Εργαστηριακή άσκηση 2_Εργαστηριακός οδηγός 2024-2025 PDF

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Σ Χ Ο ΛΗ Ε Π Ι Σ ΤΗΜ Ω Ν ΥΓ ΕΙ ΑΣ Τ Μ Η Μ Α Ι ΑΤΡ Ι Κ Η Σ Ε Ρ Γ ΑΣ ΤΗ Ρ Ι Ο ΒΙ Ο Λ Ο Γ Ι ΑΣ Πανεπιστημίου 3 (Βιόπολις), 41500 Λάρισα Τηλ. 2410685624-5570 Fax. 2410685549 www.med.uth.gr [email protected]...

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ Σ Χ Ο ΛΗ Ε Π Ι Σ ΤΗΜ Ω Ν ΥΓ ΕΙ ΑΣ Τ Μ Η Μ Α Ι ΑΤΡ Ι Κ Η Σ Ε Ρ Γ ΑΣ ΤΗ Ρ Ι Ο ΒΙ Ο Λ Ο Γ Ι ΑΣ Πανεπιστημίου 3 (Βιόπολις), 41500 Λάρισα Τηλ. 2410685624-5570 Fax. 2410685549 www.med.uth.gr [email protected] Εργαστηριακός οδηγός «ΒΙΟΛΟΓΙΑ Ι» 2024-2025 Εργαστηριακή Άσκηση 2 Βαρβάρα Τραχανά Αν. Καθηγήτρια Ιατρικής Βιολογίας-Κυτταρικής Βιολογίας Υπεύθυνη μαθήματος Βιολογία Ι Ιωάννα Παπαθανασίου Επίκουρη Καθηγήτρια Ιατρικής Βιολογίας  Άσκηση 2η ΟΜΑΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ Σύστημα ΑΒΟ_Σύστημα Rhezous-Προσδιορισμός ομάδας αίματος Θεωρητικό μέρος Σύστημα ΑΒΟ Μέχρι και τις αρχές του 20ου αιώνα οι μεταγγίσεις αίματος μεταξύ δύο ατόμων (δότη-δέκτη) γίνονταν με τυχαίο τρόπο και είχαν πολύ περιορισμένη πιθανότητα επιτυχίας. Οι περισσότερες περιπτώσεις κατέληγαν σε συγκόλληση των ερυθρών αιμοσφαιρίων του δότη από τον ορό του δέκτη με φυσική κατάληξη το θάνατο του μεταγγιζόμενου ατόμου. Το 1908 ο Karl Landsteiner παρατήρησε ότι η ανάμειξη ερυθρών αιμοσφαιρίων ενός ατόμου με ορό άλλου ατόμου in vitro μπορούσε να καταλήξει σε συγκόλληση των κυττάρων ενώ η ανάμειξη ερυθρών με τον ορό του ίδιου ατόμου δεν κατέληγε ποτέ σε συγκόλληση. Ο όρος συγκόλληση αναφέρεται στη δημιουργία συσσωματωμάτων ερυθρών αιμοσφαιρίων από την αντίδραση των αντισωμάτων του ορού ή του πλάσματος ενός ατόμου με τα αντιγόνα επιφανείας των ερυθρών αιμοσφαιρίων άλλου ατόμου. Η ερμηνεία των ευρημάτων αυτών έγινε με βάση την υπόθεση παρουσίας ή απουσίας ειδικών αντιγόνων στην κυτταρική μεμβράνη των ερυθροκυττάρων και την αντίστοιχη απουσία ή παρουσία συγκολλητινών (αντισωμάτων) στον ορό του ατόμου. Τριάντα τουλάχιστον συνήθη αντιγόνα και εκατοντάδες άλλα σπάνια αντιγόνα, που το καθένα τους μπορεί να προκαλέσει αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος, έχουν ανιχνευθεί στα ερυθρά αιμοσφαίρια του ανθρώπου και ιδιαίτερα στην κυτταρική τους μεμβράνη. Με βάση τα αντιγόνα που φέρουν τα ερυθρά στην επιφάνειά τους διαχωρίστηκαν οι διάφορες ομάδες αίματος. Η κύρια δομή των αντιγόνων των ερυθροκυττάρων