Modificazioni della Cromatina PDF

Modificazioni della Cromatina FATTORI DI TRASCRIZIONE EUCARIOTICI Si legano agli enhancer o silencer Attivano o reprimono la trascrizione = stimolano o inibiscono l’attività della RNA polimerasi Reclutano l’apparato della trascrizione Interagiscono con componenti de...

Modificazioni della Cromatina FATTORI DI TRASCRIZIONE EUCARIOTICI Si legano agli enhancer o silencer Attivano o reprimono la trascrizione = stimolano o inibiscono l’attività della RNA polimerasi Reclutano l’apparato della trascrizione Interagiscono con componenti del complesso trascrizionale ma non con RNA polimerasi II Oggi vediamo: Richiamano proteine che modificano i nucleosomi per alterare la cromatina in prossimità dei siti di inizio trascrizione Reclutano fattori necessari a rimodellare la cromatina cambiando la spaziatura dei nucleosomi MECCANISMI ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Nell’immagine si osserva il ciclo in cui il DNA organizzato in nucleosomi forma dapprima la fibra da 10nm, poi da 30nm, che può essere a solenoide, zigzag, ecc. Nel momento in cui si legano a un complesso di rimodellamento può esserci l’apertura in cui il DNA riduce l’interazione con gli istoni, permettendo maggiore accessibilità dei fattori di trascrizione. Questi ultimi devono riconoscere sequenze consenso nel DNA, delle basi spaziate che generano un consenso sia in eucarioti che procarioti. Il nucleosoma è composto da un ottameri di proteine, che vengono numerate come H2A, H2B che sono dimeri e H3 e H4 che sono tetrameri, attorno a cui si avvolge il DNA in un paio di giri. Dal core istonico del nucleosoma escono le code istoniche, ovvero le porzioni aminoterminali. Sono costituiti da aminoacidi basici che prendono contatto con i nucleosomi vicini, il che è molto importante per costituire la fibra da 10nm coinvolgendo anche l’istone H1. MODIFICARE LA CARICA Andare a modificare la carica di queste code istoniche, permette attacco o distacco con l’interazione elettrostatica con il DNA negativo. Si può quindi iniziare il processo che va a formare i distacchi necessari per il riconoscimento e il legame dei complessi trascrizionali e dei fattori trascrizionali, permettendo così di reclutare la RNA polimerasi. Quando si parla di fattori generali della trascrizione si intendono i TF2 (TF2D, TF2B, TF2A, TF2F, TF2H), che generano il complesso di pre inizio per posizionare correttamente l’RNA polimerasi al sito di inizio trascrizione, e uesti altri fattori di trascrizione, che contengono le zinc finger, l’homeobox, ecc. legano quello che è definito enhancer. Quindi fattori di trascrizione che hanno il dominio di Il fattore di trascrizione legame al DNA e il dominio richiama degli enzimi che di attivazione che prende vanno a modificare le cariche contatto con le TAF, con il degli istoni. mediatore. Nel momento in cui ad esempio si Si chiamano tutti fattori di toglie la carica basica, la cromatina trascrizione, ma alcuni sono si rilassa esponendo il DNA linker. generali, sono quelli per il complesso di pre inizio, GTF (general transcription factor), gli altri sono solo fattori di trascrizione TF. Nel complesso di rimodellamento il DNA si trova prima avvolto attorno al nucleosoma, poi si stacca. Viene appunto reclutato questo complesso per permettere di staccare in parte i ribosomi e formare lo spazio necessario per formare il complesso di preinizio. Intervengono 4 tipi di enzimi. Prima enzimi che acetilano gli istoni, detti HAT (Histone Acetyl Transferase). AC va ad acetilare le code istoniche, in particolare i residui basici, come lisina. Nel momento in cui viene acetilata, viene favorita la trascrizione in quanto si apre il DNA in modo tale da ricevere i TF e dunque favorire la trascrizione. Sono modificazione transitorie. Sesso rispondono a stimoli della cellula, ad esempio rispondendo a segnali dall’ambiente. Si acetilano le zone in cui ci sono geni che devono e essere espressi, mentre quelli che non servono vengono lasciati deacetilati. Gli istoni sono deacetilati da proteine dette HDAC /Histone HeAcetylase), e tornano a compattarsi, per evitare proliferazione eccessiva.. Il meccanismo meglio conosciuto di alterazione della struttura della cromatina è quello dell’acetilazione degli istoni. ACETILAZIONE delle code N-terminali degli istoni da parte di HAT (Istone Acetil Transferasi) — destabilizzazione delle strutture più compatte della cromatina — facilitazione dell’attività trascrizionale DEACETILAZIONE da parte di HDAC (Istone DeAcetilasi) delle code N-terminali degli istoni — formazione di strutture compatte della cromatina — repressione della trascrizione METILAZIONE delle code N-terminali degli istoni da parte di HMT (Istone Metil Transferasi). Può avvenire in lisine o arginine, dunque sempre aminoacidi basici. La risposta però è molto più complessa: — metilazione delle Lys 4, 36 o 79 dell’istone H3 —> facilitazione dell’attività trascrizionale oppure — metilazione delle Lys 9 o 27 dell’istone H3 —> repressione dell’attività trascrizionale Ci sono dunque tipi di metilazione di alcuni residui che favoriscono, altri che invece sfavoriscono la trascrizione. DEMETILAZIONE da parte di HDM (Istone DeMetilasi) FOSFORILAZIONE