Genetica I PDF - Giampiero Valè

GENETICA I Giampiero Valè Elementi principali di regolazione genica degli eucarioti Maggiori differenze nella regolazione genica tra pro- ed eucarioti 1) la gran parte dei geni eucarioti sono dotati di loro promotori specifici e vengono trascritti separatamente. 2) la struttura della cromatina...

GENETICA I Giampiero Valè Elementi principali di regolazione genica degli eucarioti Maggiori differenze nella regolazione genica tra pro- ed eucarioti 1) la gran parte dei geni eucarioti sono dotati di loro promotori specifici e vengono trascritti separatamente. 2) la struttura della cromatina influenza l’espressione genica nelle cellule eucarioti; il DNA deve svolgersi dalle proteine istoniche prima che la trascrizione possa iniziare. 3) la presenza della membrana nucleare che nelle cellule eucarioti separa la trascrizione e la traduzione nel tempo e nello spazio. Perciò la regolazione dell’espressione genica nelle cellule eucarioti è caratterizzata da un grande varietà di meccanismi che intervengono in punti diversi della trasmissione dell’informazione dal DNA alle proteine Processi che influiscono sulla espressione dei geni A) Rimodellamento della cromatina B) Modificazione degli istoni C) Metilazione del DNA D) Meccanismi di regolazione coordinata A) Rimodellamento della cromatina Alcuni fattori di trascrizione e altre proteine regolatrici alterano la struttura della cromatina senza alterare direttamente la struttura chimica degli istoni. Queste proteine prendono il nome di complessi di rimodellamento della cromatina: si legano direttamente a particolari siti del DNA e riposizionano i nucleosomi, consentendo ai fattori di trascrizione e all’RNA polimerasi di legarsi ai promotori e di dare inizio alla trascrizione B) Modificazione degli istoni La metilazione degli istoni: Enzimi chiamati istone metiltransferasi aggiungono gruppi metile a determinati amminoacidi (di solito lisina o arginina) delle proteine istoniche. Altri enzimi, detti istone demetilasi, rimuovono i gruppi metile dagli istoni. Un tipo comune di modificazione è l’aggiunta di tre gruppi metile alla lisina 4 nella coda della proteina istonica H3, abbreviata in H3K4me3. Negli eucarioti, gli istoni contenenti la modificazione H3K4me3 si trovano sovente vicini ai promotori dei geni attivi. Proteine che riconoscono H3K4me3 possiedono un dominio che si lega alla coda dell’istone H3 e altera l’impacchettamento della cromatina consentendo la trascrizione L’acetilazione degli istoni: aggiunta di gruppi acetile (CH3CO), è un altro tipo di modificazione istonica (es dell’istone H4 ) che di solito stimola la trascrizione. I gruppi acetile vengono aggiunti alle proteine istoniche dagli enzimi acetiltransferasi; altri enzimi, detti deacetilasi, rimuovono i gruppi acetile MODIFICAZIONI DIVERSE DELLA CROMATINA HANNO EFFETTI DIVERSIFICATI SULLA TRASCRIZIONE L’acetilazione degli istoni controlla la fioritura di Arabidopsis thaliana L’immunoprecipitazione della cromatina (ChlP) può essere utilizzata per identificare i siti di legame del DNA di una specifica proteina e le localizzazioni delle proteine istoniche modificate Due versioni: 1) crosslinked ChIP (X ChIP): per fattori di trascrizione 2) ChIP nativa (nChIP): per proteine istoniche modificate C) Metilazione del DNA metilazione a carico delle basi di citosina, per produrre la 5-metilcitosina C 5 della citosina Nei vertebrati e nelle piante il DNA intensamente metilato è associato alla repressione della trascrizione La metilazione del DNA è molto comune nelle basi di citosina adiacenti ai nucleotidi di guanina (CpG, dove p rappresenta il gruppo fosfato nello scheletro del DNA); pertanto, due citosine metilate si pongono in diagonale una di fronte all’altra su filamenti opposti