Genetica I - Mutazioni, Metabolismo e Regolazione Genica PDF

GENETICA I Giampiero Valè Regolazione dell’espressione genica di tipo positivo e negativo nei procarioti Geni strutturali: codificano per proteine usate nel metabolismo e biosintesi (es geni dell’operone) Geni regolatori: geni i cui prodotti, proteine o RNA, interagiscono con altre sequenze di...

GENETICA I Giampiero Valè Regolazione dell’espressione genica di tipo positivo e negativo nei procarioti Geni strutturali: codificano per proteine usate nel metabolismo e biosintesi (es geni dell’operone) Geni regolatori: geni i cui prodotti, proteine o RNA, interagiscono con altre sequenze di DNA e influenzano trascrizione/traduzione dei geni strutturali Geni costitutivi (housekeping-genes): espressi in modo continuo, non sono oggetto di regolazione Geni regolati: la loro espressione è controllata dalla cellula in risposta a esigenze specifiche La regolazione della espressione genica può avvenire a diversi livelli Diverse proteine possono legare il DNA per regolare la espressione dei geni Zinc fingers REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI A) REGOLAZIONE A LIVELLO DELL’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE OPERONI E CONTROLLO DELL’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE Gli operoni possono essere inducibili oppure reprimibili CONTROLLO NEGATIVO I: A) Operoni inducibili, sono quelli in cui la trascrizione è normalmente inattiva Di solito gli operoni inducibili controllano le proteine incaricate dei processi degradativi Le proteine regolatrici spesso hanno due siti di legame: uno che si lega al DNA e un altro in grado di legarsi a una piccola molecola, come un induttore. Il legame dell’induttore (es. il precursore V) altera la forma del repressore impedendogli di legarsi con il DNA. Le proteine di questo tipo, che cambiano forma quando si legano a un’altra molecola, si chiamano PROTEINE ALLOSTERICHE CONTROLLO NEGATIVO II: B) Operoni reprimibili sono quelli in cui la trascrizione di solito è attiva Normalmente controllano le proteine legate alla biosintesi delle molecole necessarie alla cellula, come gli amminoacidi CONTROLLO POSITIVO C) Operone positivo inducibile: normalmente la trascrizione è spenta, dal momento che la proteina regolatrice (attivatore) viene prodotta in forma inattiva. La trascrizione comincia quando un induttore si attacca alla proteina regolatrice e la attiva NB: attivatore si lega al DNA a un sito diverso da operatore D) Operone positivo reprimibile: la proteina regolatrice (attivatore) viene prodotta in una forma che le consente di legarsi al DNA, e ciò significa che in condizioni normali c’è trascrizione. La trascrizione viene inibita quando una sostanza si unisce all’attivatore e lo rende incapace di legarsi al DNA Riassumendo i 4 tipi di regolazione visti…… REGOLAZIONE NEGATIVA DELL’OPERONE lac Metabolismo del lattosio in E. coli Regolazione dell’operone lac: esempio di operone inducibile negativo Un sequenziamento nucleotidico ha dimostrato che l’operatore di lac si sovrappone all’estremità 3′ del promotore e all’estremità 5′ di lacZ Se viene aggiunto del lattosio e il glucosio è assente, la velocità di sintesi di tutte e tre le proteine aumenta contemporaneamente di un migliaio di volte nel giro di pochi minuti SISTEMI PER LA IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI AL LOCUS LAC β-galattosidasi scinde la molecola ONPG (o-nitrofenil- Utilizzo di ONPG per β-D-galattoside), un identificazione di mutanti composto incolore, in galattosio e ONP, una Lac+ molecola di colore giallo (è indicatore della presenza di attività β-galattosidasica). Trattamento mutageno e batteri cresciuti in assenza di lattosio (solo peptone) e trattati con ONPG: le colonie che assumevano colore giallo erano mutanti costitutivi capaci di esprimere la β- galattosidasi in assenza dell’induttore. Isolamento mutanti Lac-: trattamento mutageno su E. coli; batteri piastrati su terreno EMB (contenente lattosio e peptone); al terreno vengono aggiunti 2 coloranti: eosina e blu di metilene, che virano a pH acido; le colonie Lac+ che degradano lattosio producono acidi organici e causano viraggio dei coloranti a colore rosso; le colonie Lac- rimangono bianche Induttore del locus lac non è lattosio, ma il suo derivato allolattosio, prodotto dalla β-galattosidasi Uso del lattosio come induttore ha lo svantaggio che viene consumato dal batterio, qdi il suo effetto si esaurisce nel tempo. E’ stato scoperto che la molecola isopropil-β-D- tiogalattoside (IPTG) induce la espressione dell’operone lac A) MUTAZIONI DI LAC CHE AGISCONO SULL’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE Uso di ceppi diploidi parziali per la caratterizzazione delle mutazioni Ceppi in cui avviene la coniugazione fra due batteri in cui il plasmide F contenente l’operone selvatico lac (fattore F’lac+) viene trasferito da un batterio all’altro. Il batterio ricevente diventa parzialmente diploide essendo in possesso di due copie dell’operone lac. Il sistema di diploidia parziale permette di determinare se mutazioni sono dominanti o recessive Mutazioni nel gene regolatore: lacI- Mutazioni lacI-: il repressore prodotto da lacI- non si può legare a operatore: produzione costitutiva di β-galattosidasi. Il diploide parziale con genotipo lacI+ lacZ-/lacI- lacZ+ funziona normalmente sintetizzando la β-galattosidasi solo in presenza del lattosio. Il gene lacI+ è dominante su lacI- ed è attivo in trans copie portate da F’ copie portate dal cromosoma Mutazioni super repressori: lacIs Producono dei repressori difettosi che non possono essere disattivati da un induttore Le mutazioni lacIs producono un repressore con un sito di legame all’induttore alterato che rendono l’induttore incapace di legarsi al repressore; il repressore è sempre in grado di unirsi al sito dell’operatore e di impedire la trascrizione dei geni lac. Le mutazioni super repressori sono dominanti su lacI+; i diploidi parziali con genotipo lacIs lacZ+/lacI+ lacZ+ non sono in grado di sintetizzare la β-galattosidasi e la permeasi, in presenza del lattosio o meno; la mutazione è attiva in trans copie portate da F’ copie portate dal cromosoma Mutazioni dell’operatore Le mutazioni lacOc alterano la sequenza del DNA a livello dell’operatore: la proteina repressore non può più legarsi Il diploide parziale lacI+ lacO+ lacZ-/lacI+ lacOc lacZ+ mostra sintesi costitutiva di β- galattosidasi indicando quindi che lacOc è dominante su lacO+; la mutazione è attiva in cis Mutazioni del promotore indicate come lacP- e interferiscono con il legame dell’RNA polimerasi al promotore ceppi di E. coli con le mutazioni lacP- non producono le proteine lac né in presenza né in assenza di lattosio sono attive in cis e influenzano solo i geni posti sulla stessa molecola di DNA diploide parziale lacI+ lacP+ lacZ+/lacI+ lacP- lac Z+ mostra una sintesi normale della β- galattosidasi, lacI+ lacP- lacZ+/lacI+ lacP+ lacZ- non è in grado di produrre β-galattosidasi, in presenza o meno di lattosio SINTESI DEI DIVERSI TIPI DI MUTAZIONE CHE SI VERIFICANO NELL’OPERONE lac  Repressione da cataboliti In un terreno che contiene sia glucosio che lattosio, la crescita batterica segue un andamento bifasico (detto diauxia): in un primo periodo di tempo i batteri aumentano di numero per poi arrestarsi per un breve periodo e poi riprendere a crescere fino a un plateau finale. Quindi, i batteri preferiscono usare prima il gucosio e solo quando è finito usano il lattosio. Quindi in qualche modo il glucosio impedisce la utilizzazione del lattosio (un meccanismo di inibizione che agisce non solo su operone lac, ma anche di molti altri operoni, es quelli del arabinosio, xilosio, sorbitolo ecc.). Questo sistema di regolazione è chiamato repressione da cataboliti. Controllo positivo e repressione da cataboliti CAP (=CRP): proteina attivatrice del catabolita il complesso cAMP-CAP regola molti altri operoni in E.coli (molti preposti all’utilizzo di zuccheri alternativi), che costituiscono quindi un REGULONE, cioè un insieme di operoni diversi controllati da un regolatore comune La CAP deve formare un complesso con l’adenosina-3′, 5′-monofosfato ciclico (cAMP) prima di legarsi al promotore dell’operone lac. Il legame cAMP-CAP al promotore attiva la trascrizione facilitando il legame dell’RNA polimerasi. I livelli di cAMP sono inversamente proporzionali a quelli del glucosio: una bassa concentrazione di glucosio stimola elevati livelli di cAMP, mentre un’alta concentrazione di glucosio stimola bassi livelli di cAMP. La CAP contiene un motivo di legame al DNA elica-ripiegamento-elica e, quando si lega al DNA a livello del sito CAP, provoca un ripiegamento nell’elica. Il ripiegamento dell’elica consente alla CAP di agevolare il legame dell’RNA polimerasi al promotore e l’inizio della trascrizione. L’operone reprimibile trp di E. coli L’operone triptofano (trp) di E. coli è un esempio di operone reprimibile negativo: la trascrizione è attiva in condizioni normali e per cessare deve essere repressa. Quando i livelli di triptofano sono bassi, l’RNA polimerasi si lega al promotore e trascrive i geni strutturali. A una certa distanza dall’operone trp si trova il gene regolatore trpR, che codifica per un aporepressore, che viene attivato dal Trp così da