di aminoacidi in cui i trova un gruppo ossidrile, in particolare serina e treonina — Ciclicamente durante il ciclo cellulare (istone H1) => Legato al fatto che si devono compattare i cromosomi in fase M — Fosforilazione in Ser10 di H3 avviene solo durante la mitosi — In associazione al rimodellamento della cromatina spesso nell’attivazione dell’espressione Un gruppo fosfato viene aggiunto ad amminoacidi che hanno un ossidrile, sono quindi la tirosina, la serina e la treonina nella catena laterale. Solo questi tre aminoacidi possono essere modificati e in particolar modo questi tipi di fosforilazione degli istoni avvengono in serina, treonina e cosa causano? Un gruppo fosfato e una carica negativa. Il DNA è carico negativo, c’è repulsione. => riassunto degli istoni e dei residui che possono essere modificate. Blu = acetilazione, può avvenire in tutti gli istoni Giallo = fosforilazione può avvenire in tutti gli istoni Rosso = metilazione può avvenire solo nei tetrameri H3 e H4. È particolarmente importante in questi istoni. Ragioneremo molto su alternanza tra acetilazione e metilazione, dunque parleremo principalmente di H4. Sui 3 residui, Lisina 4, 9, 27.  Come detto, l’acetilazione neutralizza la carica positiva della lisina nella catena laterale dell’aminoacido. L’enzima acetiltransferasi utilizza come coenzima l’acetil coenzima A. Come donatore ha l’acetile che è trasferito sul gruppo amminico rimuovendo la carica positiva. Dopo aver neutralizzato la carica, l’istone non può più formare legame elettrostatico con il DNA negativo. Lisina Metilazione La metilazione come detto è più problematica. È catalizzata da Metiltransferasi che usa come substrato S- MetilMetionina, da cui rende il metile e lo trasferisce. Può avvenire, essendo il gruppo metilico piccolo, in monometilazione, demetilazione, fino alla trimetilazione. Viene solitamente specificato se la lisina 27 è mono, di o tri. L’altro residuo che può essere metilato è l’arginina. Anche in questo caso si ha mono, di (simmetrica se non vanno sullo stesso gruppo o asimmetrica), tri. Queste modificazioni formano una struttura che viene riconosciuta da domini proteici. Acetilati = vengono legati da Bromodominio Metilati = vengono legati da cromodominio Ricorda bene la differenza, perchè verranno nominati molto spesso. Il bromodominio ha 4 alpha- eliche. Il residuo di lisina si inserisce tra queste 4 dell’istone H4. Interagisce formando delle interazioni, non covalenti, coi residui aminoacidici della alfa-eliche. Queste interazioni sono alla base della biologia strutturale. Sono il punto di aggancio per altre proteine, non è solo la variazione della carica alla base ma anche il fatto che reclutano per l’appunto altre proteine. Bromodominio che lega istoni acetilati Cromodominio che lega istoni metilati Dominio SANT lega istoni non modificati Abbiamo detto che la metilazione di lisine 9 e 27 possono portare a una chiusura della cromatina. Sono modificate da particolari enzimi specifici per queste, che sono EZH2 e HP1. Il primo lo vedremo a breve. La lisina 4 quando metilata è invece correlata all’attivazione dell’espressione genica. Enzimi diversi metilano lisine diverse, e dunque effetti diversi Rosso = inibitorio Verde = attivatorio Molti di queste MetilTransferasi riconoscono istoni modificati e ne vanno a modificare di adiacenti. COSA SUCCEDE? Consideriamo un locus che deve attivare l’espressione genica. Le acetilazioni degli istoni catalizzate dalle HAT permettono il reclutamento di proteine che ulteriormente modificano la cromatina. Sono state inserite delle sorte di etichette per riconsocere la sequenza acetilata. HAT contengono bromodomini così si propaga alle regioni adiacenti l’acetilazione. Si forma dunque un allargamento della porzione, con rilassamento della cromatina. TFIID stesso contiene un bromodominio che lo indirizza dove i nucleosomi sono acetilati e la cromatina meno compattati. Dunque ha sia TATA-BD, TAF, ecc. dunque il suo iniziale reclutamento è favorito dal bromodominio e poi va in ricerca di tutti gli altri elementi necessari. Si inizia dunque con un TF che recluta un enzima, metiltransferasi o acetiltransferasi, in base a cosa viene richiamato si rilassa la proteina e si generano siti di riconoscimento per Bromodominio o cromodominio. Il Dominio di Attivazione della trascrizione di un Fattore di Trascrizione può legare le HAT in modo diretto o attraverso proteine adattatori. Il dominio può reclutare proteine che Per acetilasi fanno da sempre così impalcatura, a cui si possono legare ad esempio gli istoniacetiltransfer asi per modificare gli istoni adiacenti, ecc. ogni elemento può avere regolazione diversa e domini di attivazione e repressione differenti. La TAF250 di TFIID ha il bromodominio. Dunque TFIID viene facilitato nell’avvicinamento nelle regioni di cromatina per la presenza di questi Bromodomini. Come al solito osserviamo il complesso di inizio di TFIID con TBP. Vediamo che TAF250 ha due bromodomini, ma addirittura un dominio enzimatico con attività di istoni acetiltransferasi. TFIID ha così tantissimissime funzioni. Ci sono molti fattori utilizzati come ad esempio quelli di GAL4. L’acetilazione degli istoni nel locus attivo: Recluta il