Le regioni del DNA con molte sequenze CpG vengono denominate isole CpG e si trovano di solito vicine ai siti di avvio della trascrizione. Nella fase in cui i geni non vengono trascritti, queste isole CpG spesso vengono metilate, ma i gruppi metile vengono rimossi prima dell’inizio della trascrizione La metilazione del DNA mediata da DNA metil- transferasi Questa modificazione avviene quasi esclusivamente nel contesto del dinucleotide 5’-CpG-3’ Dinamica nella metilazione del DNA ten-eleven translocation Possibili effetti della metilazione a livello di regioni di regolazione Proteine con alta affinità per C metilata riconoscono e legano i gruppi metilici e contribuscono alla repressione della trascrizione: MBD (methyl- CpG-binding protein), UHRF (ubiquitin-like containing PHD and RING finger domain) e proteine zinc finger REGOLAZIONE DELL’INIZIO DELLA TRASCRIZIONE: FATTORI DI TRASCRIZIONE E PROTEINE REGOLATRICI Diverse proteine e sequenze di regolazione influenzano positivamente o negativamente l’inizio della trascrizione Per i livelli normali di trascrizione sono necessarie proteine regolatrici trascrizionali: si legano a un promotore regolatore a monte del core del promotore e agli enhancer; alcune proteine regolatrici trascrizionali sono attivatori e quindi stimolano la trascrizione; altre sono repressori Le proteine attivatrici della trascrizione stimolano e stabilizzano l’apparato di trascrizione basale; possono interagire direttamente con l’apparato di trascrizione basale o indirettamente tramite le proteine coattivatrici Le proteine attivatrici, legandosi alle sequenze nel promotore (o nell’enhancer), entrano in contatto con il mediatore e influenzano la velocità con cui ha inizio la trascrizione. GAL4, un attivatore trascrizionale di lievito che regola la trascrizione di geni del metabolismo del galattosio GAL4 contiene parecchi zinc finger e si lega a sequenze di DNA chiamate UASG (Upstream Activating Sequence for GAL4). Le UASG sono dotate delle proprietà degli enhancer Una regione particolare di GAL4 si lega a GAL80 e, quando il galattosio è assente, impedisce a GAL4 di attivare la trascrizione. Quando il galattosio è mediatore presente la repressione viene rimossa: GAL4 è un attivatore trascrizionale Repressori trascrizionali Si legano a sequenze del promotore oppure a sequenze distanti dette silenziatori, che, come gli enhancer, sono indipendenti per posizione e orientamento. A differenza dei repressori presenti nei batteri, la maggior parte dei repressori eucarioti non blocca direttamente l’RNA polimerasi 1) possono competere con gli attivatori per i siti di legame al DNA 2) possono legarsi a siti vicini a un sito attivatore e impedire a questo di entrare in contatto con l’apparato di trascrizione basale 3) possono interferire direttamente nell’assemblaggio dell’apparato di trascrizione basale, attraverso un blocco dell’inizio della trascrizione Enhancer e isolatori Gli enhancer sono in grado di attivare la trascrizione anche a grandi distanze sul cromosoma. Per esempio, un enhancer che regola il gene che codifica per la catena alfa del recettore delle cellule T è localizzato 69 000 bp a valle del promotore del gene Le proteine regolatrici si legano all’enhancer e provocano ripiegamenti ad anello del cromosoma, fra l’enhancer e il promotore, portando promotore ed enhancer uno vicino all’altro Un enhancer tipico ha una lunghezza di circa 500 bp e contiene 10 siti di legame per le proteine che regolano la trascrizione. Gli effetti degli enhancer sono limitati dagli isolatori che sono delle sequenze di DNA che bloccano o isolano gli effetti degli enhancer in un modo dipendente dalla posizione. Se l’isolatore si trova fra l’enhancer e il promotore, allora blocca l’enhancer ESPRESSIONE GENICA “COORDINATA” NEGLI EUCARIOTI I geni espressi in modo coordinato nelle cellule eucariote sono in grado di rispondere allo stesso stimolo perché possiedono delle sequenze regolatrici (dette sequenze consenso) in comune nei loro promotori o enhancer. NB: Lo stesso elemento di risposta può essere presente in geni differenti rendendo così possibile che molti geni siano attivati dal medesimo stimolo. La trascrizione è regolata da meccanismi combinatori In diversi promotori, i siti di legame dell’attivatore trascrizionale sono ordinati in diverse combinazioni Le sequenze consenso nei promotori di tre geni eucarioti illustrano il principio secondo cui sequenze differenti possono essere mescolate e affiancate in differenti combinazioni. A ogni sequenza consenso si lega una diversa proteina attivatrice della trascrizione, così ogni promotore risponde a una sola combinazione di proteine attivatrici. Un singolo gene eucariote può essere regolato da elementi di risposta differenti Elementi di risposta posti a monte del gene della metallotioneina contribuiscono ad aumentare la velocità della sua trascrizione e a rispondere a stimoli multipli. A monte del gene della metallotioneina si trovano più copie di un elemento di risposta ai metalli (MRE). I metalli pesanti stimolano il legame delle proteine attivatrici agli MRE e così viene aumentata la velocità di trascrizione del gene della metallotioneina. Inoltre, nella regione a monte del gene della metallotioneina sono localizzati due enhancer; uno contiene un elemento di risposta noto col nome di TRE, che stimola la trascrizione in presenza di una proteina attivatrice chiamata AP1. L’elemento di risposta chiamato GRE è localizzato all’incirca 250 nucleotidi a monte del gene della metallotioneina e stimola la trascrizione in risposta a certi ormoni. UN ASPETTO IMPORTANTE DELLA REGOLAZIONE GENICA EUCARIOTE Un singolo gene può essere attivato da molti elementi di risposta che si trovano nei promotori o negli enhancer. Gli elementi di risposta multipli fanno sì che lo stesso gene sia attivato da stimoli diversi. Nel contempo, la presenza dello stesso elemento di risposta in geni diversi fa sì che un singolo stimolo possa attivare la trascrizione in molti geni. In una determinata cellula viene attivato solo l’insieme dei geni che possiede (nel promotore o nell’enhancer) la combinazione di siti di legame che riconosce i fattori presenti nella cellula 1) Stessi elementi di regolazione possono essere presenti anche in cellule molto diverse (Fig 17.1 A, B). 2) Uno stesso fattore trascrizionale può agire da attivatore o da repressore per geni diversi a seconda dei fattori aggiuntivi con cui interagisce in una stessa cellula (Fig 17.1C). Il complesso di fattori trascrizionali che regolano la trascrizione in diversi tipi cellulari può essere definito un programma trascrizionale Ogni tipo di cellula possiede uno specifico programma che regola un insieme di geni tipico di quella cellula. Il programma di certe cellule può evolversi in nuovi programmi (17.2A) I programmi possono evolversi con l’evoluzione della cellula (17.2B) Alcuni fattori trascrizionali definiti pioneer factors riescono a accedere al DNA coperto da istoni (17.2C) I programmi trascrizionali operano sui promotori e sugli enhancer (17.2D) In molti casi si è visto che la regolazione opera anche sulla fase di allungamento del filamento nascente del pre-mRNA da parte della RNA pol II, che può trovarsi in pausa poche decine di nt a valle del Cap. Un segnale di trasduzione chinasica fosforila un coattivatore della trascrizione CBP (CREB binding protein) che legandosi ai fattori SRF e CREB induce il contatto tra enhancer e promotore del gene, che attiva acetilazione istonica e induce la estensione della RNA pol II che era