida que va avanzando aumenta la concentración de producto y disminuye la de sustrato. 4. ECUACIONES Para cada uno de estos biorreactores se puede estimar su producción utilizando las siguientes ecuaciones: En los bio-reactores discontinuos como hay una entrada y salida, se tiene en cuenta el tiempo de operación y el volumen. En cambio en los de flujo de pistón se tiene en cuenta la posición donde se mide. De modo general a la hora de trabajar se van a utilizar bio-reactores continuos o bio-reactores discontinuos. 5. BIO-REACTORES DISCONTINUOS Los discontinuos los podemos usar tanto enzima libre como inmovilizada, pero hay que hacer que la enzima inmovilizada no se pierda al final del proceso catalítico. Se trabaja por lotes, inicio, tiempo de reacción y parada. En ellos se llena el bio-reactor con el medio de reacción que contiene sustrato a transformar, se añade la enzima libre o inmovilizada y se inicia la reacción en tanque agitado, se deja un tiempo determinado para obtener la cantidad de producto necesario, se recoge el producto y se hace un vaciado del bio-reactor, iniciando de nuevo el proceso. El modo de utilizarlo puede ser muy diverso: Podemos tener tanques agitados con enzimas solubles. Estos son los bio-reactores más sencillos, un tanque de acero inoxidable con sistemas de agitación, palas, sistemas de control… donde se añade la enzima en forma soluble. Estos mismos tanques agitados pueden operar con enzima inmovilizada, enzima inmovilizada que va en el medio de reacción o inmovilizada en distintas partes del bio-reactor, como puede ser en las palas de agitación o en los deflectores. Los reactores discontinuos son grandes tanques de agitación que disponen de sistemas de entrada, sistemas de agitación, sistemas de control de temperatura y pH, en el cual se desarrolla la reacción mediante la agitación de las aspas del bio-reactor. Una vez que se da por concluida la reacción lo que se hace es vaciar el bio-reactor y separar el producto y la enzima. En la producción de etanol se utilizan estos tanques. El final de la reacción se produce con el vaciado y separación de producto y enzima. Se utilizan para: 1) Reacciones en las cuales se utilizan enzimas solubles de bajo coste, por ejemplo en la hidrólisis de almidón o producción de queso. 2) Sustrato de consistencia sólida o coloidal (no son apropiados cuando se utiliza la enzima inmovilizada) 3) No son adecuados para procesos integrados 6. BIO-REACTORES CONTINUOS A diferencia de los reactores discontinuos, en los continuos hay una constante entrada de sustrato y salida de producto. En el tanque agitado y flujo discontinuo, en el que el flujo de sustrato entra por debajo, se va produciendo la mezcla como consecuencia de la velocidad de flujo y de la interacción con el soporte inmovilizado y por último contacto entre sustrato y enzima. En los de tanque agitado y flujo continuo se produce una entrada continua de sustrato, se transforma en producto y se adecua la velocidad de salida del producto con la de entrada del sustrato. Los tiempos de residencia son los que van a determinar el nivel de transformación que vamos a tener, si todo esto discurre muy rápido la corriente de producto también contendrá sustrato entonces hay que averiguar la corriente de entrada y salida ideal. La salida se puede, incluso, reciclar para que vuelva a entrar al interior. Hay multitud de diseños, dependiendo de cómo queramos trabajar, entre algunos de ellos se encuentran: Reactores de tanque agitado que son reactores discontinuos de mezcla total. Tanque agitado y alimentación continua, que son bio-reactores continuos y de mezcla total. Lecho empaquetado y con recirculación. Además los bio-reactores no tienen porqué trabajar de modo único sino que pueden trabajar en serie. En los bio-reactores de lecho empaquetado, el sustrato permanecerá un determinado tiempo dentro de la columna y lo que sale es una corriente de producto, pero si en este tiempo de residencia no se consigue transformar todo el sustrato en producto se pueden hacer dos cosas: aceptar el porcentaje de conversión que se ha obtenido, recircularlo de tal forma que el sustrato puede transformarse nuevamente o diseñar distintas columnas de modo que no va a entrar nunca en el interior el producto formado. En estos bio-reactores lo que tenemos, a diferencia de los discontinuos, es que el biocatalizador se mantiene dentro del reactor. Lo único que se hace es añadir una corriente de sustrato y recoger el producto a medida que se va produciendo. Lo que se ajusta son las velocidades de entrada con las velocidades de salida, de tal forma que siempre se está formando producto. Además son los tanques más adecuados para procesos de integración (en serie). El catalizador se mantiene en el bio-reactor mediante: La inmovilización de la enzima sobre un soporte y ya veremos como evitamos que salga Utilizar una enzima de forma soluble y tener una unidad de ultrafiltración en la salida que permita la salida del producto pero no del catalizador. En estos bio-reactores controlamos la productividad y el porcentaje de conversión: Ajustando la concentración de sustrato Ajustando la velocidad de flujo, es decir, la velocidad a la que entra y sale, para que a la enzima le dé tiempo a transformar sustrato en producto Manteniendo una actividad del catalizador constante. Por ejemplo, si nuestro biocatalizador se va perdiendo lo que tenemos que hacer es incorporar más biocatalizador para mantener la productividad. Los bio-reactores continuos se clasifican en 4 tipos en función de su diseño: ✔ B.1 Reactores de tanque agitado y flujo continuo (TAFC). ✔ B.2 Reactor de lecho empaquetado. ✔ B.3 Reactores de lecho fluidificado. ✔ B.4 Reactores de fibra hueca. 