complesso SAGA (Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase) viene reclutato dall’attivatore della trascrizione Gcn4 L’acetilazione dunque rilassa la cromatina, e viene poi esposta la TATAbox facendo slittare i nucleosomi. CBP/p300 e CREB Binding Protein Sono due isoforme. CREB = cAMP-response-element-binding. È un istone che risponde agli aumenti di AMP ciclico. Il cAMP in base alla quantità presente si comporta da secondo messaggero, è in grado di andare a regolare determinati meccanismi. Il fattore di trascizione lega il DNA, il dominio di attivazione di CREP richiama p300, con attività transacetilasica. CBP = CREB Binding Protein. Contiene: KIX lega CREBS = contiene il dominio per legarlo assieme a vari fattori di trascriione Bromodominio = viene richiamata nelle regioni acetilate per aprire tutto il locus HAT = è una proteina mutlidominio con delle regioni per interagire con vari fattori di trascrizione. Uno specifico per i recettori dei glucocorticoidi, degli ormoni, poi un’altra regione che lega un altro gruppo di fattori di trascrizione. RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA Complessi di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, per spostare gli istoni, destabilizzano la struttura della cromatina attraverso l’idrolisi dell’ATP e spostano i nucleosomi per generare lo spazio per accomodare il complesso pre-inizio. COMPLESSO SWI/SNF Sono in grado di fare slittare gli istoni. BRG1/Brm possiede un attività ATPasica DNA-dipendente, che permette lo spostamento fisico. Recluta poi vari bromodomini. I complessi SWI/SNF possono essere reclutati sul DNA da vari fattori di trascrizione attivatori della trascrizione e richiama bromodomini e fa spostare i ribosomi. Il rimodellamento non-covalente avviene attraverso due meccanismi fondamentali: “slittamento” del nucleosoma ISWI = come tirare una corda e svolgerla cambio conformazionale “bulging” SWI/SNF = rilassata la corda per poterla spostare Immaginiamo di avere i nucleosomi con il DNA avvolto, non completamente di due giri e il DNA linker. Ci sono i vari complessi, e in particolare all’interno BRG1. Viene reclutato l’istone acetil tansferasi, che acetila gli istoni. Dunque i bromodomini dei complessi reclutano il complesso in quella regione. Aprono un po’ il DNA del nucleosoma e lo fanno slittare, così aumenta la distanza fra i due nucleosomi. Questi sono i nucleosomi e li immaginiamo come dei cilindri con il DNA avvolto per un giro e tre quarti e il DNA linker. Ci sono diversi complessi di SWI/SNF. Quello che ci interessa è che ci siano all’interno i BRM, vediamo BRG uno che fanno attività ATPasica per facilitare questi slittamenti e serve energia. Il fattore di trascrizione ha reclutato l’istone acetil transferasi, CBP p300, la istone acetiltransferasi ha acetilato gli istoni e quindi i bromo domini di questi complessi reclutano un complesso in questa regione. Quello che fanno è andare ad aprire un po’ il DNA del nucleosoma e farlo slittare.  RIASSUMENDO Immaginiamo di avere la TATA box schermata, e pertanto non accessibile alla TBP. Come inzia l’apertura del locus? Supponiamo ci sia un enancher a monte o a valle, che lega un fattore di trascrizione, con dominio di legame al DNA con 5 zinc finger in tandem e un dominio di attivazione. Si va a reclutare l’istone acetil transferasi, che modifica le code istoniche, per esempio lisina 9 dell’istone H3. Comincia l’acetilazione. Può seguire la fosforilazione, aggiungendo cariche negative e avendo dunque la repulsione con il DNA. Può avvenire facilmente ad esempio con l’istone H3 nella serina. La TATA box inizia ad essere esposta. TFIID ha i bromodomini e la TBP in grado di legarsi alla TATAbox. Intanto gli istoni acetilati hanno chiamato il complesso che permette di aprire la regione. Così si può reclutare tutto il complesso di pre-inizio con gli altri fattori generali per la tanscrizione. Dopo ci sarà bisogno di TFIIH, con CDK7 che va a fosforilare la coda della RNApolimerasi per staccarla dai fattori di trascrizione per permetterle di andare ad effettuare la trascrizione (evasione dal promotore). => Stesso concetto nel caso di un lievito e di SAGA e SWI/SNF. Questo è l’esempio invece di un fattore di trascrizione che è stato studiato nella lievito. Gcn5 lega il suo l’elemento promotoriale, il suo enhencer, va a reclutare SAGA che contiene un istone acetiltransferasi con il suo dominio di attivazione della trascrizione e vengono acetilati gli istoni. Qui fa vedere che l’istone acetilato recluta SWI/SNF che allargano la regione e TF2D con il suo bromo dominio va a legare gli istoni acetilati e lega con la TATA binding protein la TATA box COME LO STESSO LOCUS VA A REPRIMERE? In parte a chiudere un locus sono le istoni deacetilasi, che rimuovono il gruppo acetile, le lisine tornano ad essere basiche e ricompattano la cromatina, inoltre rimuovono il segnale che viene riconosciuto dalle proteine che rimodellano la cromatina. Le HDAC favoriscono il compattamento della cromatina e reprimono la trascrizione. Si chiamano in questo modo perchè la prima caratterizzazione è stata con enzimi che vanno a modificare gli istoni. Ci sono però delle HDAC che non si trovano solo nel nucleo a modificare