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DOCUMENTO DE LA PROFE: BIOLOGÍA CELULAR Trabajar con Proteínas El conocimiento bioquímico sobre la estructura función de las proteínas procede del estudio de muchas proteínas individuales. Para estudiar una proteína con cierto detalle es necesario separarla del resto de proteínas y disponer de técn...

DOCUMENTO DE LA PROFE: BIOLOGÍA CELULAR Trabajar con Proteínas El conocimiento bioquímico sobre la estructura función de las proteínas procede del estudio de muchas proteínas individuales. Para estudiar una proteína con cierto detalle es necesario separarla del resto de proteínas y disponer de técnicas que permitan determinar sus propiedades. Los métodos necesarios provienen de la química de proteínas disciplina tan antigua como la bioquímica y que mantiene una posición central en la investigación bioquímica. Las proteínas se pueden separar y purificar. Una preparación para una proteína es esencial para poder determinar sus propiedades y actividad. Puesto que las células contienen miles de tipos diferentes de proteínas, ¿cómo puede purificarse una proteína? Los métodos clásicos de separación de proteínas aprovechan propiedades que varían de una proteína a otra, entre las que se incluyen el tamaño, la carga, y las propiedades de unión a diferentes sustratos. A estos métodos se han añadido durante décadas recientes otros nuevos como el clonaje de DNA y la secuenciación de genomas que pueden simplificar el proceso de purificación de proteínas. Estos métodos modernos suelen modificar artificialmente la proteína a purificar añadiendo unos pocos o muchos aminoácidos a uno de sus extremos o ambos. De este modo la simplificación del proceso puede implicar una alteración potencial de la actividad de la proteína purificada. La purificación de las proteínas en su estado nativo, la forma en la que funcionan en las células, suele basarse en los métodos aquí descritos. La fuente de una proteína es generalmente células tisulares o microbianas. El primer paso en cualquier modificación de proteínas es la rotura de estas células para liberar sus proteínas en una solución denominada extracto crudo. En caso necesario puede utilizarse la centrifugación diferencial, centrifugación a diferentes velocidades y/o en diferentes medios, para preparar fracciones celulares o aislar determinados orgánulos. Una vez que está a punto el extracto o la preparación del orgánulo deseado, se dispone de diversos métodos para purificar una o más proteínas de las proteínas que contienen. Normalmente el extracto se somete a tratamientos que separan las proteínas en diferentes fracciones en base a alguna propiedad, tales como el tamaño o la carga, en un proceso que se denomina fraccionamiento. Los pasos iniciales de fraccionamiento en una purificación utilizan diferencias en la solubilidad de las proteínas, que es una función compleja del pH, la temperatura, la concentración de sal y otros factores. La solubilidad de las proteínas disminuye en presencia de algunas sales, un efecto denominado “salting out”. La adición de ciertas sales en cantidades apropiadas pueden inducir la precipitación selectiva de algunas proteínas permaneciendo las restantes en solución. El sulfato amónico ((NH4)SO4) es especialmente efectivo y a menudo se utiliza para precipitar proteínas por “salting out”. Las proteínas precipitadas se separan de las que permanecen disueltas mediante centrifugación a baja velocidad. La disolución que contiene una proteína de interés debe de pasar a menudo por otros procesos antes de que sean posibles pasos de purificación posteriores. La diálisis, por ejemplo, es un procedimiento que separa las proteínas de los solutos pequeños aprovechando el mayor tamaño de las moléculas de proteína. El extracto parcialmente purificado se coloca en un saco o tubo de membrana semipermeable, cuando éste se suspende en un volumen mucho mayor de disolución tamponada de fuerza iónica (concentración de sal) apropiada, la membrana permite el intercambio sal y tampon pero no de proteínas. De esta forma la diálisis retiene las proteínas grandes dentro del saco o tubo de membrana mientras que permite que la concentración de todos los demás solutos en la preparación de proteínas permite que la concentración de todos los demás solutos en la reparación cambie hasta llegar al equilibrio con la solución exterior de la membrana. La diálisis puede utilizarse por ejemplo para eliminar el sulfato amónico de una preparación de proteína. Los métodos más potentes para el procesamiento de proteínas utilizan la cromatografía en columna que aprovecha las diferencias de carga, tamaño afinidad por otras moléculas y otras propiedades de las proteínas. Un material sólido poroso con unas propiedades químicas concretas, denominado fase estacionaria, se introduce en una columna y una disolución tamponada, la llamada la fase móvil, pasa a su través. La proteína, disuelta en la misma disolución tamponada de la fase móvil, se deposita en la parte superior de la columna. La proteína se va percolando a través de la matriz sólida en forma de una banda que va expandiéndose continuamente dentro de la fase móvil. Las proteínas individuales miran más rápido o más lentamente a través de la columna dependiendo de sus propiedades y las de la fase estacionaria. La cromatografía de intercambio iónico aprovecha las diferencias de signo y magnitud de las cargas eléctricas netas de las proteínas a un pH determinado figura 2A. En este tipo de cromatografía, la matriz de la columna es un