in pausa Formazione di strutture secondarie nel DNA che inducono pausa nell’RNA pol II  MODIFICAZIONI NEI MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE POSSONO CAUSARE MALATTIE/ALTERAZIONI Mutazioni nelle regioni promotore possono, seppur raramente, ridurre la espressione del gene a livelli patologici Alcune delle mutazioni nel promotore del gene β-globina che causano β-talassemia Per avere la perdita completa della espressione è necessaria la perdita di enhancer; un esempio (che ha rara frequenza) è la perdita dell’enhancer di Pax6 (codifica per un fattore di trascrizione importante per la genesi dell’iride); la mutazione più comune è data da traslocazioni in cui il punto di rottura si posiziona tra l’enhancer e il promotore di Pax6 causando aniridia Si è anche osservata mutazione puntiforme in un sito di legame nell’enhancer SIMO che impedisce la regolazione positiva Mutazioni in sequenze regolatorie poste a notevole distanza dal gene target (anche 1 Mb) possono portare a sovra- espressione e a fenotipi patologici ZRS= ZPA regulatory sequence; ZPA= zone of polarizing activity MUTAZIONE DOMINANTE La alterazione di enhancer conduce alla persistenza ereditaria di lattasi E’ frequente (oltre 90% degli individui) nel Nord Europa e in popolazioni africane dedite alla pastorizia (come i Tutsi), è comune in sud Europa e nei popoli arabi dediti alla pastorizia e rara (1-20%) nei cinesi e asiatici e africani non dediti alla pastorizia. Le mutazioni sono state selezionate rapidamente in poche migliaia di anni e sono qdi collegate alla domesticazione degli animali e al consumo del latte. LO SPLICING ALTERNATIVO NEL CONTROLLO DELLA ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI Splicing alternativo Un esempio di splicing alternativo tessuto-specifico: il gene per la calcitonina umana (CT/CGRP) Si verifica exon skipping a carico dell’esone 4 in cui è presente un sito di poliadenilazione che può portare alla produzione di una forma tronca di mRNA. Il gene è espresso solo in 2 tessuti: in un particolare gruppo di neuroni e a livello della tiroide Nell’ipofisi il meccanismo di exon skipping porta a esprimere la forma più lunga del mRNA, mentre nella tiroide il trascritto si interrompe dopo l’esone 4. calcitonin-related gene protein DIFETTI NELLO SPLICING POSSONO CAUSARE MALATTIE GENETICHE, alcuni esempi circa il 15% delle sostituzioni di singola base individuate nelle malattie genetiche umane derivano da alterazioni nello splicing del pre-mRNA Fenomeni di splicing aberrante nel trascritto della β-globina producono alterazioni nel trascritto che conducono a β -talassemia SMN1 e SMN2 (Survival Motor Neuron) sono geni duplicati. SMN2 differisce da SMN1 per una mutazione che causa un difetto di splicing. La mutazione genera in SMN2 un ESS che sopprime in parte il sito accettore dell’esone 7 e solo il 20% degli mRNA di SMN2 va incontro a splicing funzionale Esistono individui in cui SMN1 è mutato e la proteina SMN viene prodotta solo dal meno efficiente gene SMN2 causando la grave malattia atrofia muscolare spinale (SMA) Distrofia miotonica (DM1, DM2), malattie autosomiche dominanti causate dalla espansione di sequenze CTG o CCTG nel gene della miotonina (DMPK), ripetute centinaia di volte negli individui malati DMPK (myotonic dystrophy protein kinase) MBNL1=musclebind CUGBP1= CUG-binding protein 1 troponina cardiaca 2 recettore dell’insulina canale del cloro Lo splicing alternativo di CICN1 sembra sufficiente a causare il sintomo tipico della distrofia miotonica e della miotonia (scariche elettriche sinaptiche prolungate) Mutazioni che causano difetti nello splicing possono causare fibrosi cistica (CF), malattia genetica autosomica recessiva Più di 2000 alterazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) causano