istoni, si trovano magari anche nel citoplasma per andare a modificare delle altre proteine. Sono enzimi dipendenti da zinco che rimuovono i gruppi acetili degli istoni, ce ne sono varie classi. Hanno un dominio proteico con funzione enzimatica. Le HDAC non legano direttamente i fattori di trascrizione, ma delle proteine che fanno da palcatura dette scaffold. Le istoni acetiltransferasi come CBP p300 ha domini che interagiscono con i domini di attivazione della trascrizione in modo diretto, quindi la stessa proteina ha i domini di legame ai fattori di trascrizione, al dominio di attivazione della trascrizione e ha il domino enzimatico per trasferire l’acetile; le HDAC, le istone deacetilasi non legano in modo diretto i fattori di trascrizione ma legano delle piattaforme, quindi delle proteine, che fanno da impalcatura o adattatore. Nel disegno in basso nella slide la freccia indica che si attiva mentre la barra indica che reprime la trascrizione. Vediamo che ci sono le HDAC che vanno a deacetilare gli istoni ma sono portate qui da queste proteine che sono delle proteine impalcatura. Nel lievito c’è un fattore di trascrizione che recluta un repressore della trascrizione Sin3 che porta con sè degli istoni deacetilasi. La cromatina viene così compattata e TATA box non è esposta ma chiusa dentro al nucleosoma.  Ad esempio gli N-CoR vanno a reclutare fattori di trascrizione, o HDAC. Si forma un enorme complesso proteico per la chiusura. Spesso sono reclutate le HMT, ovvero le istoni metil transferasi. In particolare per quanto riguarda lisina 9 e lisina 27, che può portare a compattazione della cromatina. Ragioniamo proprio su queste due. Il silenziamento dell’espressione genica correlata con eterocromatina in cui i nucleosomi vengono modificati da metilazione. Ad esempio Nella cromatina c’è un confine in cui la porzione a sinistra è acetilata e attiva, mentre a destra c’è una regione metilata diffusa (spreading) per silenziare tutta la regione. Immaginiamo ci sia ad esempio un elemento MAR che si aggancia alle lamine presenti nel nucleo per andare a formare questo confine. Da un lato si legano acetil transferasi e dall’altro metiltransferasi, avendo una regione aperta e chiusa. COMPLESSO POLYCOMB È coinvolto molto nella formazione di quella che è chiamata eterocromatina, molto compattata. Pertanto ha varie funzioni all’interno delle cellule. È un nome ricevuto perchè studiato in modello genetico della drosophila. È formato da due complessi di proteine, POLYCOMB 1 e POLYCOMB 2. Il 2 è il primo ad essere reclutato ad esempio da domini che sono in grado di chiamare fattori di trascrizione. Va a metilare altamente la lisina 27, trimetilazione. Questo porta ad essere riconosciuto da proteine che contengono il cromodominio, tra queste POLYCOMB1 che quando viene reclutato continua a modificare la cromatina. EZH2 che fa parte di POLYCOMB2 va a portare la metilazione sulla lisina. Viene richiamato POLYCOMB1 con un dominio per dare ubiquitazione. L’ubiquitina è una piccola proteina aggiunta da enzimi specifici che trasferisce il suo carbossiterminale sulle lisine. Può essercene solo una, e in questo caso non manda a degradazione la proteine, anzi richiama altre proteine differenti, quindi è comunque un’etichetta.  Acetilazione e metilazione vanno a richiamare diversi tipi di ubiquitinazione, che portano a risultati differenti. Spesso comunque è legata a una cromatina compattata. Questo è importante perchè è un altro meccanismo che va verso la compattazione della cromatina. L’ubiquitinazione: gli istoni acetilati reclutano enzimi che tolgono l’ubiquitina alla lisina 119 per esempio dell’istone H2A oppure si può vedere che invece la metilazione favorisce questa ubiquitinazione e questo si vede come l’ubiquitinazione va ad interferire con la fosforilazione dell’istone H1 quindi spesso l’ubiquitinazione è correlata a una cromatina compattata, favorita dalla metilazione e sfavorita dall’acetilazione quindi, mentre acetilo gli istoni, recluto degli enzimi che tolgono l’ubiquitina. RIPARAZIONE DEL DNA Quando si è parlato del danno alle DNA si è parlato delle chinasi PK, che vanno a modificare e fosforilare in particolare l’istone H2AX. Viene richiama la DNA-PK che fosforila gli istoni assieme ad ATM. Gli istoni sensibili a queste fosforilazioni sono principalmente H2AX, definito come istoni inserito nel genoma non in tutti i nucleosomi, paragonato alle colonnine SOS in autostrada. È un modo quando viene fosforilato per richiamare tutto il sistema per andare ad attivare tutto il meccanismo di riparo al DNA. Il silenziamento genico è caratterizzato non solo da metilazione degli istoni ma anche da metilazione del DNA stesso.  