6.1. TIPOS DE BIO-REACTORES EN FUNCIÓN DE SU DISEÑO ➔ B.1 Reactores de tanque agitado y flujo continuo (TAFC). Es un tanque agitado de grandes dimensiones. En él disponemos de un catalizador que está dentro del bioreactor, también hay una corriente de sustrato y dispone de un sistema de retención del catalizador que puede ser mediante procesos de filtración, sedimentación, fuerzas magnéticas o fijación de la enzima inmovilizada a distintas partes del bio-reactor como deflectores o aspas de agitación. Características: Son de fácil construcción y control. Es fácil sustituir el catalizador gastado, si va fijado a las palas solo hay que sustituir el catalizador que está fijado o si el catalizador se mantiene por filtración sedimentación o fuerzas magnéticas lo que hay que hacer es añadir más catalizador. Uno de los problemas con las enzimas inmovilizadas es que se podía producir pérdidas por limitación de difusión internas, pero problemas de difusión interna en estos tanques se evitan incrementando la agitación. Por tanto hay un buen mezclado reduciendo las limitaciones de difusión. Permiten el uso de sustrato sólido o coloidales Posibilidad de bio-reactores en serie. Inconvenientes No es adecuado para enzimas inmovilizadas por método frágil. Tienen un elevado volumen vacío, solo un 2% del bio-reactor está ocupado por el catalizador. Por tanto necesitan un gran tamaño, tienen una productividad global baja y el porcentaje de conversión de sustrato en producto es también bajo. Se puede producir inhibición por producto, ya que hay que dejarlo bastante tiempo de residencia para que se transforme el sustrato en producto y las enzimas pueden verse inhibidas por producto. ➔ B.2 reactor de lecho empaquetado Estos reactores están formados por una columna que tiene la enzima inmovilizada. Características Son de pequeño tamaño en comparación con los de tanque agitado. Tienen una elevada productividad, la cantidad de producto que se obtiene por tamaño de reactor y por tiempo va a ser elevada. Incluso en el caso de que se produzca inhibición por producto. Pequeño volumen vacío, casi toda la columna está ocupada por la enzima inmovilizada. El volumen vacío será el espacio entre las partículas. Facilidad de automatización Los soportes deben de ser rígidos para inmovilizar bien la enzima. Inconvenientes Cuando la enzima pierde actividad es de difícil sustitución, la única opción es cambiar la columna por otra. Es difícil controlar las condiciones ambientales como el pH en los diferentes puntos de la columna. Costes de fabricación altos. No son aptos para líquidos con partículas o muy viscosos, se produce bloqueo de flujo y canalizaciones, aumentando la presión y si aumenta la presión en la columna se producen compactaciones. Variables Control de transformación de sustrato en productos: La velocidad de flujo va a ser la responsable de la mezcla sustrato-enzima, y así solventamos los problemas de difusión limitada que tenían las enzimas inmovilizadas. Mayor velocidad, mayor contacto enzima-sustrato.  Pero si aumentamos demasiado la velocidad de flujo el sustrato pasa tan rápido que no se transforma en producto, disminuyendo la productividad y la tasa de conversión. Aumento de la longitud del reactor para evitar problemas de compactación. Reciclaje de flujo. Opción para conseguir transformar todo el sustrato que ha pasado a través de la columna y no ha sido transformado para que si pueda transformarse en producto. Podemos tener inhibición por sustrato. ➔ B.3 reactores de lecho fluidificado Características Es similar al de lecho empaquetado, pero aquí la enzima inmovilizada solo ocupa una parte del bio-reactor y lo que se utiliza es un chorro de solución de sustrato a gran presión que mueve (fluidifica) la enzima inmovilizada. Así con esta alta velocidad no se forman canales ni compactaciones. Es posible el empleo para sustratos coloidales o sólidos. Inconvenientes Alto gasto energético Dificultad de predicción de prestaciones a gran escala. ➔ B.4 reactores de fibra hueca Estos bio-reactores están formados por unidades de ultrafiltración en las que se encuentra la enzima inmovilizada o de forma soluble (es posible el empleo con coenzimas). Esta enzima está separada del sustrato por una membrana semipermeable. El sustrato entrará a través de la fibra hueca, se produce la ultrafiltración a través del sustrato y posteriormente del producto. La enzima no puede salir por esa membrana de ultrafiltración pero el sustrato y producto si. Presenta un costo aceptable. Las configuraciones de estas fibras van a ser diversas dependiendo de la membrana que se necesite para el sustrato y producto. 7. EVALUACIÓN DEL RENDIMIENTO DE UN BIO-REACTOR El rendimiento de un bioreactor se evalúa con tres parámetros: Actividad Estabilidad Selectividad 7.1 ACTIVIDAD Es la cantidad (moles, kg, gr…) de producto que se forma por volumen de reactor (l, m3…) y por tiempo de operación (h, min…). → actividad volumétrica. Lo deseable es que tenga una elevada productividad, con un reactor lo más pequeño posible y en el menor tiempo posible. Se necesita una alta actividad cuando estemos trabajando con sustratos o productos inestables, ya que sino se pueden formar compuestos secundarios (no deseables). Los factores que afectan a la actividad de un reactor son: La temperatura de trabajo La concentraciones de enzima Actividad de la enzima o Actividad de la enzima nativa o Cantidad de enzima en el soporte o Actividad de la enzima inmovilizada La gráfica de la derecha es la actividad a diferentes temperaturas. 