potersi legare al DNA Arabinosio: C5H10O5 B) REGOLAZIONE A LIVELLO DELLA FASE DI ALLUNGAMENTO DELLA TRASCRIZIONE: ATTENUAZIONE L’attenuazione nell’operone trp di E. coli 5’ UTR gene trpE: quando il livello di Trp è alto, si forma la struttura 3 + 4 (attenuatore), la trascrizione si arresta nella 5′ UTR e non viene sintetizzato Trp. Quando il livello di Trp è basso, si forma la struttura 2 + 3 (antiterminatore), la trascrizione prosegue attraverso i geni strutturali e il Trp viene sintetizzato. Come si forma la struttura attenuatore quando il livello di Trp è alto e antiterminatore quando il livello è basso? Un riassunto degli eventi dei processi di attenuazione e antiterminazione Perché i batteri hanno bisogno sia dell’attenuazione nell’operone trp che della repressione a livello del sito dell’operatore? 1) la repressione non è mai completa; c’è un po’ di trascrizione anche quando il repressore trp è attivo; la repressione riduce la trascrizione solo di circa 70 volte. L’attenuazione può ancora ridurre la trascrizione di 8-10 volte, così i due processi insieme sono in grado di ridurre la trascrizione dell’operone trp più di 600 volte 2) l’attenuazione e la repressione rispondono a segnali diversi: la repressione risponde ai livelli cellulari di triptofano, mentre l’attenuazione risponde al numero di tRNA carichi di triptofano. Possono esserci momenti in cui è vantaggioso per la cellula avere la capacità di rispondere a questi segnali differenti 3) il repressore trp influenza svariati operoni, oltre a quello per il triptofano. In uno stadio iniziale dell’evoluzione di E. coli l’operone trp può essere stato controllato solo dall’attenuazione. Il repressore trp può essersi evoluto in origine per controllare altri operoni e solo casualmente è giunto a influenzare l’operone trp Altri operoni preposti alla sintesi di AA sono regolati da sistemi di attenuazione; in ciascuno di essi è presente un peptide leader che contiene un elevato numero di codoni per l’AA C) REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE small RNA (o sRNA), piccole molecole da poche decine a qualche centinaia di nt, non tradotte, che si appaiano a specifiche regioni di un RNA bersaglio per complementarietà (almeno parziale). I principali meccanismi: i) liberano o coprono il sito di attacco dei ribosomi (permettendo o inibendo la traduzione); ii) stabilizzando o destabilizzando un trascritto verso l’azione degradativa di specifiche ribonucleasi Regolazione mediante RNA antisenso del gene omp di E. coli Gene omp di E. coli: codifica per una proteina della membrana esterna che funziona come canale per la diffusione passiva di piccole molecole cariche (ioni) attraverso la membrana cellulare Quando l’osmolarità del mezzo aumenta, la cellula riduce la produzione della proteina OmpF per contribuire a mantenere l’osmolarità cellulare. Si attiva un gene regolatore chiamato micF (RNA complementare d’interferenza con l’mRNA). L’RNA di micF, un RNA antisenso, si lega alla sequenza complementare nella 5′ UTR dell’mRNA di ompF e ne impedisce il legame al ribosoma Alcune molecole di mRNA contengono sequenze regolatrici chiamate ribointerruttori (riboswitch), a cui possono legarsi molecole regolatrici che influenzano l’espressione genica attraverso la formazione di strutture secondarie nell’mRNA. Sembrano essere comuni nei batteri in cui regolano circa il 4% di tutti i geni Un ribointerruttore controlla la sintesi della vitamina B12: quando la forma attiva della vitamina B12, chiamata coenzima B12, è presente, si lega al ribointerruttore e l’mRNA si avvolge in una struttura secondaria che impedisce al ribosoma l’accesso al sito di legame. In assenza del coenzima B12, l’mRNA assume una struttura secondaria differente, nella quale il sito di legame al ribosoma è disponibile e così la traduzione ha inizio, gli enzimi vengono sintetizzati La repressione mediata da RNA attraverso i ribozimi Nella 5′ UTR dell’mRNA di glmS ci sono 75 nucleotidi che agiscono da ribozima. Quando il GlcN6P è assente, il gene glmS viene trascritto e tradotto per produrre l’enzima che sintetizza GlcN6P. Tuttavia, quando il GlcN6P è presente in quantità glucosamina-6-fosfato sufficiente, si lega a una parte di ribozima che può così stimolare una degradazione autonoma della molecola di mRNA D) REGOLAZIONE POST-TRADUZIONALE Blocco della funzione enzimatica da parte del prodotto finale della catena metabolica Es controllo della catena biosintetica del Trp: il prodotto del primo gene, antranilato sintasi, presenta un sito allosterico che viene legato dal Trp; in seguito a legame, il sito catalitico cambia configurazione e viene inattivato.