polímero sintético o resina que tiene unidos grupos cargados; los que tienen grupos aniónicos, con carga negativa, se denominan intercambiadores catiónicos y los que tienen grupos catiónicos, con carga positiva, se denominan intercambiadores aniónicos. La afinidad de la proteína por los grupos cargados de la columna está afectada por el pH (que determina el estado de ionización de la molécula) y la concentración de los iones salinos libres presentes en la disolución que les rodea. La separación puede optimizarse cambiando gradualmente el pH y la concentración de sal de la fase móvil de forma que se cree un gradiente de pH o sal. En la cromatografía de intercambio catiónico la materia sólida tiene grupos cargados negativamente. En la fase móvil las proteínas con carga neta positiva migran a través de la matriz más lentamente que las que tienen una carga neta negativa debido a que la migración de las primeras se haya retardada por las interacciones con la fase estacionaria. En las columnas de intercambio iónico la expansión de la banda de proteínas de la fase móvil (la disolución de proteínas) está causada tanto por la separación de las proteínas diferentes propiedades como por la difusión. La resolución entre los dos tipos de proteínas con diferente carga neta suele mejorar a medida que aumenta la longitud de la columna. Sin embargo, la velocidad a la que la disolución de proteínas puede pasar a través de la columna suele disminuir con la longitud de la columna. A medida que aumenta el tiempo de residencia en la columna, la resolución puede disminuir como resultado de la difusión de cada una de las bandas de proteína. Se van recogiendo en porciones (fracciones) sucesivas de efluente en tubos de ensayo a medida que la solución que contiene las proteínas va saliendo de la columna. Se puede analizar cada fracción para averiguar la presencia de la proteína de interés o para conocer otras propiedades como las fuerzas iónicas o la concentración total de proteína. Todas las fracciones que contienen la proteína de interés pueden combinarse para obtener el producto de este paso cromatográfico de la purificación de la proteína. La cromatografía de exclusión molecular, también llamado de filtración en gel, figura 2B, separa las proteínas en base a su tamaño. En este método las proteínas de mayor tamaño que emergen de la columna antes que las pequeñas, un resultado que parece extraño a primera vista. La fase sólida está constituida por pequeñas “perlas” hechas de un material entrecruzado partículas que contienen unos poros o cavidades de un tamaño calibrado. Las proteínas de mayor tamaño no pueden entrar en las cavidades por lo que toman un camino más corto y rápido a través de la columna, rodeando las “perlas” por el exterior. Las partículas más pequeñas penetran en las cavidades y son retardadas a causa de su paso más laberíntico a través de la columna. La cromatografía de exclusión molecular también se puede usar para estimar aproximadamente el tamaño de una proteína purificada. La cromatografía de afinidad se base en la afinidad de unión de las proteínas por un sustrato figura 2C. En este caso, las partículas de la columna tienen un grupo químico unido covalentemente, el ligando, al que se une una macromolécula como por ejemplo una proteína concreta. Cuando se carga una mezcla de proteínas en la columna, cualquiera de ellas que tenga afinidad por el ligando se une a las partículas de resina retardando su migración a través de la columna. Por ejemplo, si la función biológica de una proteína implica unión a ATP, la fijación a la columna de una molécula que se parezca al ATP dará lugar a una matriz de afinidad que servirá para purificarla la proteína. Al ir pasando la solución proteica a través de la columna, las proteínas se unen al ATP, incluyendo la proteína de interés, se irán uniendo a la matriz. Después de eludir las proteínas que no se unan, aquellas que sí lo han hecho se eluyen con una solución que contenga una alta concentración de sal o el propio ligando, en este caso ATP. La sal debilita la unión de la proteína al ligando inmovilizando en las partículas de resina interfiriendo con las interacciones iónicas. El ligando libre compite con el ligando unido a las partículas de la columna liberando las proteínas de la matriz; el producto proteico que eluye de la columna se encuentra a menudo unido al ligando usado en la elución. Los métodos cromatográficos pueden incrementar su rendimiento gracias al uso del HPLC o cromatografía líquida de alta resolución. El HPLC utiliza bombas de alta presión que aceleran el movimiento de las moléculas de proteínas a través de la columna, así como materiales cromatográficos de calidad superior que pueden soportar la fuerza de compresión del flujo presurizado. Al reducir el tiempo de tránsito en la columna el HPLC puede limitar la expansión de las bandas de proteína por difusión y por tanto mejorar notablemente la resolución. La estrategia de purificación de una proteína que no ha sido previamente aislada se guía tanto por los precedentes establecidos como por el sentido común. En la mayoría de los casos deben utilizarse varios métodos diferentes consecutivos para purificar completamente una proteína de forma que cada uno de ellos separa proteínas en base a las propiedades diferentes. Por ejemplo, si en uno de los pasos se separan proteínas que unen ATP de otras que no lo unen, el paso siguiente deberá separar las diferentes proteínas de unión a ATP en base a su carga o su tamaño con el fin de aislar la proteína