είναι είτε μια πρωτεΐνη, ένα γλυκολιπίδιο, μια γλυκοπρωτεΐνη ή και ένας ολιγοσακχαρίτης. To σύστημα ΑΒΟ προκύπτει από την παρουσία αντιγόνων Α, Β ή κανενός εκ των δύο αυτών στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων ενός ατόμου. Εκφράζονται κύρια 2 στα ερυθροκύτταρα από την 37η ημέρα της εμβρυϊκής ζωής. Στο νεογνό η ποσοτική τους έκφραση ανέρχεται στο 25-50% αυτής των ενηλίκων (και αυξάνει προοδευτικά μέχρι τον 3ο χρόνο ζωής. Εκφράζονται επίσης σε λευκά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια, επιδερμικά κύτταρα και σε άλλους ιστούς. Στο σύστημα ΑΒΟ τα αντιγόνα προκύπτουν από μια «πρόδρομη» αλληλουχία ολιγοσακχαρίτη και ένα ή περισσότερα ειδικά σάκχαρα προσαρτημένα σε αυτό σε συγκεκριμένες θέσεις. Τα άτομα που φέρουν στα ερυθροκύτταρά τους αντιγόνα Α είναι ομάδα αίματος Α και τα άτομα που φέρουν στα ερυθροκύτταρά τους αντιγόνα Β είναι ομάδα αίματος Β. Έχουν επίσης βρεθεί άτομα που φέρουν στα ερυθροκύτταρά τους και Α και Β αντιγόνα και ανήκουν στην ομάδα ΑΒ ενώ άτομα που δεν φέρουν κανένα αντιγόνο ανήκουν στην ομάδα αίματος Ο. Έτσι προέκυψε το αντιγονικό σύστημα των ομάδων αίματος ΑΒΟ. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του συστήματος ΑΒΟ, που δεν παρατηρείται σε άλλο αντιγονικό σύστημα, είναι η αντίστροφη σχέση ανάμεσα στα αντιγόνα των ερυθροκυττάρων και στα αντισώματα (συγκολλητίνες) που βρίσκονται στον ορό του ατόμου. Όταν τα ερυθροκύτταρα δεν φέρουν αντιγόνο Α, ο ορός περιέχει αντίσωμα αντι-Α, ενώ όταν τα ερυθροκύτταρα δεν φέρουν αντιγόνο Β ο ορός περιέχει αντι-Β (πίνακας 1). Πίνακας 1: Σύστημα ΑΒΟ Ομάδα αίματος Αντιγόνο στα ερυθρά Αντίσωμα στον ορό Ο - Αντι-Α και Αντι-Β Α Α Αντι-Β Β Β Αντι-Α ΑΒ Α και Β - Η βάση των ΑΒΟ αντιγόνων είναι το αντιγόνο Η, ένας ολιγοσακχαρίτης, που είναι και το μόνο που απαντά στην ομάδα Ο. Ο ολιγοσακχαρίτης αυτός έχει ως τελικό σάκχαρο τη φουκόζη, για την τοποθέτηση της οποίας υπεύθυνο είναι το ένζυμο φουκο- τρανσφεράση. Την τρανσφεράση αυτή κωδικοποιεί το γονίδιο FUT1 (χρωμόσωμα 19q13.3). Το γονίδιο αυτό απαντά σε 2 αλλήλια: το Η (επικρατές, συχνότητα 99,9%) και το h (υπολειπόμενο, συχνότητα 0,1%). Στο Η αντιγόνο προστίθενται άλλα σάκχαρα μέσω της δράσης άλλων τρανσφερασών για το σχηματισμό των Α και Β αντιγόνων 3 (εικόνα 1). Τα γονίδια που κωδικοποιούν αυτά τα ένζυμα εδράζουν στο χρωμόσωμα 9 (9q34.1-2). Αντιγόνο Η (ομάδα Ο) Φουκόζη Ν ακετυλ – Αντιγόνο Α γαλακτοζαμίνη