7.2 ESTABILIDAD Es el tiempo en el que la actividad del reactor decae a la mitad del valor inicial (vida media). Se necesitan reactores con una alta estabilidad, es decir, con una duración elevada para no tener que cambiar el biorreactor. Cuando la estabilidad del bio-reactor baja lo que se hace es una renovación de la enzima (poco frecuente), en el caso de que esté inmovilizada hay que separarla del soporte y volverla a inmovilizar, la enzima no inmovilizada solo consiste en añadir más enzima. 7.3 SELECTIVIDAD Es la proporción en que el producto deseado se encuentra frente al total de productos formados. Lo deseable es que tengamos una elevada selectividad, para que el sustrato se transforme en un solo producto no que se transforme en varios. Si realizamos un uso eficiente del sustrato obtendremos altos rendimientos. Si hay baja selectividad pues habrá que realizar procesos de aislamiento y purificación del producto. Ejemplo: hidrólisis de almidón Isomerización. En la imagen aparece la productividad de un reactor de lecho empaquetado con enzima (glucosa isomerasa) para formar glucosa y fructosa. En el gráfico se ve que el óptimo de trabajo de esta enzima son 60ºC. Pero un bioreactor a 60ºC necesita 220 días para conseguir su máxima productividad. Trabajando a temperaturas inferiores tiene menor productividad pero tarda menos tiempo, por tanto se consigue al final mayor formación de fructosa. La vida media a 55ºC es mucho mayor que a 60ºC puesto que la enzima es más estable. Hay que mantenerlo en temperaturas óptimas. Trabajando a 60 grados tenemos mucha conversión de producto, pero a 60 grados está trabajando la mitad de lo que podría trabajar, porque se está desnaturalizando la enzima. Por tanto habría que elegir si trabajar a temperatura más bajas para que el reactor dure mas y por tanto tener mas cantidad de producto a largo plazo, o trabajar a temperaturas más altas para producir gran cantidad de producto en poco tiempo, con el inconveniente de que el reactor nos durará menos y habría que cambiarlo. Sacarificación En la transformación de almidón en glucosa, la transformación de dextrinas a glucosas se llevan a cabo por la amiloglucosidasa, que rompe los enlaces alfa 1,4. Pero cuando los tiempos de residencia en el bio-reactor son mayores de lo normal la amiloglucosidasa en ver de producir glucosa, forma maltosa o isomlatosa, esto hace que del sustrato que son dextrinas obtengamos un 94 o 95% de glucosa cuando lo ideal sería el 100%.  8. COMPORTAMIENTO DE BIO-REACTOR CON FLUJO NO IDEAL Hay algunos bio-reactores que tienen un comportamiento no ideal, es decir, no siguen las ecuaciones anteriores. Entre las causas de que este reactor tenga un flujo no ideal, es decir, los valores teóricos no coincidan con los reales, son: No se produzcan mezclas homogéneas entre el sustrato y la enzima Se producen dentro del tanque agitado unas corrientes de convección, hay zonas frías y calientes, y las reacciones van a ir más rápidas en las zonas frías. Por canalizaciones, es decir, zonas en las que no hay flujo de sustrato. Si vemos que variantes afectan a cada uno de los tipos de reactores están: Lecho empaquetado. La presencia de partículas sólidas es lo que va a favorecer que se produzca el mezclado. o Variación de los tiempos de residencia, el tiempo que tarda una molécula de sustrato en atravesar la columna, esto va a forzar que los tiempos de contacto entre enzima-sustrato sean diferentes. Esto puede tener una serie de consecuencias: o Que se produzcan canalizaciones o Que haya gradientes de temperatura, en la zona donde la temperatura se acerque a lo óptimo habrá mas formación de producto. Reactores agitados. Las mezclas se van a conseguir con: o La velocidad de agitación, tiene que ser constante. o La viscosidad del sustrato también influye provocando la pérdida de la enzima inmovilizada por fuerzas como la de cizalla. o La presencia o ausencia de deflectores. o La concentración de partículas de biocatalizador. 9. PROBLEMAS EN EL RENDIMIENTO DE BIO-REACTORES 9.1 PÉRDIDA DE ESTABILIDAD La pérdida de estabilidad puede venir dada por: Inhibición irreversible que puede ser debido a sustancias presentes en el medio de reacción o desnaturalización por pH, temperatura o fuerza iónica del medio de reacción. En los tanques agitados el rozamientos mecánicos: agitación, flujo… produce pérdida de estabilidad Ataque microbiano Liberación del soporte: como consecuencia de condiciones del proceso. Autodigestión. Si se utilizan proteasas, estas se digieren a sí mismas. Esta estabilidad puede volverse a conseguir mediante: Regeneración de la actividad del biocatalizador. No siempre es posible (exceptuando enzimas con desnaturalización reversible). Se puede regenerar de varias formas, mediante: o Adición de enzima si estamos trabajando con enzimas solubles. o En enzimas inmovilizadas hay que hacer una desorción del enzima activo y posteriormente una inmovilización del enzima fresco (inmovilización por adsorción o enlace iónico) o Eliminación del biocatalizador inmovilizado y sustitución por uno nuevo. Mantenimiento de la productividad constante. Para conseguir una producción constante hay que adecuar la salida de productos del biorreactor con la actividad de los equipos de purificación y con el aislamiento de productos. Los métodos utilizados para mantener una productividad constante son: o Adición de catalizador fresco o Reducción de flujo (aumento de los tiempos de residencia) o Aumento de temperatura o Empleo de baterías de bio-reactores de distintas “edades”. 