concreta que se desee. La elección de métodos es, en cierto modo, empírica y puede ser necesario probar muchos protocolos antes de encontrar el más efectivo. El proceso de prueba y error puede a menudo reducirse al mínimo tomando como referencia técnicas de purificación desarrolladas para proteínas similares. Se pueden encontrar publicados protocolos de purificación para muchos millares de proteínas. Al principio cuando el volumen total y el número de contaminantes son máximos se han de utilizar procedimientos baratos como “salting out”. A menudo, los métodos cromatógrafos no resultan prácticos en las primeras fases debido a que la cantidad de medio cromatográfico necesario aumenta con el tamaño de la muestra. A medida que se completa cada paso de purificación el tamaño de la muestra es generalmente menor lo que hace posible utilizar procedimientos cromatográficos más sofisticados y caros en etapas posteriores. Las proteínas pueden separarse y caracterizarse por electroforesis Otra importante técnica para la separación de proteínas se basa en el desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico proceso denominado electroforesis. Estos procedimientos no son utilizados generalmente para purificar proteínas en grandes cantidades, existen métodos alternativos más sencillos además de que los métodos electroforéticos suelen afectar negativamente a la estructura y por tanto la función de las proteínas. No obstante, la electroforesis es sumamente importante como método analítico. Su ventaja es que las proteínas pueden visualizarse además de separarse lo que permite al investigador hacer una estimación rápida del número de proteínas diferentes en una mezcla o del grado de pureza de una preparación proteica determinada. La electroforesis también permite la determinación de algunas de las propiedades más relevantes de una proteína tales como su punto eléctrico o su masa molecular aproximada. Generalmente, la electroforesis de proteínas se lleva a cabo en geles formados por el polímero entrecruzado poliacrilamida. El gel de poliacrilamida actúa como un tamiz molecular, retrasando la migración de las proteínas de manera aproximadamente proporcional a su cociente carga/masa. El desplazamiento de una proteína en el campo eléctrico también puede estar afectado por la forma de la proteína. En la electroforesis, la fuerza que mueve la macromolécula es el potencial eléctrico E. La movilidad electroforética de una proteína m es el cociente entre la velocidad de la partícula V y el potencial eléctrico. La movilidad electroforética también es igual a la carga neta de la molécula Z dividida por el cociente friccional F que refleja, en parte, la forma de la proteína. El desplazamiento de una proteína durante una electroforesis es, por tanto, función de su tamaño y de su forma. Un método electroforético comúnmente utilizado para la estimación de la pureza y masa molecular emplea un detergente llamado dodecil sulfato sódico SDS donde dodecil se refiere a una cadena de 12 átomos de carbono. Una proteína se une, aproximadamente, a una cantidad de SDS equivalente a 1,4 veces su masa, casi una molécula de SDS por cada residuo de aminoácido. El SDS ligado incorpora una carga neta negativa, lo que hace que la carga intrínseca de la proteína sea insignificante, y confiere a todas las proteínas un cociente carga masa similar. Además la unión del SDS despliega parcialmente las proteínas de modo que la mayor parte de las proteínas unidas al detergente van a adoptar una forma similar de varilla alargada. La electroforesis en presencia de SDS separa por tanto las proteínas casi exclusivamente en función de su masa molecular de forma que los polipéptidos pequeños se desplazan más rápidamente. Después de la electroforesis las proteínas se visualizan añadiendo un colorante como el azul de Coomasie que se fija a las proteínas pero no al gel figura 3B. De esta forma puede seguirse el proceso de purificación de una proteína, el número de bandas de proteína visibles en el gel debe disminuir tras cada nuevo paso de purificación. Cuando se compara con las posiciones a las que se desplazan en el gel proteínas de masa muscular conocida, la posición de una proteína desconocida puede proporcionar una buena aproximación de su masa molecular figura 4. Por otra parte, sí una proteína tiene dos o más subunidades diferentes estas se separarán a consecuencia del tratamiento con SDS y aparecerá una banda individual para cada una. El enfoque isoeléctrico o isoelectroenfoque es un procedimiento utilizado para determinar el punto eléctrico de una proteína figura 5. Se establece un gradiente de pH dejando que una mezcla de ácidos y bases orgánicos de baja pasa molecular, anfolitos, se distribuya espontáneamente en un campo eléctrico generado a través del gel. Cuando se aplica una mezcla de proteínas, cada una de ellas se desplaza hasta que alcanza el pH que coincide con su punto isoeléctrico. De este modo las proteínas con distintos puntos eléctricos se distribuyen de manera diferente a lo largo del gel. La combinación secuencial de isoelectroenfoque y electroforesis con SDS es un proceso denominado electroforesis bidimensional que permite la resolución de mezclas complejas de proteínas figura 6. Este es un método analítico más sensible que cualquier método electroforético individual. La electroforesis bidimensional separa las proteínas de idéntica masa molécular que difieren en el punto isoeléctrico o proteínas con valores de puntos eléctricos similares pero con diferentes masas moleculares.