Αντιγόνο Β Γαλακτόζη Ν ακετυλ - γλυκοζαμίνη Εικόνα 1: Αντιγόνα της ομάδας ΑΒΟ Ελάχιστα άτομα ομόζυγα για το υπολειπόμενο h αλληλόμορφο έχουν καταγραφεί. Τα άτομα αυτά -φαινότυπος Bombay- δεν έχουν την φουκοτρασφεράση και δεν εκφράζουν το αντιγόνο Η και συνεπώς κανένα άλλο αντιγόνο (Α ή Β) στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων τους. Το σύστημα ΑΒΟ έχει τεράστια σημασία στις μεταγγίσεις. Στο σύστημα αυτό υπάρχουν συμβατοί και ασύμβατοι συνδυασμοί. Εάν γίνει μετάγγιση αίματος από άτομο ομάδας Α σε άτομο ομάδας Β, τα αντισώματα του ορού του δέκτη αντιδρούν με τα αντιγόνα των ερυθροκυττάρων του δότη και τους προκαλούν συγκόλληση. Τα συγκολλημένα ερυθρά αιμοσφαίρια παρεμποδίζουν την κυκλοφορία του αίματος μέσα στα αγγεία και είναι δυνατόν να προκληθεί θάνατος του δέκτη. Το αντιγόνο περισσότερο παρά το αντίσωμα του δότη προκαλεί σίγουρη βλάβη όταν μεταγγίζεται σε ασύμβατο άτομο, αφού ο όγκος των κυττάρων του αίματος που συγκολλώνται είναι εκείνος του δότη. Αίμα ομάδος Ο μπορεί να δοθεί σε άτομα οποιασδήποτε ομάδας, γιατί τα ερυθροκύτταρά τους δεν περιέχουν κανένα αντιγόνο και επομένως είναι συμβατό με το πλάσμα κάθε ανθρώπου. Για το λόγο αυτό η ομάδα Ο χαρακτηρίζεται 4 ως πανδότης. Άτομα ομάδας Ο μπορούν να δεχθούν αίμα μόνο από άτομα Ο ομάδας γιατί το πλάσμα τους περιέχει και τα δυο αντισώματα αντι-Α και αντι-Β και επομένως είναι ασύμβατο με τα ερυθροκύτταρα των υπολοίπων ομάδων που έχουν αντιγόνα. Αντίθετα, άτομα ομάδας ΑΒ, των οποίων το πλάσμα δεν περιέχει κανένα αντίσωμα, είναι πανδέκτης, δηλαδή μπορούν να πάρουν αίμα από όλες τις ομάδες Ο, Α, Β, ΑΒ αλλά δίνουν μόνο στην ομάδα ΑΒ (εικόνα 1 και 2). Ο Α Β ΑΒ Εικόνα 1. Επιτρεπτές μεταγγίσεις μεταξύ διαφορετικών ομάδων αίματος. Εικόνα 2: Συμβατότητα των ομάδων ΑΒΟ Πιστεύεται ότι η παρουσία των αντισωμάτων αντι-Α ή αντι-Β (αναλόγως των αντιγόνων που εκφράζονται στα ερυθρά αιμοσφαίρια) στον ορό των ατόμων είναι αποτέλεσμα προηγούμενης επαφής με το αντιγόνο (αντιγόνο Α ή Β). Η πλέον πιθανή πηγή για αυτές τις αντιγονικές διεγέρσεις είναι τα βακτήρια του εντέρου και τα προϊόντα αυτών, τα οποία φέρουν αντιγονικά χαρακτηριστικά ίδια ή παρόμοια με αυτά των αντιγόνων των ομάδων αίματος. Τα βακτήρια αυτά αποτελούν είτε μέρος της φυσικής χλωρίδας του γαστρεντερικού συστήματος είτε λαμβάνονται με την τροφή. 