Purificación de Enzimas: Estrategias y Métodos

La eliminación de ácidos nucleicos es crucial en la purificación de enzimas, ya que estos contaminantes pueden afectar negativamente la viscosidad del medio y dificultar las manipulaciones.

La desnaturalización de los ácidos nucleicos implica la alteración de su estructura, lo que reduce su solubilidad y facilita su eliminación.

En la precipitación de ácidos nucleicos, se utilizan agentes que forman complejos con los grupos fosfato negativos de los ácidos nucleicos, provocando su precipitación.

Las nucleasas son enzimas que descomponen los ácidos nucleicos en nucleótidos, facilitando su eliminación.

El ajuste de pH es una técnica utilizada para precipitar proteínas al modificar su carga eléctrica y solubilidad.

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína representa el pH específico en el que su carga eléctrica neta es cero, lo que afecta su solubilidad.

Las proteínas son moléculas anfotéricas, lo que significa que pueden tener carga positiva, negativa o neutra dependiendo del pH del medio.

El sulfato de amonio es una sal utilizada en la purificación de enzimas debido a su capacidad de precipitar selectivamente proteínas, concentrar enzimas y reducir el volumen de proteínas no deseadas.

Los reactores de tanque agitado y flujo continuo permiten una entrada constante de sustrato, su transformación en producto y una velocidad de salida del producto coincidente con la velocidad de entrada del sustrato.

El tiempo que el sustrato permanece dentro del reactor determina la cantidad de transformación en producto. Un tiempo de residencia corto puede resultar en un producto que todavía contiene sustrato.

El producto que no se ha transformado completamente puede volverse a introducir en el reactor (reciclado) para mejorar su transformación.

Los reactores de tanque agitado que son discontinuos de mezcla total se caracterizan por la mezcla completa del sustrato en el reactor.

Los reactores de tanque agitado y alimentación continua son bio-reactores continuos y de mezcla total.

En un bio-reactor de lecho empaquetado, el sustrato se coloca en contacto con un material sólido (el lecho) y luego se recircula.

Los bio-reactores pueden trabajar en serie, lo que significa que el producto de un reactor se introduce en otro reactor para completar su transformación.

En los bio-reactores, el biocatalizador se mantiene dentro del reactor. Se agrega una corriente de sustrato y se recolecta el producto a medida que se va produciendo.

Un tipo de bio-reactor utilizado para transformar sustratos en productos mediante la acción de un catalizador. Es una vasija grande con un catalizador interno y un sistema para controlar el flujo de sustrato dentro y fuera del reactor.

Un bio-reactor que permite el control preciso del flujo de sustrato y la concentración del mismo. Esto facilita la optimización de la producción del producto final. También se pueden usar para hacer bio-reactores en serie.

Los bio-reactores TAFC tienen un gran volumen vacío, lo cual implica que solo una pequeña parte del reactor participa en la reacción. Esto limita la productividad global del proceso y el porcentaje de conversión.

Son bio-reactores que utilizan una columna sólida con el catalizador inmovilizado. El sustrato fluye a través de la columna, donde se transforma en el producto final con la ayuda del catalizador.

Su diseño permite el flujo continuo de sustrato a través del lecho, lo cual asegura que la reacción se lleve a cabo de manera eficiente y que se produce un producto de alta calidad.

Un tipo de bio-reactor que utiliza partículas catalíticas suspendidas en un fluido. Estos bio-reactores se caracterizan por su rápida mezcla y alto rendimiento.

Tipo de bio-reactor que utiliza membranas con poros microscópicos para separar el catalizador del sustrato. La enzima permanece dentro de los poros, se filtra el sustrato y el producto se difunde al exterior.

Estos bio-reactores son ideales para reacciones con catalizador inmovilizado, ya que minimizan las limitaciones de difusión y aumentan la productividad. Son adecuados para reacciones con un alto porcentaje de conversión y poca pérdida de catalizador.

Un tipo de bio-reactor que utiliza unidades de ultrafiltración con enzimas inmovilizadas o solubles. El sustrato entra a través de fibras huecas, se filtra y genera el producto deseado. La enzima no sale, pero el sustrato y el producto sí.

Parámetro que mide la cantidad de producto generado por unidad de volumen del reactor y tiempo de operación. Es deseable una alta productividad.

Factores que afectan la actividad de un bio-reactor, como la temperatura de trabajo, la concentración de enzima y la actividad de la enzima (nativa e inmovilizada).

Mide el tiempo que tarda la actividad del reactor en reducirse a la mitad del valor inicial. Se busca una alta estabilidad para evitar cambios frecuentes en el bio-reactor.

Indica la proporción del producto deseado frente al total de productos formados. Una alta selectividad significa que el sustrato se transforma principalmente en el producto deseado.

Es el proceso de renovación de la enzima en un bio-reactor. Puede implicar separar la enzima del soporte y volverla a inmovilizar, o simplemente añadir más enzima.

Proceso de inmovilización de una enzima a un soporte para mejorar su actividad y estabilidad. Se puede usar para controlar la actividad y reutilización de la enzima en el proceso.

La cantidad de enzima presente en el soporte afectará directamente la actividad del bio-reactor. Una mayor cantidad de enzima generalmente significa una mayor actividad.

Es la concentración del sustrato en la superficie de la enzima inmovilizada en relación con la concentración del sustrato en la solución.

Fenómeno que limita la disponibilidad de sustrato para la reacción debido a la dificultad de difusión.

Capa delgada alrededor del soporte insoluble que dificulta la difusión del sustrato.

Velocidad de la difusión del sustrato hacia el interior del soporte, que depende de la concentración y el área de la superficie.

Frena el acceso del sustrato al catalizador inmovilizado, ralentizando la reacción.

Impide la difusión del sustrato hacia el centro activo de la enzima.

Aumenta la mezcla del sustrato con la enzima, mejorando el acceso del sustrato al sitio activo.

El sustrato se une con menor afinidad a la enzima inmovilizada debido a la dificultad de difusión.

La inmovilización covalente es un método para fijar enzimas a una superficie mediante la formación de enlaces covalentes entre los grupos funcionales de la enzima y la matriz. Estos enlaces son fuertes y permiten que la enzima esté firmemente adherida a la superficie.

Un inhibidor irreversible es un tipo de molécula que se une permanentemente al centro activo de una enzima, impidiendo su actividad. Esto ocurre mediante la formación de un enlace covalente entre el inhibidor y la enzima.

La inmovilización covalente no siempre es la mejor opción para todas las enzimas. Algunas enzimas, especialmente aquellas sensibles a cambios de pH o fuerza iónica, pueden verse afectadas negativamente por la inmovilización covalente, perdiendo su actividad.

El reticulado o entrecruzamiento es una técnica de inmovilización de enzimas que no utiliza un soporte externo. En este método, se utilizan reactivos bifuncionales para crear enlaces covalentes entre diferentes moléculas de enzima, formando una red tridimensional.

Los reactivos bifuncionales utilizados para el reticulado de enzimas son moléculas con dos grupos reactivos que pueden unirse a diferentes enzimas. Algunos ejemplos son dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio y diaminas.

El reticulado de enzimas puede afectar su actividad, ya que los reactivos bifuncionales pueden unirse a regiones importantes de la enzima, incluyendo el centro activo, y así bloquear su función.

El reticulado de enzimas puede ser una técnica útil para mejorar la estabilidad y la reutilización de las enzimas, pero es importante considerar sus limitaciones, como la posibilidad de afectar su actividad y la necesidad de optimizar las condiciones para obtener la máxima eficacia.