9.2 PROBLEMAS FÍSICOS 9.2.1 Abrasión Este problema se da frecuentemente en reactores agitados en los cuales las enzimas están inmovilizadas. También puede darse en lecho empaquetado. Las causas son: Aumento con la agitación Aumento con la velocidad de flujo Aumento con la porción de volumen ocupada por partículas del biocatalizador. Las soluciones posibles son disminución de la viscosidad del fluido y aumento de la rigidez del soporte. 9.2.2 Compresión/ Empaquetamiento Este problema se da en reactores que poseen columnas empaquetadas. Cuando se produce compresión: Hay una caída de presión en la columna Se produce la fricción entre el fluido y las partículas del soporte. Puede producir un bloqueo parcial por materiales particulados (partículas pequeñas en columnas largas y durante tiempo prolongado). Rotura de partículas por presión Efectos de los fenómenos de compresión y empaquetamiento: Pérdida en la actividad del biocatalizador Taponamiento de espacios vacíos y poros (lecho empaquetado) El grado de taponamiento va a venir dado por la presencia, cantidad, tamaño y naturaleza física y química. Métodos para evitar o disminuir la compresión y empaquetamiento: Utilizar partículas de soporte grande que no sean comprensibles, con pared lisa, esféricas, homogéneamente empaquetadas Fluidificar el lecho empaquetado regularmente cambiar el sentido del flujo Disminución de la relación altura diámetro. La solución es la clarificación de la solución del sustrato mediante filtración o centrifugación.  TEMA 6: INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS “Proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.” 1971. 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA Enzimas, células enteras u orgánulos celulares (o bien combinaciones de ellos) que se encuentran en un estado tal que permite su reutilización. Una enzima unida a un soporte para que sea insoluble, para que se pueda reutilizar y no pierda su actividad. Si para detener una reacción inactivásemos la enzima ya no se podría reutilizar. - Ventajas o Aumento de la estabilidad de la enzima (protección frente a cambios de pH, Tª, fuerza iónica, contaminación y acción de proteasas). o Posibilidad de reutilización del derivado (disminución de los costes del proceso) (una enzima inmovilizada no es eterna, tiene X usos). o Posibilidad de uso en procesos en continuo. o Facilidad de automatización. o Posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. - Inconvenientes o Alteración conformacional de la enzima respecto a su estado nativo, puede variar la actividad. o Heterogeneidad del sistema enzima-soporte: existencia distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte. o Pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización (desnaturalización por calor, cambios de pH, radicales libres…) o Más caro que la enzima nativa. o Mayor volumen ocupado por enzima inmovilizada que cantidades equivalentes en estado nativo, la enzima tiene que estar unida o dentro de un soporte. o Cambios en la cinética enzimática (alteraciones de la difusión del sustrato que afectan a la velocidad total de la reacción -tamaño, concentración, impurezas, agitación, etc-). 1. CONSIDERACIONES DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS 1) Consideraciones para inmovilizar una enzima. I. Modo de empleo (estanco o continuo). II. Disponibilidad y costo de la enzima. III. Necesidad de purificación del producto. IV. Coste del soporte. V. Economía del proceso de producción. VI. Naturaleza del sustrato. Los almidones gelificados son muy viscosos, es imposible que todos interaccionen con las enzimas inmovilizadas.  2) Factores a considerar con enzimas inmovilizadas. I. Inactivación térmica (por larga vida media de las enzimas inmovilizadas). Al estar fija en un punto son más sensibles al calor. II. Vulnerabilidad a niveles bajos de inhibidores irreversibles. III. Contaminación con organismos que ataquen al catalizador, al sustrato o al reactor. Más sensibles a la contaminación microbiana. 3) Otros factores a considerar. I. El proceso de inmovilización debe mantener intacta la estructura de la proteína y no bloquear el sitio activo. La inmovilización no debe unir el sitio activo al soporte. II. La unión al soporte debe ser muy estrecha. III. La enzima se debe ligar al soporte por sus grupos periféricos. 2. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN Características: Simple y reproducible. Suave, barato, seguro, versátil. Fácil de usar a gran escala. Útil en un amplio rango de condiciones. Aplicable a gran variedad de enzimas. Fácil control de la cantidad de enzima inmovilizada. Estabilidad de unión enzima-soporte. Factores para su elección: Naturaleza química y cinética de la reacción. Costos. Estabilidad física y química de los reactantes y enzimas. Efecto de la sobre la actividad y estabilidad de la enzima. 2.1 RETENCIÓN FÍSICA 2.1.1 Atrapamiento Se define como la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa. Matriz: Prepolímeros entrucruzables (poliacrilamida, colágeno, alginato, carragenato, resinas de poliuretano, dextrano). Proceso: 1) Suspensión de la enzima en una solución del monómero. 