Regolazione trascrizionale in Eucarioti Primo concetto è che ci sono promotori basali con la TATAbox, ma un’alta percentuale anche di promotori TATaless. Non è una regola generale ma spesso i geni housekeeping, che producono proteine per ogni tipo cellulare necessarie alla sopravvivenza, hanno TATAbox. Geni meno specifici invece spesso non la hanno. I primi due elementi li abbiamo già visti: Iniziatore = legato da TAF1 e TAF2 ricco di pirimidine TATA box = legato da TBP della TFIID Ci sono poi elementi molto comuni quali: CAAT box = elemento frequente spesso con la TATA box, dunque in geni housekeeping. È legato da proteine specifiche con CBF (CAAT Binding Factor) GC box = sequenze ricche di G e C a cui si lega il fattore SP1. È un fattore di trascrizione presente nei promotori TATA less. Sono le CpG Island. La presenza della TATAbox posizionata in modo preciso comporta un’influenza sul sito di inizio trascrizione. SITO DI INIZIO TRASCRZIONE TATAbox Può trovarsi prima o dopo il sito definito solitamente +1. Questo non è così importante perchè per così pochi nucleotidi non ci sarà spazio er un elemento regolatorio, inoltre nessun trascritto inizia con AUG, dunque non va ad impattare con la lettura da parte del ribosoma. Questo proprio perchè c’è un’elasticità a livello del sito di trascrizione. Sono stati definiti con gli esperimenti già visti: rilevando il CAP, tagliando il legame fosfoanidridico, mettendo l’adattatore e andando a osservare dove si trova il sito di inizio trascrizione. Sono detti focali, perchè regioni strette. È legata TBP. TATAless Quando manca la TATAbox, mancano di DPE, ma sono ricchi di GC island, il sito di trascrizione varia enormemente, e questo può chiaramente avere delle influenze, perchè si parla di regioni trascritte molto grandi che possono accomodare elementi regolatori. Viene detta regione broad, larga. Vengono legati da SP1 in particolare. Come mai ci sono elementi così aspecifici? Quali sono i vantaggi? Si può regolare l’espressione genica in modo ancora più dinamico, quindi può essere utile per alcuni geni che devono essere regolati in fasi diverse della vita cellulare. CpG ISLAND È una regione ricca in CG di 0.3-2 kbp (CpG island) a circa 100bp dalla regione dei siti di inizio del 40% dei promotore. Le CpG islands contengono siti di legame fattori di trascrizione come SP1 e CTCF (Zn-finger). CG --> può avvenire metilazione della C I CG delle CpG islands dei geni espressi non vengono metilati —> Difetti di metilazione delle CpG islands spesso correlati con cancro, in quanto ha degli effetti sulla trascrizione.  METILAZIONE C Come abbiamo visto ieri ci sono proteine con un cromodominio che vanno a propagare nella regione lo stato di metilazione, che richiamano anche altri enzimi metilatori come DNA metil transferasi. Queste vanno a metilare, non più le proteine e gli istoni, ma il DNA e in particolare modo proprio la Citosina. Dunque nelle regione di CpG Island la C può essere metilate in posizione 5. Un DNA con deacetilazione, metilazione degli istoni e metilazione del DNA, è correlata alla presenza di cromatina chiusa, che non permette la trascrizione, e viceversa. Il silenziamento genico è caratterizzato non solo da metilazione degli istoni ma anche da metilazione del DNA. In questo caso si osserva la presenza di Lisina 9 metilata e alla presenza di HP1 che richiama DNA metil Transferasi per metilare anche il DNA. Eliminando il gruppo amminico con deaminasi, la citosina diventa una T, per formazione di un gruppo chetonico, che può dunque portare a mutazioni. Mutazioni nei promotori possono interferire con i legami dei fattori di trascrizione, se le C intervengono nei legami con gli aminoacidi. Il tutto è legato a difetti di trascrizione e malattie.  Questa è la cristallina AA ed è uno chaperon. Le chaperon vanno a favorire il Lo stato di metilazione delle folding, hanno molte funzioni che vanno CpG islands può variare sul bilanciamento del metabolismo durante l’invecchiamento o cellulare. nelle patologie. SP1 e gli altri elementi di trascrizione, legano l’elemento promotoriale quando c’è bassa metilazione. Quando con l’invecchiamento aumenta la metilazione, si osserva che il fattore non riesce più a legarlo e non avviene la trascrizione. Si osserva anche che la variazione dell’espressione di vari geni può portare allo sviluppo del cancro, sopratutto se si parla di oncogeni importanti, come RAS o p53. È dunque correlata anche allo stato di metilazione del DNA. Avvengono sopratutto modificazioni in: Regioni ripetute, tipo line, e quindi queste regioni derivate da trasposoni del tipo retrotrasposoni, queste regioni ripetute che si sono spostate nel genoma vengono usate nella genomica forense vanno a guardare le regioni derivate spesso da trasposoni. Nelle regioni ripetute ci può essere una variazione dello stato per esempio di metilazione che può avere un’influenza. CpG island promoter, non riesce a legare più i fattori per far avvenire la trascrizione CpG island shore , nel caso ad esempio di enancher, anche in questo caso si possono avere problemi nella trascrizione Geni La metilazione del DNA è dunque un argomento di grande attenzione da parte dei ricercatori che studiano i meccanismi alla base del cancro. CONCETTI GENERALI DA AVERE CHIARI Le cellule di un organismo pluricellulare hanno caratteristiche molto diverse. Ad esempio osservando un linfocita e un motoneurone (lungo più di 1m), si può immaginare la differenza di dimensione e le funzioni. Il primo molto piccolo coinvolto nella risposta immunitaria, il secondo molto più grande con il compito di inviare stimoli. Dunque morfologia e funzione si devono chiaramente basare su regolazioni tracrizionali differenti. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule verranno portate a svilupparsi in modo differente attraverso la diversa attivazione della trascrizione. Partendo da cellule embrionali dello zigote, sono totipotenti, divisione dopo divisione si formano morula, blastula, massa cellulare interna, tutti ancora totipotenti. Pian piano dopo però iniziano ad acquisire caratteristiche differenti. Immaginiamo che la cellula embrionale sia durante la gastrulazione, questa si divide e inizia ad essere trascritto un fattore di trascrizione in una delle figlie e nell’altra no. Si iniziano già ad avere delle caratteristiche differenti. E così via, continuano ad essere trascritti dei fattori differenti divisione dopo divisione ottenendo sempre più cellule con caratteristiche differenti. Questo in modo casuale o meglio in base a stimoli esterni. Il diverso corredo di fattori di trascrizione permette alla cellula di specializzarsi in un tipo piuttosto che in un altro. Spesso durante questi eventi di accensione di fattori di trascrizione, si accendono fattori molto importanti. Ad esempio PAX6 fondamentale nello sviluppo dell’occhio. Questi vengono detti Master Gene per un determinato tipo cellulare. I ricercatori hanno fatto degli esperimenti nella drosophila e hanno visto che se facevano esprimere pax 6 nella regione che formava la zampa li si formava un occhio ma soprattutto questo occhio formava dei neuroni che andavano fino al cervello della mosca ed era funzionale solo esprimendo un fattore di trascrizione che si chiama pax 6. Poi hanno visto che pax 6 c’è anche in animali come i vertebrati, nel pesce, nella rana, fino all’uomo e infatti mutazioni in pax 6 nell’uomo causano una malattia genetica che si chiama microftalmia quindi l’occhio piccolissimo, sono quasi chiusi. Questo per far capire come nell’evoluzione un fattore di trascrizione può essere chiave per la formazione di un intero organo. EFFETTO SINERGICO Solitamente i fattori di trascrizione lavorano in modo cooperativo. Possono legare due elementi con i promotori adiacenti e prendere loro stessi contatto. Lavorano così come le SMA che trasducono il segnale di TGF beta, la trasforma in row factor beta, le SMA lavorano in questo modo solo se appaiate ad un altro fattore di trascrizione con siti adiacenti. I siti possono essere lontani ed è presente un terzo fattore che va a favorire il reclutamento in più siti Il meccanismo più comune ha un primo fattore di trascrizione che accede al suo elemento di legame è nella cromatina. L’altro fattore non riesce a legarsi. Il primo allora agisce in modo cooperativo andando a reclutare i fattori che permettono di modificare la cromatina e fare slittare il nucleosoma. In questo modo può legarsi anche il secondo fattore. Quest’ultimo caso ad esempio avviene nel lievito. Il fattore blu si può legare perchè ha il sito di legame accessibile, va a reclutare i complessi di reclutamento e l’istone acetilasi, per rendere il sito accessibile anche a SBF. Questo è attivato solo in alcune fasi del ciclo cellulare, non avviene sempre.  L’accessibilità dei siti può avvenire in questi modi classici, on acetilazione e slittamento dei nucleosomi. Ci sono però delle situazioni in cui la cromatina ha delle conformazioni particolari. Ad esempio nel caso dell’interferone ß, con dei promotori particolarmente caratterizzati. L’interferone è una delle citochine che regolano l’attività del sistema immunitario quindi sono delle molecole rilasciate nello spazio extracellulare importantissime per regolare la risposta immunitaria. In questo caso l’enancher in condizioni di non trascrizione è ripiegato, con angolature di 20/25°. Se si lega la proteina non c’è poi lo spazio perchè si leghino i vari fattori di trascrizione necessari per attivare l’espressione di questo gene. Solo quando viene espressa HMGA1, si lega al DNA nel solco minore permettendo la linearizzazione della cromatina, i siti diventano disponibili ai propri fattori di trascrizione che interagiscono in modo cooperativo (dei quali non devi sapere i nomi). Dunque ci sono anche fattori che pongono la cromatina in maniera più lineare, non solo slittamento di nucleosomi. FATTORI SPECIFICI E UBIQUITARI Transtiretina => viene espressa solamente in epatociti e non è espresso in altri tipi cellulari del nostro corpo. Questo è dato da interazioni cooperative, infatti ci aveva fatto vedere due fattori, giallo e blu, che si legano uno accanto all’altro e sono entrambi necessari per attivare la trascrizione genica. Ci sono vari siti di legame per vari fattori di trascrizione. AP1 bZip lo abbiamo visto, composto da Jun e Fos abbastanza ubiquitario, è coinvolto nella regolazione di vari geni. HNF1 proteina con omeodominio epato-specifica HNF3 proteina epato-specifica HNF4 proteina epato-specifica, recettore nucleare espressa anche nell’intestino e nel rene, omeodominio C/EBP bZip espresso in cellule intestinali, neuroni, adipociti ed epatociti Anche se due di questi fattori sono presenti in altri tipi cellulari TTR viene trascritto solo negli epatociti. Non ci sono solo solo tessuto specifici a regolare, ma anche ubiquitari, i primi danno specificità, i secondi danno forte espressione genica. Ci sono regioni in cui si legano TBP e gli altri