Purificación de Enzimas: Estrategias y Métodos

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Questions and Answers

¿Cuál es una de las características de los reactores de tanque agitado y flujo continuo (TAFC)?

No facilitan el reemplazo del catalizador.

Son difíciles de construir y controlar.

Permiten el uso exclusivo de sustratos líquidos.

Son de fácil construcción y control. (correct)

¿Qué se busca al ajustar la velocidad de flujo en un bio-reactor?

Maximizar la pérdida de catalizador.

Reducir la concentración de sustrato.

Dar tiempo a la enzima para transformar sustrato en producto. (correct)

Aumentar el volumen vacío del bioreactor.

¿Cuál de las siguientes opciones es una desventaja de los reactores de tanque agitado?

Pueden producir inhibición por producto. (correct)

Tienen un alto porcentaje de ocupación del catalizador.

No son adecuados para sustratos sólidos.

Permiten un mezclado deficiente de sustratos.

¿Qué tipo de reacciones son adecuados para los reactores de lecho empaquetado?

Reacciones con sustratos sólidos o coloides. Signup and view all the answers

¿Cuál es un método de eliminación de ácidos nucleicos mencionado?

Desnaturalización Signup and view all the answers

Para evitar la pérdida de enzimas inmovilizadas en los reactores de tanque agitado, ¿qué se debe hacer?

Aumentar la agitación para mejorar la difusión. Signup and view all the answers

¿Qué efecto tiene un ajuste de pH mayor al pH isoeléctrico (pi) de una enzima?

Los aminoácidos forman aniones Signup and view all the answers

¿Cuál es una limitación principal de los reactores de tanque agitado con respecto a la ocupación del catalizador?

Solo un 2% del reactor está ocupado por el catalizador. Signup and view all the answers

¿Qué tipo de bio-reactor se caracteriza por un sistema de retención de catalizador a través de filtros o sedimentación?

Reactores de tanque agitado y flujo continuo. Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes sustancias es un detergente catiónico utilizado en la precipitación de ácidos nucleicos?

Bromuro de cetrimetilamonio Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes tipos de bio-reactores no se considera un reactor continuo?

Reactores por lotes. Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la precipitación de proteínas es correcta?

Depende del tipo de sal y su concentración Signup and view all the answers

¿Qué provoca la desnaturalización de los ácidos nucleicos?

Un aumento en la viscosidad del medio Signup and view all the answers

¿Qué tipo de nucleasa se utiliza para la hidrólisis del ADN?

Deoxinucleasa Signup and view all the answers

¿Qué efecto tiene la adición de sulfato amónico a una solución de enzimas?

Disminuye la solubilidad de las proteínas no deseadas Signup and view all the answers

¿Cuál es la función principal de las nucleasas?

Hidrólisis de ácidos nucleicos hasta nucleótidos Signup and view all the answers

¿Cuál es la primera etapa en el procedimiento de formación del enlace covalente?

Activación de grupos funcionales Signup and view all the answers

¿Qué tipo de inhibidor puede impedir que el centro activo forme parte del enlace covalente?

Inhibidor irreversible Signup and view all the answers

¿Cuál es una de las ventajas de la inmovilización enzimática mencionada?

Manipulación sencilla de los derivados inmovilizados Signup and view all the answers

¿Qué reacción se realiza utilizando reactivos bifuncionales en el entrecruzamiento?

Formación de enlaces covalentes entre las moléculas de enzima Signup and view all the answers

¿Cuál es un inconveniente de la inmovilización enzimática?

Alteración de la estructura del centro activo Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes reactivos no es considerado bifuncional para el entrecruzamiento?

Sulfatos Signup and view all the answers

¿Qué efecto tiene la inmovilización enzimática en la carga de enzima según el contenido?

La carga de enzima permanece constante Signup and view all the answers

¿Qué ocurre en la formación de enlaces covalentes usando la propia enzima como soporte?