CF: - Alterazioni nella sequenza codificante (la maggior parte) - Alterazioni in zone introniche e splicing aberrante (circa il 13%) ISE MODIFICAZIONI AL 3’ UTR E STABILITA’ DEL mRNA SONO ALTRI ELEMENTI DI CONTROLLO DELLA ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI Modificazioni post- trascrizionali al 3’ UTR Legato da CPSF (cleavage and polyadenilation specificity factor) Alcuni pre-mRNA Legato da CstF: cleavage possiedono anche un sito USE (upstream sequence stimulation factor, lega element) che rafforza il GU, poi CFI e CFII riconoscimento del sito di (cleavage factors), fanno il taglio taglio su CA Il taglio del pre-mRNA e poliadenilazione si verificano su una A in un dinucleotide CA posto a 10-30 nt a valle del PAS e in posizione intermedia tra sito PAS e sito DSE (downstream sequence element) PAS addizionali in 5’ o in 3’ di quello principale Se PAS alternativo è posto all’interno della regione codificante, genera un mRNA con regione codificante variata. Questo processo genera inoltre mRNA con 3’ UTR di varia lunghezza Il 5’UTR e 3’UTR sono ricchi di siti di legame per proteine nucleari e/o citoplasmatiche capaci di regolare positivamente o negativamente stabilità e/o traduzione del mRNA Esistono centinaia di RBP, alcune a distribuzione ubiquitaria (es ELAV-HuR) , altre tessuto specifiche (es ELAV-HuB, C, D). Gruppi di mRNA possono essere regolati coordinatamente dalla attività di una determinata RBP e un singolo mRNA può rispondere a diversi RBP Tra le sequenze consenso più importanti esistono ARE, GRE (ricche in GU), CURE (ricche in CU)  REGOLAZIONE TRAMITE REPRESSIONE DELLA TRADUZIONE E TRASPORTO DEGLI mRNA Molti mRNA assumono specifiche localizzazioni intracellulari nel corso dello sviluppo, del differenziamento o dell’attività funzionale e vengono tradotti in tali sedi locali La possibilità di trasportare un mRNA richiede che esso non venga tradotto dopo la sua sintesi; meccanismi specifici reprimono la traduzione di alcuni specifici mRNA L’inibizione della traduzione è dovuta al legame di proteine che legandosi eIF4E o a siti specifici sul 3’ UTR creano mRNA circolarizzati inattivi I meccanismi di localizzazione sono importanti in cellule in cui la proteina localizzata deve svolgere la sua funzione in siti molto distanti dal nucleo in cui il suo mRNA è stato sintetizzato L’ mRNA può essere trasportato in forma inattiva protetto dalla degradazione per attivarsi nella sede di destinazione e essere di nuovo represso al cessare dello stimolo. Esistono sul mRNA delle sequenze di localizzazione che interagiscono con proteine specifiche coinvolte nel trasporto intracellulare del mRNA alla sede definitiva. Nel citoplasma alcuni specifici mRNA formano oligomeri in seguito a interazioni con RBP; complessi RBP/mRNA sono riuniti in aggregati di mRNA detti granuli di RNA Oltre a sistemi di controllo trascrizionale e post- trascrizionale, esistono livelli di controllo post- traduzionale. Molte proteine vanno infatti incontro a modificazioni post-traduzionali che aggiungono molecole semplici (fosforilazione, acetilazione, metilazione, sumoilazione) o complesse (ubiquitinazione, palmitoilazione). Queste modificazioni si verificano su AA specifici e hanno importanti conseguenze funzionali agendo a livello di struttura, localizzazione intracellulare, proprietà enzimatiche e funzionali, stabilità della proteina ecc REGOLAZIONE GLOBALE: un esempio della risposta delle cellule delle piante a infezione da patogeni Regolazione della espressione genica mediata da RNA interference RISC: RNA-induced silencing complex È una risposta di regolazione della espressione genica mediata da RNA a doppio filamento che conduce a silenziamento post- trascrizionale (degradazione mRNA o silenziamento