fattori. C’è un’enancher più prossimale e una più distale. Le palline rappresentano i siti di legame per gli elementi promotoriali. Infine gli activation domain che prendono contatto con il mediatore viola, oppure con le TAF di TFIID. Oppure coattivatori verdi che sono delle Complesso HAT, istoni acetil transferasi. Pil Inizio - Fattori tessuto specifici devono collaborare con fattori ubiquitari, perchè hanno domini di trascrizione più potenti per interagire con TAF. Solo la presenza contemporanea di tutti e cinque i fattori garantisce l’attivazione della trascrizione di TTR. FATTORI INDUCIBILI Le cellule ricevono dall’esterno segnali da altre molecole o altre cellule, e in base a questo rispondono, cambinado l’espressione in base a questi stimoli. In un organismo pluricellulare ci sono moltissimi stimoli e moltissime risposte differenti. Le cellule rispondono in tempi brevissimi, tutto ciò è mediato da sistemi detti inducibili. ORMONI GLUCOCORTICOIDI L’attività di alcuni fattori di trascrizione può essere regolata attraverso il legame con un ligando e la variazione della localizzazione sub-cellulare. Le nostre cellule rispondono costantemente a questi tipi di segnalazione, pertanto è uno dei sistemi inducibili più utilizzati. Il recettore per i glucocorticoidi viene trattenuto dalle proteine Hsp. Quando arriva l’ormone viene sequestrata questa proteina che tiene legato il fattore di trascrizione, che si ritrova ora libero di entrare nel nucleo e attivare la trascrizione. Noi usiamo questo sistema per indurre l’espressione in cellule eucariotiche. I ricercatori hanno evidenziato con immunofluorescenza dove si trova il recettore. Si osserva la palla nera che è dove si trova il nucleo. Aggiungendo l’ormone si osserva proprio il trasferimento al citoplasma al nucleo. Sono dunque sistemi molto efficienti. C’è una regione di legame per l’ormone, formata da molte alpha eliche. Ci soffermiamo sull’ alpha elica 12, che dopo l’entrata dell’ormone si ripiega e va a prendere contatto con CBP/p300, istone acetil tranferasi. L’ormone legando un dominio proteico dunque ne varia la conformazione, permettendo l’interazione o con un fattore di trascrizione, non lega il DNA in modo diretto dunque ma é necessario per attivare tutta la cascata di eventi per la trascrizione.  CITOCHINE => regolano tutte le risposte immunitarie. Sono prodotte dai linfociti T. Quando la proteina, che non può attraversare la membrana plasmatica, interagisce con il suo recettore sulla membrana, questa causa degli eventi all’interno della cellula (non vanno saputi), in cui il fattore di trascrizione viene fosforilato, questo può così formare un complesso che entra nel nucleo, lega il promotore e va ad attivare la trascrizione. Quindi il recettore stimolato dal segnale, la citochina, ha un’attività chinasica e va a fosforilare il fattore di trascrizione che entra nel nucleo e lega il promotore. Anche questa è una risposta molto veloce. NF-kB È un fattore di trascrizione importante per la risposta immunitaria. Anch’esso risponde in modo inducibile. È importante l’attivazione in risposta in antigeni per rispondere velocemente. Il fattore di trascrizione NF-kB, blu, è un dimero, in condizioni di riposo, senza stimoli da parte del sistema immunitario, si trova legato a I-kB, inibitore dunque, rosa, che lo sequestra e lo mantiene all’interno del citoplasma in modo che non possa agire come fattore di trascrizione. Quando arriva il segnale, la risposta immunitaria, I-kB viene fosforilato, poliubiquinato, portando così alla sua degradazione mediante proteasoma. Si libera il fattore di trascrizione che può così entrare nel nucleo. CONTROLLO A DISTANZA Abbiamo visto come la cromatina sia a volte caratterizzata da un confine, da una parte avviene la tracrizione dall’altra no. C’è infatti la possibilità di isolare regioni di cromatina, per permettere la trascrizione da un lato e dall’altro no. Ci sono siti di legame per proteine che fanno da isolatori. L’isolatore non reprime attivamente il promotore ma blocca la possibiltà di comunicazione tra enhancer e complesso di pre-inizio. L’enancher si lega e ha influenza sul promotore per attivare il gene Se tra enancher e gene si lega un isolatore, questo li isola, impedisce all’enancher di agire su questo promotore Questo può favorire l’attivazione da parte dell’enancher di un altro promotore che si trova a sinistra Il promotore può essere invece attivato da un enancher differente. L’enancher è spesso legato dalla proteina CTCF, che agisce da isolatore, portando a formare anse nel genoma, bloccando la polimerasi. Le diverse conformazioni che fa assumere alla cromatina, permette l’attivazione di un gene piuttosto che un altro. Apre o chiude regioni di DNA per far avvenire la trascrizione. CTCF è un TF Zn-finger il cui sito di legame può essere regolato da metilazione. Ha diversi moduli, infatti le Zn- finger sono solitamente in tandem. Riconosce dunque moduli uno accanto all’altro. Sono ricchi in CG. Nel momento in cui viene metilata la regione del legame con CTCF questo non può rimanere legato e può così avvenire la trascrizione. Si forma un confine dato dal legame con questo fattore. L’isolatore forma delle anse avvicinando un