Se resulta en una estructura tridimensional entrecruzada Signup and view all the answers

¿Cuál es el principal componente que se encuentra en los bio-reactores de fibra hueca?

Enzima inmovilizada o soluble Signup and view all the answers

¿Cuál es un parámetro clave para evaluar el rendimiento de un bio-reactor?

Estabilidad Signup and view all the answers

¿Qué factor NO afecta la actividad de un bio-reactor?

Tamaño de la planta Signup and view all the answers

¿Qué se entiende por estabilidad en un bio-reactor?

Tiempo en que la actividad decae a la mitad Signup and view all the answers

La selectividad de un bio-reactor se refiere a:

La proporción del producto deseado frente a otros productos Signup and view all the answers

¿Qué acción se toma cuando la estabilidad de un bio-reactor disminuye?

Renovar la enzima Signup and view all the answers

¿Cuál es el objetivo al trabajar con sustratos inestables en un bio-reactor?

Evitar la creación de productos secundarios Signup and view all the answers

La actividad volumétrica en un bio-reactor implica medir:

La cantidad de sustrato y producto por tiempo Signup and view all the answers

¿Cuál es el principal objetivo de regular la velocidad de salida del producto en un reactor de tanque agitado con flujo continuo?

Mantener el equilibrio entre la entrada de sustrato y la salida de producto. Signup and view all the answers

En los bio-reactores de lecho empaquetado, ¿qué ocurre si el tiempo de residencia del sustrato es insuficiente?

El sustrato se volverá a recircular para su transformación adicional. Signup and view all the answers

¿Qué caracteriza a los reactores de tanque agitado comparados con los bio-reactores de lecho empaquetado?

Los reactores de tanque agitado son discontinuos y de mezcla total. Signup and view all the answers

¿Qué método se usa para mantener el biocatalizador en un bio-reactor?

Inmovilizar la enzima sobre un soporte. Signup and view all the answers

En un sistema de bio-reactores en serie, ¿cuál es una ventaja clave?

Permite una mayor eficiencia en la conversión del sustrato. Signup and view all the answers

En el proceso de reciclar el sustrato en un bio-reactor, ¿cuál es un resultado esperado?

Sería posible mejorar el porcentaje de conversión. Signup and view all the answers

¿Qué debe hacerse si la corriente de producto en un reactor contiene sustrato?

Se debe reducir la velocidad de entrada del sustrato. Signup and view all the answers

¿Cuál es una función de la ultrafiltración en un bio-reactor con enzimas solubles?

Permitir la salida del producto pero no del catalizador. Signup and view all the answers

¿Qué ocurre cuando hay una distribución de cargas del sustrato y soporte?

Los sustratos con carga + son atraídos por los soportes con carga - Signup and view all the answers

¿Qué mide el coeficiente de partición?

La concentración del sustrato en la solución frente a la concentración en la superficie de la enzima Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes factores limita la disponibilidad de sustrato para la reacción?

Agitación insuficiente Signup and view all the answers

¿Qué describe la velocidad de difusión de los sustratos según la ley de Fick?

La velocidad de difusión hacia el interior del soporte Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes es una resistencia externa que limita la difusión de sustrato?

Insolubilidad del soporte en el medio de reacción Signup and view all the answers

¿Qué efecto tiene la capa de Nernst en la difusión del sustrato?

Disminuye la concentración de sustrato alrededor de la enzima Signup and view all the answers

¿Cómo se puede mejorar la velocidad de difusión del sustrato en un medio de reacción?

Aumentando la agitación del sistema Signup and view all the answers

¿Qué ocurre en una situación ideal de mezcla sin limitación de la difusión?

Los parámetros cinéticos son idénticos a los de la enzima libre Signup and view all the answers

Study Notes

General Notes on Enzyme Purification

No universal purification strategy exists, as methods depend on enzyme characteristics, desired purity, and yield.
Enzyme characteristics (e.g., intracellular vs. extracellular, abundance) and purity/yield requirements dictate the purification approach.
Purification involves a series of steps: cell disruption, concentration (centrifugation, salting out, ultrafiltration), chromatography (ion exchange, hydrophobic interaction, gel filtration), and final concentration.
Monitoring protein amount and enzyme activity is crucial at each stage. Gel electrophoresis is used for this.
An example is chymosin production, using an E. coli K-12 strain with the prochymosin gene under trp promoter.