della traduzione) o trascrizionale (mediante compattazione della cromatina) Differenze tra siRNA e miRNA: 1) I miRNA derivano sempre dalla maturazione di molecole di RNA che rappresentano la trascrizione di geni endogeni; Drosha 2) Il meccanismo usato dai dicer e dicer miRNA per silenziare geni bersaglio si basa spesso sulla inibizione della traduzione di un RNA bersaglio (anche se sono stati descritti numerosi esempi in cui miRNA causa la degradazione di un RNA bersaglio, come per i siRNA); 3) Nella maggior parte dei casi il meccanismo di inibizione dei miRNA sulla traduzione è mediato dall’interazione con una o più sequenze complementari a livello del 3’UTR del mRNA bersaglio. ASPETTI REGOLATIVI DEI miRNA Aspetti regolativi : 1) Le sequenze che danno origine a un miRNA possono far parte delle sequenze del pre-mRNA di un gene normale; 2) Per molti miRNA sono presenti promotori specifici 3) Le sequenze dei miRNA possono essere in cluster seed, di solito le basi 2-7 al 5’ del miRNA: regolati da un singolo promotore questa sequenza guida la proteina AGO sul 4) La sequenza seed può essere molto frequente nel bersaglio su mRNA genoma, qdi ogni miRNA ha la possibilità di riconoscere mRNA multipli 5) Gli mRNA a loro volta contengono (spesso nel 3’UTR) sequenze di interazione per diversi seed. Effetti delle mutazioni per miRNA: Il knock-out di Dicer in cellule ES provoca cellule che proliferano più lentamente, ma per il resto non hanno caratteristiche anomale, ma mostrano gravi difetti quando indotte al differenziamento, indicando che Dicer è indispensabile per il normale sviluppo embrionale. Sovraespressione o silenziamento di miRNA mostrano importanti anomalie nel differenziamento neuronale, cardiaco e di molti altri tipi di cellule, nel ciclo mitotico e nella proliferazione. Comunque, misurazioni del livello di proteine e mRNA dopo induzione di cambiamenti quantitativi di un miRNA mostrano che le variazioni quantitative sono modeste (tra log2 - 0,5 e log2 +0,5); quindi i miRNA modulano ma non sopprimono la traduzione e la stabilità del loro mRNA bersaglio. Possibili spiegazioni su come mai la loro alterazione provoca effetti fenotipici rilevanti: 1) I modesti cambiamenti nella espressione di centinaia di mRNA sommandosi uno con l’altro alterino le funzioni cellulari che richiedono la cooperazione di molti geni con funzioni correlate; 2) Alcuni degli mRNA più fortemente inibiti sono particolarmente critici per uno specifico processo cellulare IMPLICAZIONI DI RELAZIONI STRUTTURALI E FUNZIONALI DI REGIONI REGOLATIVE POSIZIONATE A DISTANZA SUL CROMOSOMA Il cromosoma si ripiega con modalità preferenziale formando dei domini stabili definiti TAD (topological associated domains) All’interno del TAD si osservano ripiegamenti tipici di ciascun tipo di cellula che creano contatti tra regioni distanti di DNA che si ritiene rappresentino interazioni tra promotori e enhancer Si ipotizza che questi contatti rappresentino una Delezioni, inversioni e comune localizzazione di duplicazioni che alterano un boundary geni co-espressi all’interno delle cosidette transcription factories in cui si accumulano fattori trascrizionali, di splicing ecc Mutazioni in enhancer all’interno di un TAD possono modificare il fenotipo Un polimorfismo associato significativamente al colore biondo dei capelli impedisce il legame del fattore trascrizionale LEF a un enhancer riducendone l’attività. L’enhancer è connesso, a circa 350 kb, al gene che codifica stem cell factor (SSCF), un fattore di crescita che stimola i melanociti; la ridotta attività di questo enhancer mutato riduce l’attività nei follicoli piliferi determinando il fenotipo biondo La sostituzione di una A (variante ancestrale) con una G (variante derivata) determina colore biondo