determinato promotore, non permettendo l’avvicinamento di un altro, isolando. Una sola proteina non può formare anse così chiuse, va quindi a reclutare altre proteine filamentose, come le coesine, che formano così degli anelli che vanno a chiudere l’ansa. Non si lega nulla in modo casuale, ma in modo altamente specifico ma elastico, per permettere al sistema biologico di rispondere a stimoli esterni in maniera molto efficiente. CLLUSTER GENICI Ci sono regioni genomiche che scrivono diversi geni correlati nella loro funzione e che vengono accesi in tempi diversi durante lo sviluppo embrionale. GLOBINA UMANA I geni per la globina umana sono 5, organizzati in un cluster sullo stesso cromosoma 11 ed espressi in tempi diversi durante lo sviluppo embrionale. La regolazione è molto precisa ed elevata, con promotori specifici basali per ogni gene. Ogni gene presenta elementi di regolazione sia a monte che a valle. C’è una regione di controllo per tutti: LCR (Locus Control Region) è 30-50 kb a monte ha funzione di enhancer o isolatore ed è necessario per tutti i geni del cluster al fine dell’espressione. I geni nello stato adulto, A livello di stadio hanno un LCR che lega dei embrionale viene fattori che fanno avvicinare il espressa dal sacco promotore beta, ma non vitellino la globina epsilon e gamma, per lasciarli epsilon. non attivati, generando un ansa nella cromatina. Quando si passa allo stato fetale, non veniva comunque espressa l’emoglobina come ora, ma quella gamma, ed espressa dal fegato. Dopo la nascita, quando si sviluppa il midollo osseo, iniziano ad accendersi i geni beta e delta, che vanno a comporre l’emoglobina. Sono dunque vari geni che permettono di accendere sequenzialmente in tessuti differenti i geni presenti nel cluster. Questo è un tipo di alta regolazione genica. È una regione regolata anche dalla metilazione. LCR va a formare un ansa nello stato fetale andando ad attivare l’espressione dei geni che legano fattori di trascrizione, in particolare KLF1, che interagisce coi fattori che legano LCR. Si avvinina LCR stesso ai promotori beta. Quando si passa allo stato adulto i promotori vengono occupati da altri fattori di trascrizione che silenziano i geni, così LCR riesce a legare delta e beta. Dunque non dipende tutto solo da LCR, ma anche da fattori specifici che legano i promotori e prermettono di interagire coi promotori. Per questo LCR è definito sia come enancher sia come isolatore, perchè andando a chiudere l’ansa sfavorisce da una parte il legame e l’espressione, o dall’altra parte. È un processo sequenziale dovuto a LCR che forma anse diverse in tipi cellulari e fasi cellulari differenti. GENI HOX Sono stati clonati e caratterizzati in Drosophila, sono fattori di tracrizione che hanno dato il nome all’omodominio. La disposizione nel genoma dei geni corrisponde ai geni che vengono poi espressi in determinate zone del corpo. Anche nell’uomo ci sono 4 cluster, che regolano la disposizione anteriore e posteriore. Gli Hox possono favorire l’organizzazione dell’arto. Sono importantissimi dunque durante lo sviluppo embrionale. Mutazioni di Hox sono correlate a forme di cancro, pertanto la loro regolazione è importantissima. Hox = geni ometici, in quanto le mutazioni nei geni omeotici causano la trasformazione di un segmento in un altro per omeosi. In figura a si vede una Drosophila normale, con gli occhi tipici a lampone, l’antenna, 6 zampe, un paio di ali e un paio di bilancieri. La mutazione nel gene chiamato “antennapedia” porta ad avere al posto dell’antenna delle zampe. Mutazione “ultrabithorax” invece presenta due coppie di ali invece che una. Nell’uomo contribuisce a definire il numero delle vertebre. Si vede che vengono espressi diversi geni Hox in diverse porzioni dell’embrione.  La regolazione di Hox è dunque chiave per definire la differenziazione antero-posteriore. Soffermiamoci su locus HoxD. Ha una regione che controlla globalmente il cluster = Global Control Region GCL a monte E un EE Global Early Enancher. Nelle prime fasi di sviluppo si attiva e lavora principalmente EE. Durante lo sviluppo si attiva poi GCR, permettendo l’attivazione di Nel nucleo, durante il geni in maniera sequenziale. differenziamento si ha il locus degli Hox. All’inizio dello sviluppo embrionale il locus è spento, si trova la coda dell’istone H3 con lisina 27 trimetilata. Il sistema Polycomb è infatti stato studiato su questi geni. Quindi si mantiene una cromatina compatta. EE inizia ad essere legato, permettendo di aprire solo una parte dei locus degli Hox. Una sola regione viene spostata fuori dalla regione chiusa. Viene tolta la metilazione in lisina 27, e viene metilata la 4. Andando avanti nello sviluppo embrionale un’altra porzione, in quanto si iniziano ad esprimere anche i fattori che legano il GCR, viene attivata. I cromosomi vengono studiati in metafase. Durante l’interfase c’è un groviglio di cromatina che però non è disposta in modo casuale, vengono spesso trovati questi geni in territori cromosomici. Pure essendo in cromosomi diversi, le anse possono essere avvicinati. Dunque vengono disposte le anse per formare dei territori cromosomici per avere una regolazione comune anche provenendo da cromosomi diversi.