2) Polimerización: cambio de temperatura, adición reactivo químico. Tipos: o Atrapamiento en gel (enzima queda atrapada en el interior de un gel). o Atrapamiento en fibras (enzima ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética). (Más imágenes de atrapamiento en las diapositivas) ➔ Ventajas o Gran sencillez. o Requerimientos de enzima bajos. o Enzima no sufre ninguna alteración en su estructura ¿ escasa pérdida de actividad. ➔ Consideraciones o Control riguroso de las condiciones de polimerización. o Comprobar que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína. 2.1.2 Inclusión en membranas ➔ Microencapsulación ◆ Enzimas rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto pero no de la enzima. ◆ Encapsulación simultánea de gran variedad de enzimas, células o biomoléculas (reacciones en múltiples pasos). ◆ Las enzimas se usan en forma soluble. ◆ Se mejora la actividad y estabilidad térmica. ◆ Gran superficie de contacto enzima-sustrato.  ◆ Forma esférica (1-100 mm de diámetro): fibras, microcápsulas,liposomas, micelas invertidas. ◆ Inactivación en el encapsulado, gran requerimiento de enzima, pérdida de enzima. ➔ Reactores de membrana ◆ Membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial. ◆ Ideal para sustratos de alto peso molecular. ◆ Gran interés industria. ◆ Método: adsorción de la enzima sobre la membrana que formará el reactor: A) Mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la membrana. B) Por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana. 2.2 UNIÓN QUÍMICA 2.2.1 Unión a soportes Es la unión de enzimas a soportes mediante enlaces químicos. Propiedades del soporte: o Incrementar la afinidad por el sustrato. o Disminuir la inhibición. o Ampliar el intervalo de pH óptimo. o Reducción de las contaminaciones microbianas. o Resistencia mecánica adecuada a condiciones de operación del reactor y química a condiciones de trabajo. o Fácilmente separable del medio líquido: reutilización. Elección del soporte: - El coste y la disponibilidad del soporte (requerimientos por parte de la industria). - La capacidad de unión de enzima (cantidad de enzima unida por cada peso de soporte dado).  - La hidrofilia (capacidad de la matriz para incorporar agua): necesidad de ambiente acuoso por determinadas enzimas para el mantenimiento de actividad óptima y/o estabilidad. - La complejidad del proceso de inmovilización (uso de reactivos y/o condiciones caras o peligrosas). - La estabilidad de la matriz (resistencia a rotura por reactivos y la degradación por microorganismos). - El tamaño de la partícula del soporte (determina la extensión de las restricciones de difusión de la actividad enzimática, la caída de presión generadas en las columnas empaquetadas, la velocidad de flujo de fluido requerida para fluidizar las columnas y la potencia necesaria para suspender las partículas en los reactores con agitación). Soportes: o Características: naturaleza, tamaño, forma, densidad, porosidad. o Forma: láminas, tubos, fibras, cilindros, esferas. ➔ Ventajas de los soportes inorgánicos frente a los orgánicos Resistencia mecánica elevada Estabilidad térmica Resistencia a los solventes orgánicos Resistencia al ataque microbiano Facilidad de manejo Vida útil larga Facilidad de regeneración por pirólisis ➔ Factores que influyen en la unión enzima-soporte El pH del medio -controla en número y naturaleza de las cargas- La fuerza iónica La permeabilidad y área superficial La presencia de iones que actúan como cofactores 2.2.2 Adsorción Enzima unida a soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógeno. Factores: o pH del medio: control número y naturaleza cargas superficiales (proteína y sólido).  o Fuerza iónica: aumento fuerza iónica produce desorción de la enzima (unión iones inorgánicos más fuerte al soporte). o Diámetro de poro: (x2 tamaño del eje mayor de la enzima). o Presencia de iones que (cofactores de la enzima) incrementen la carga enzimática del derivado. ➔ Ventajas Preparación sencilla Bajo coste No cambios de especificidad enzimática Derivados estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua ➔ Inconvenientes Optimización de las variables que controlan la adsorción Derivados obtenidos poco estables desde el punto de vista mecánico Unión al soporte débil Vida media corta 2.2.3. Enlace iónico Formación de enlaces iónicos entre la molécula de enzima y el soporte (resina de intercambio iónico). Es una unión más fuerte que la adsorción química. Los soportes son polisacáridos o polímeros sintéticos activados con DEAE o carboximetilo. Si las condiciones se modifican favoreciendo la separación, perderemos la enzima inmovilizada. 2.2.4. Unión metálica o quelación Acoplamiento entre la enzima que contiene un metal como cofactor y un soporte activado con un metal de transición (titanio o zirconio). Soportes como vidrio, quitina, celita, ácido algínico, celulosa, gelatina. 2.2.5. Unión covalente Activación de grupos químicos (funcionalizado) del soporte para que reaccionen con aminoácidos de las proteínas. Algunos de los factores implicados en la formación del enlace covalente son los aminoácidos empleados (no del centro activo) para la formación de enlaces con el soporte como lisina, cisteína, tirosina, histidina, metionina, triptófano, arginina y ácido aspártico y glutámico. *Los aminoácidos en negrita son los que participan frecuentemente en las reacciones de formación del enlace covalente a pesar de no ser los más abundantes. El procedimiento llevado a cabo es el que se muestra a continuación: 1. Activación de los grupos funcionales del soporte (funcionalización) por un reactivo específico electrofílico → resina activada 2. Adición de una enzima. 