Techniques for Removing Solid Particles

Centrifugation: Used initially for large volumes, using continuous flow centrifuges to remove denser materials (cells, precipitates) from clarified liquid. Allows continuous operation.
Filtration: Removes solid particles from large volumes of liquid using a filter medium (e.g., diatomaceous earth, natural/synthetic materials). Filtration rate depends on pressure difference, liquid viscosity, and characteristics of the filter medium.

Techniques for Removing Nucleic Acids

Denaturation: Physical methods (e.g., high pH, low ionic strength) disrupt hydrogen bonds in DNA and RNA
Precipitation: Using chemical reagents (e.g., cesium chloride) that form complexes with nucleic acids for removal via centrifugation
Nucleases: Enzymes that degrade nucleic acids (DNA and/or RNA).

Precipitation/Concentration of Proteins

pH Adjustment: Adjusting pH to the isoelectric point (pI) of the protein causes it to lose its charge, leading to precipitation.
Salting-in: Low salt concentrations increase protein solubility by reducing electrostatic interactions.
Salting-out: High salt concentrations decrease protein solubility by competing with water molecules for hydration, increasing protein-protein interactions. Ammonium sulfate ( (NH₄)₂SO₄) is a common reagent used for this.

Solvent Methods for Protein Purification

Methods involving solvents (e.g., methanol, ethanol)
Need for low temperatures to avoid enzyme denaturation.
Not used routinely on a large scale due to hazard.

Techniques for Removing Nucleic Acids and High Molecular Weight Polymers

Removal of high molecular weight polymers (e.g., PEG, polyacrylic acid) is done by filtration or other separation.

General Notes on Chromatography Techniques

Ion-exchange: Separates proteins based on their net charge, using charged stationary phases (e.g., deae-cellulose).
Affinity: Uses a specific ligand bound to a matrix to isolate proteins that interact with that ligand.
Size-exclusion/Gel Filtration: Separates proteins based on size, using porous materials (e.g., Sephadex). Larger molecules elute first.
Hydrophobic interaction: Separates proteins based on hydrophobicity, using hydrophobic stationary phases.

Other Methods

Discontinuous Fractionation: Batch process used for fractionating proteins based on solubility differences.
Continuous methods: Used when high production rates are needed, for example, in bioreactors. It is characterized by a constant flow of materials (sustrates and products).

Bioreactors

Devices used for large-scale enzyme production.
Different types include stirred tank reactors, packed bed reactors, fluidized bed reactors, and hollow fiber reactors.
Key parameters for reactor design include pH and temperature control, gas exchange, solid particle handling, and biological stability of the products and substrates.

Evaluation of Bioreactor Performance

Parameters for evaluating bioreactor performance include activity (product yield per unit time), stability (reactor lifetime), and selectivity (desired product yield). Factors like temperature, concentration of enzymes, and other reactor parameters are crucial.

Enzyme Immobilization

Methods for fixing enzymes to a solid support (e.g., entrapment, adsorption, covalent binding).
Advantages include reusability, ease of separation from products, and stability.
Disadvantages include some loss of activity, cost consideration, complex process, and the possibility of the active site being altered.

Co-immobilized Enzymes

Combining multiple enzymes on a single support for multi-step reactions.
Advantages include high efficiency, reduced purification steps.
Disadvantages may include complex engineering to develop optimal conditions.

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Description

Este cuestionario aborda las diversas estrategias y métodos utilizados en la purificación de enzimas. Se exploran características de las enzimas, requisitos de pureza y rendimiento, así como las técnicas específicas empleadas en el proceso de purificación. Además, se incluyen ejemplos específicos como la producción de quimosina.