Guía de Prácticas de Laboratorio Aminoácidos y Proteínas-Punto Isoeléctrico PDF

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CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 1 DE 7 FACULTAD: FACULTAD MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA DEPARTAMENTO: CIENCIAS PECUARIAS PROGRAMA: MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA NOMBRE DEL CURSO: BIOQUIMICA MVZ NOMBRE DE LA PRÁCTICA: AMINOACIDOS Y PROTEINAS-PUNTO ISOELÉCTRICO 1. OBJETIVOS Identificar aminoácidos mediante pruebas cualitativas para comprender la importancia de éstos como moléculas de importancia biológica. Estudiar el efecto de factores físicos y químicos sobre una proteína mediante la extracción y posterior determinación del punto isoeléctrico para inferir las condiciones de operación fisiológicas adecuadas. 2. INTRODUCCIÓN Las células vivas producen macromoléculas que son biopolímeros constituidos por unidades monoméricas o bases estructurales. Para las proteínas, estas unidades son los L – α – aminoácidos. Las propiedades biológicas de estas macromoléculas están determinadas en gran parte por las clases de aminoácidos presentes, el orden en el que están dispuestos en una cadena de polipéptidos y por lo tanto la relación espacial de un aminoácido con otro. Los aminoácidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo. En un α – aminoácido, ambos están unidos al mismo átomo (α) de carbono. De los aminoácidos presentes en la naturaleza, sólo 20 de ellos aparecen en las proteínas de todas las formas de vida, vegetal, animal o microbiana. Los aminoácidos intervienen en la transmisión de impulsos en el sistema nervioso (Glicina y acido glutámico). Los aminoácidos esenciales deben ser suministrados en la alimentación, ya que nuestros cuerpos no pueden sintetizarlos en cantidades adecuadas para respaldar el crecimiento (niños) o para conservar la salud (adultos). PRUEBAS CUALITATIVAS PARA AMINOÁCIDOS Reacción de la Ninhidrina: Es un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los α aminoácidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color púrpura. Esta reacción se efectúa también con los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, pero en este caso se obtiene un color amarillo en vez de púrpura Reacción Xantoproteica: Los aminoácidos que contienen un núcleo aromático forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color rojo naranja. [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente  CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 2 DE 7 Reacción de Millón: Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con reactivo de millón formando compuestos rojos. Los únicos aminoácidos fenólicos son la Tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reacción positiva. El reactivo original de Millón es una solución de nitrato mercúrico en ácido nítrico 50% v/v. Reacción de Sakaguchi: El único aminoácido que contiene grupos guanidinos es la Arginina; esta reacciona con α naftol y un agente oxidante tal como agua de bromo o hipoclorito en un medio alcalino, dando un color rojo. PUNTO ISOELECTRICO Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. CASEINA La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantotéico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente  CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 3 DE 7 intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que el alfa y la beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio. La kappa caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente el alfa y la beta caseína insoluble, lo que da lugar a la formación de la micela. La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita. La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente  CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 4 DE 7 sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico. La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles de desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alphalactalbumina, bovine serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig). 3. PROCEDIMIENTO Aislamiento de la caseína: - Caliente en un vaso de precipitado 150ml de agua destilada a 38ºC, añada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta). - Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal. - Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro. - Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro. - Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico. - Filtre nuevamente. - Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil manipulación que es la caseína. Preparación de la solución de caseína: Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50ml. - Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta lograr una solución total de la caseína. - Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 ml, adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien. - La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar. Determinación del pI de la caseína: En diez vasos de 25 ml limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos según la siguiente tabla: [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente  CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 5 DE 7 Acetato Acético 0,01 pH resultante Volumen TUBO Acético 0,1N 0,1N N (aprox,) total ml 1 0,5 9,5 0 3,2 10 2 1 9 0 3,6 10 3 1,5 8,5 0 3,8 10 4 2 8 0 4 10 5 3 7 0 4,2 10 6 4 6 0 4,5 10 7 6 4 0 4,7 10 8 8 2 0 5,1 10 9 6 0 4 5,5 10 10 8 0 2 6,1 10 Medir experimentalmente el pH de todos los vasos, que debe cubrir un rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente. - Añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo. - Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos. - Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada tubo para obtener una solución / suspensión homogénea antes de verter una parte en la cubeta. - Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI aproximado de la caseína. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS. 1 Estufa 1 Beaker de 500 mL Soluciones al 0.5% de aminoácidos: Glicina, Tirosina, Triptófano, Fenilalanina, Arginina. Ninhidrina: Disolución al 0.2% en alcohol o acetona. (EVALUAR SUSTITUCION) HNO3 al 10% NaOH al 20% o amoniaco. Fenol, disolución al 0.1% Reactivo de Millón. (EVALUAR SUSTITUCION) Agua de Cloro α- Naftol: 0.2% Nitrito de sodio. Ácido sulfúrico. Papel de filtro Termómetro [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente  CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 6 DE 7 Acetato sódico 0,1 N Ácido acético 0,01 N Ácido acético 0,1 N Ácido acético 1,0 N NaOH 1N Éter etílico Etanol al 70% Materiales y reactivos de uso general: Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro Potenciómetro (pH-metro) Espectrofotómetro con celdas. Leche entera corriente 4. EQUIPOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y/O COLECTIVA. Bata de laboratorio, Guantes de nitrilo. 5. MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS. Residuos se depositan en los bidones de sustancias acidas y Básicas. 6. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.. a) Identifique los grupos químicos que caracterizan a los aminoácidos utilizados en la práctica. Dibujar la estructura de los aminoácidos empleados en la práctica. Da un ejemplo (usando fórmulas químicas) de la reacción que se lleva a cabo entre uno de los aminoácidos (cualquiera) que usaste y los reactivos que usaste para identificarlos (Prueba de Millón, Reacción de la ninhidrina, etc.). b) Representar A640 frente al pH de cada tubo en el apartado 3. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia? ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI? 7. BIBLIOGRAFÍA McMurry, J. Química Orgánica. Quinta edición, Thomson editores, México, 2001 Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México 8. RECOMENDACIONES Leer las fichar de seguridad de los reactivos antes de realizar la práctica 9. ANEXOS [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente  CÓDIGO: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FDOC-090 VERSIÓN: 01 EMISIÓN: 02/03/2020 GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO PÁGINA 7 DE 7 2 litros acetato sódico 0,1 N (16 g acetato en 2 L agua destilada) 2 litros ácido acético 0,1 N (12 g acético glacial en 2 L agua destilada) 400 mL ácido acético 0,01 N (0,24 g acético glacial en 400 mL agua destilada) 500 mL ácido acético 1 N (30 g acético glacial en 500 mL agua destilada) 300 mL NaOH 1 N (12 g NaOH en 300 mL agua destilada) [email protected] Si usted ha accedido a este formato a través de un medio diferente al sitio web del Sistema de Control Documental del SIGEC asegúrese que ésta es la versión vigente