3. Formación de un enlace covalente con los grupos nucleofílicos de los aminoácidos. Inhibidor centro reactivo ¿De qué manera podemos impedir que el centro activo forme parte del enlace covalente? Un ejemplo puede ser un inhibidor irreversible, sin embargo, lo que se lleva a cabo normalmente es lo siguiente: Un enlace covalente de la enzima en presencia de un sustrato o un inhibidor competitivo. También podemos usar una enzima modificada químicamente. El enlace se realiza a través de los nuevos residuos incorporados. Uso del zimógeno precursor. ➔ Ventajas: - Manipulación sencilla de los derivados inmovilizados - Tras la inmovilización la carga de enzima permanece constante - Utilización en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado  - Mayor resistencia a desactivación por temperatura, disolventes orgánicos o pH (estabilización estructura terciaria). ➔ Inconvenientes: - Necesidad de conocer densidad de grupos activos por unidad de superficie (condiciona número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos). - Inmovilización puede alterar la estructura del centro activo: Inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo. - La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc. 2.2.6 Reticulado/ Entrecruzamiento/ Cross-linking No se utiliza ningún soporte, se usan enlaces covalentes usando la propia enzima como soporte. Es la formación de enlaces covalentes entre las molécula de enzima, mediante reactivos bi o multi-funcionales ando agregados tridimensionales entrecruzados insolubles que no necesitan soportes adicionales. Los reactivos bifuncionales utilizados son: - Dialdehídos - Diiminoésteres - Diisocianatos - Sales de bisdiazonio - Diaminas Cualquiera de ellos puede unirse a la superficie de una enzima y al centro activo de la otra, inhibiendo el mismo. Los grupos funcionales con los que van a interaccionar los grupos bifuncionales son: - Grupos carboxilo que reacciona con la L-Lisina - Grupo diazo que reacciona con la L-lisina, L-tirosina, L-arginina o L-cisteína - Grupos isocianato que reacciona formando enlaces amida - Yoduros de alquilo que reaccionan con residuos nucleofílicos ➔ Ventajas: - Existen enzimas que poseen una elevada resistencia a condiciones extremas de pH y temperatura. - ➔ Desventajas: - Dificultad para controlar la reacción - Necesidad de grandes cantidades de enzima - No se utiliza toda la enzima porque el centro activo forma parte del reticulado o queda en el centro del agregado. 2.2.7. Co-reticulado: Entrecruzamiento de enzimas con proteína sin actividad catalítica y rica en residuos de lisina (ejemplo: albúmina bovina). Se eliminan pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales. Inmovilización de enzimas por adsorción sobre resina de intercambio iónico o soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional. 2.2.8. Cristales de enzimas reticulados (Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs): Cristalización de enzimas y posterior reticulado con glutaraldehído. Aumento de estabilidad Obtención de entramado cristalino: enzima rodeada por otras moléculas de proteína que actúan como soporte (estabilización de estructura terciaria por uniones covalentes). Canales microscópicos (20-50Å): paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima. Soportan temperaturas elevadas y pH extremos, asi acción de las proteasas.  4. COMPARACIÓN DE MÉTODOS→ LEER 5. ENZIMAS CO-INMOVILIZADAS Inmovilización conjunta de dos o más enzimas para formar catalizadores multifuncionales. Ventajas: - Más eficaces - Período más corto para alcanzar el estado estacionario Desventajas: - Encontrar las condiciones de operación válidas para las enzimas co-inmovilizadas 6. CO-FACTORES 6.1 COFACTORES INMOVILIZADOS Cofactores cargados (NADPH, ATP) se deben co-inmovilizar con la enzima. Presencia necesaria de otra enzima que regenere el cofactor. Reactores de membrana: Aumento del PM del cofactor por unión de una molécula de PEG. *El problema de los cofactores es que hay que regenerarlos. 7. CONCLUSIONES MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS No se afecta por pH, Puede modificarse el Unión covalente al fuerza iónica o sitio activo. soporte concentración de Procedimiento costoso. sustrato Enzima fuertemente Pérdida de actividad unida. enzimática durante la Entrecruzamiento Pérdidas de enzima inmovilización. improbables. No efectivo para sustratos macromoleculares Simple, sin modificación Pérdidas de enzima por de enzima. El soporte cambios de fuerza Adsorción puede regenerarse. iónica. Enzima sujeto a Barato ataque microbiano o proteolítico No hay modificación Problemas de difusión química del enzima. de S y P a y desde Enzima protegida frente centro activo. Atrapamiento a degradación Procedimiento complejo. microbiana o proteolítica A veces, pérdida de actividad. Pérdida de enzima No efectivo para S macromoleculares  TEMA 7: EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMA Todos los parámetros cinéticos que presenta la enzima en su estado nativo no son los mismos que presentará la enzima estando inmovilizada. Tras la inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones como la unión al soporte, reacción de los grupos reactivos con algún aminoácido del centro activo, cambios conformacionales o desnaturalización de la enzima (proteína). Para evaluar los resultados de la inmovilización enzimática es necesario estudiar la cinética de la reacción enzimática. Una enzima soluble presenta una cinética básica, normal, siguiendo el modelo de Michaelis-Menten, a esta la llamaremos cinética inherente. Una vez que la enzima ha sido inmovilizada se producirán cambios en la molécula, cambios estéricos y efectos de partición, alterando la cinética de la reacción, lo que denominaremos cinética intrínseca (Enzima inmovilizado en ausencia de factores modificantes). También se producen resistencias a la difusión que modifican la cinética de la reacción, que titularemos como cinética efectiva (Enzima inmovilizada en presencia de factores modificantes). Por tanto esta cinética inherente y la cinética efectiva no se parecerán en nada, se pueden por distintos procesos igualarlas. A continuación veremos todos los cambios que produce la inmovilización del enzima sobre la cinética de la reacción: 1. EFECTOS SOBRE LA ESTABILIDAD OPERACIONAL ENZIMÁTICA 1) Estabilización conformacional: de manera general, al inmovilizar una enzima aumenta considerablemente su estabilidad, debido a que existen uniones multipuntuales enzima-soporte. El Incremento en la estabilidad operacional del enzima se deben a una serie de factores: - La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o química. Además si añadimos un reactivo bifuncional a la unión multipuntual covalente del enzima con el soporte, estamos aumentando la estabilidad. 2) Una protección frente a proteasas del medio, ya que al unirse estas a un soporte elimina su capacidad proteolítica y evita su autolisis. 3) Evitación de la agregación intermolecular ya que las moléculas de la enzima están retenidas en una determinada región del espacio. 4) Alteración del microentorno de la enzima debido a la interacción de la enzima con el soporte, esto produce una disminución de la concentración de oxígeno disuelto por incremento de la fuerza iónica, el soporte puede tener un efecto tamponador, modificando ligeramente el pH del entorno del enzima. Además el soporte puede ser más o menos hidrofílico teniendo el enzima agua a su alrededor, estabilizándolo. Cuando medimos la efectividad de una enzima activa vemos una caída de su actividad, en una inmovilizada observamos un mantenimiento de la actividad hasta que en un determinado punto empieza a disminuir. Pero esa pérdida de actividad siempre va a ser menos que la que observamos en una enzima soluble. 2. EFECTOS SOBRE LA ACTIVIDAD Estos los dividimos en efectos sobre el biocatalizador y efectos sobre el microambiente: A la hora de inmovilizar la enzima, se pueden dar cuatro casos: 2.1. EFECTOS SOBRE EL BIOCATALIZADOR 2.1.1. Restricciones estéricas Una parte de las moléculas de enzima están inmovilizadas en una posición en relación con la superficie del soporte que hace inaccesible el centro activo al sustrato. La enzima está perfectamente inmovilizada pero hay una restricción en la cual el sustrato no accede al soporte. Esto producirá una pérdida parcial de la actividad catalítica. 2.1.2. Cambios conformacionales Darán lugar a modificaciones químicas de la enzima durante la inmovilización, que influyen en su actividad cuando están implicados o bien aminoácidos del centro activo o aminoácidos que contribuyen al mantenimiento de la estructura terciaria. Estos efectos conformacionales conducen a la pérdida total de la actividad catalítica, encontramos: o La unión al soporte imposibilita el acceso del sustrato al centro activo. o La participación o reacción de los grupos reactivos del soporte con algún aminoácido del centro activo o esencial para la actividad catalítica. o Las condiciones experimentales pueden provocar la desnaturalización o desactivación del enzima. o Cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva del enzima. Tabla donde una enzima es inmovilizada por diferentes soportes y métodos, y el porcentaje de esa enzima inmovilizada. 2.2. EFECTOS SOBRE EL MICROAMBIENTE *Este punto no tiene que ver con los aa de la enzima, sino del ambiente en el que se va a movilizar y las características de los soportes que vamos a utilizar. La enzima inmovilizada se mantiene en un medio físico muy diferente al existente en el grueso de la solución, es decir, la enzima está inmovilizada pero las condiciones en torno a la enzima son distintas a las del medio de reacción donde se encuentra el sustrato. Estos efectos conducen a la pérdida parcial de la actividad catalítica, encontramos: 2.2.1. Fenómenos de partición Ocurren cuando las concentraciones del sustrato o de otros compuestos relacionados con la actividad son diferentes en la superficie del soporte (sustancia que retiene directamente a la enzima inmovilizada) y en el grueso de la solución (sustancia donde se encuentra tanto la enzima como el sustrato). Cuando la enzima se encuentra en un soporte cargado, la diferencia de concentraciones entre la superficie y la solución se describe por un coeficiente de partición. Parámetros moleculares responsables de la partición: Esta diferencia de concentraciones puede darse por el tamaño de las partículas, las interacciones electrostáticas entre el sustrato y el medio de reacción e interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas que harán que el sustrato sea más o menos atraído hacia el soporte. Las modificaciones más importantes que producen estos fenómenos de partición son: cambios del pH en la proximidad de la enzima inmovilizada y alteraciones en la afinidad del sustrato. Si representamos la concentración de sustrato en torno a la enzima inmovilizada veremos que el medio de reacción tendremos una concentración y en torno al soporte donde está la enzima inmovilizada la concentración de dicho sustrato disminuye, esto provoca que la enzima trabaje a una menor concentración de sustrato. Desde el punto de vista de la cinética, la alteración de la afinidad con el sustrato produce cambios en la KM de la enzima inmovilizada y esto es debido al: Tamaño del sustrato y de los poros del soporte, A la naturaleza hidrofóbica/hidrofílica del sustrato y del soporte: - Si el soporte es hidrofílico, atrae a los sustratos hidrofílicos provocando un aumento en la concentración local del sustrato.  Distribución de cargas del sustrato y del soporte: - Si el soporte tiene carga negativa, atrae a sustratos con carga positiva aumentando la concentración local del sustrato. *Gráfica 1: Cuando el sustrato con carga negativa se acerca al soporte con carga negativa las cargas se repelen por tanto disminuye su concentración. Sin embargo el sustrato con carga positiva al entrar en contacto con el soporte con carga negativa la concentración de este aumenta, como consecuencia de sentirse atraído por este. El soporte está influyendo en la cantidad de sustrato que pueda entrar a la enzima, es un ejemplo de fenómeno de partición. Aquí tendríamos pérdida parcial de la actividad enzimática. Otro ejemplo sería: sustratos hidrofílicos son atraídos a soportes hidrofílicos conllevando a un aumento en la concentración local del sustrato. También una distribución de cargas del sustrato y soporte, sustratos con carga + serán atraídos a soportes con carga -, aumentando la concentración local del sustrat Los fenómenos de partición los podemos calcular a partir del coeficiente de partición, que mide la concentración del sustrato en la superficie de la enzima inmovilizada frente a la concentración del sustrato en la solución. 2.2.2. Fenómenos de limitación de la difusión Limitan la disponibilidad de sustrato para la reacción. Esta limitación conduce a la pérdida parcial de la actividad catalítica. Son producidos por efectos de difusión del sustrato al sitio activo (por insolubilidad del soporte en el medio de reacción, por impedimentos estéricos o por efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte) y por efectos en el microentorno enzima-soporte. La ley de Fick nos proporciona la velocidad de difusión de los sustratos hacia el interior del soporte. La difusión de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno: ★ Externas: Limitan el acceso del sustrato a la superficie del catalizador inmovilizado. Si el soporte es insoluble en el medio de reacción, el sustrato deberá atravesar la película líquida estacionaria (capa de Nernst) que rodea al soporte. *La velocidad de difusión del sustrato está restringida por la capa de Nerst-Plank. Se reduce la velocidad de la reacción. Aumenta la Km para el sustrato. La capa de Nernst disminuye la concentración de sustrato en torno a la enzima inmovilizada, si el valor de limitación es muy fuerte, la velocidad de reacción está definida por la velocidad de la difusión. - Coeficiente de difusión efectivo: K’m = De - Velocidad de difusión: V’max = Vd Estas restricciones disminuyen: - Aumento de la agitación (mejora mezclado) - En una situación ideal de mezcla sin limitación de la difusión, la reacción tendrá los parámetros cinéticos idénticos a los de la enzima libre. Una manera de disminuir la caída de concentración en torno al sustrato es la agitación, una agitación vigorosa mejora el mezclado de los componentes. ★ Internas: Se deben al tamaño del catalizador inmovilizado y a la tortuosidad de los poros del soporte, los efectos difusionales internos son más complejos que los efectos difusionales externos porque la difusión se produce simultáneamente con la reacción, creando gradientes de concentración alrededor de las partículas. Pero el efecto sobre la Km es el mismo que para la limitación difusional externa (Km´ > Km). Además, la disponibilidad de sustrato es más difícil y siempre se tendrán valores de Vmax´< Vmax, porque la enzima ubicada en el centro de la partícula permanecerá inactiva. Se define el coeficiente de difusión efectivo como la relación entre la porosidad y la tortuosidad del soporte. El modo de disminuir los fenómenos de difusión interna son: - La utilización de sustratos de peso molecular bajo que permitan distribuirse y entrar por los canales que conforman el soporte - Tener una concentración de sustrato alta, - Una concentración de biocatalizador baja - Las partículas del soporte deben ser muy porosas; los poros deben ser grandes, no tortuosos e interconectados. - Se debe inmovilizar la enzima en el exterior del soporte - Partículas de soporte de pequeño tamaño El modo de controlar cuánto se estima de una inmovilización se puede medir por diferentes módulos: ⮚ MÓDULO DE THIELE: Método para cuantificar las restricciones difusionales internas y externas. ⮚ MÓDULO DE DAMKÖHLER: Número adimensional que expresa la relación entre la velocidad máxima de una reacción enzimática y la velocidad máxima de transferencia de sustrato en las proximidades de una enzima inmovilizada. Indica los factores que limitan la actividad de la enzima inmovilizada y cuánto se aleja del máximo posible. 3. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS 3.1 FACTOR DE EFICACIA El factor de eficacia expresa los efectos combinados de los factores que afectan a las propiedades intrínsecas de la enzima inmovilizada. Siendo un factor importante para saber si nuestro biocatalizador es efectivo o no. n = actividad enzima inmovilizada / actividad enzima libre