5 Σύστημα Rhesus Το σύστημα ΑΒΟ βοήθησε σημαντικά στην επιτυχή μετάγγιση αίματος με την αντιμετώπιση των προβλημάτων συγκόλλησης, χωρίς όμως να επιλύσει πλήρως το πρόβλημα. Η συνεχιζόμενη εμφάνιση ετεροαντιδράσεων αιμόλυσης εδραίωσε την άποψη ότι εκτός του συστήματος ΑΒΟ και άλλα αντιγονικά συστήματα καθορίζουν τη συμβατότητα του ζεύγους δότη-δέκτη. Oι Ρ. Levine και R. Ε. Stetson το 1939 εντόπισαν αντίσωμα (αντί-Rhesus) στον ορό γυναίκας που γέννησε νεκρό έμβρυο, το οποίο συγκολλούσε σε ποσοστό περίπου 80% τα ερυθρά αιμοσφαίρια ατόμων με συμβατή ομάδα ΑΒΟ. Ακολούθως το 1940, οι Karl Landsteiner και Wiener μετά από μελέτες με κύτταρα του πιθήκου Rhesus (Maccaca mulata) χαρακτήρισαν ως Rhesus θετικά (Rh+) τα άτομα που έφεραν στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοσφαιρίων τους το αντιγόνο Rhesus,º και ως Rh αρνητικά (Rh-) τα άτομα που δεν το έφεραν. Για την ακρίβεια τα Rhesus αντιγόνα είναι πάνω από 50 διαφορετικά αντιγόνα με σημαντικότερα τα D, C,c, E,e τα οποία αποτελούν επιτόπους 2 διαφορετικών πρωτεΐνών RhD, RhCE (Rh-πρωτεΐνες). Οι πρωτεΐνες αυτές είναι διαμεμβρανικές αυτέςκαι κωδικοποιούνται από δύο ομόλογους τόπους (RhD, RhCE) στο χρωμόσωμα 1. Η πρωτεΐνη RhD να είναι η πιο ισχυρά ανοσογόνα (D Rhesus θετικά άτομα, d Rhesus αρνητικά άτομα). Οι Rh-πρωτεΐνες εκφράζονται στην ερυθροκυτταρική επιφάνεια μόνο όταν συνυπάρχουν με την Rh-σχετιζόμενη γλυκοπρωτεΐνη (Rh- associated glycoprotein, RhAG). Το γονίδιο που κωδικοποιεί την RhAG εδράζεται στο χρωμόσωμα 6. Οι πρωτεΐνες Rh και RhAG αποτελούν την οικογένεια των πρωτεϊνών Rhesus. Η βασική διαφορά μεταξύ του συστήματος ΑΒΟ και του συστήματος Rh είναι η ακόλουθη: στο σύστημα ABO, τα αντισώματα εναντίον των αντιγόνων Α ή Β υπάρχουν στον ορό ατόμων που δεν φέρουν τα αντίστοιχα αντιγόνα στα ερυθροκύτταρά τους (π.χ. ομάδα αίματος Α: αντιγόνα Α-αντισώματα αντι-Β). Αντίθετα στο σύστημα Rh σχεδόν ποτέ δεν προϋπάρχουν τα αντι-Rhesus αντισώματα στον ορό ενός ατόμου. Το άτομο θα πρέπει να υποβληθεί σε μαζική έκθεση στο αντιγόνο Rh, συνήθως με μετάγγιση αίματος για να αναπτύξει αρκετές συγκολλητίνες (αντι-Rhesus) και προκληθεί αντίδραση μετάγγισης. Όταν ερυθρά αιμοσφαίρια με τον παράγοντα Rh είτε ακόμα και προϊόντα διάσπασης πρωτεϊνών από αυτά τα κύτταρα, ενίονται σε 6 άτομο αρνητικό κατά Rh, αναπτύσσονται βαθμιαία συγκολλητίνες αντι-Rh με το μέγιστο της συγκέντρωσης 2-4 μήνες μετά την ένεση του αντιγόνου. Η αιμολυτική νόσος του εμβρύου (ερυθροβλάστωση) και η βαρύτερη της μορφή, ο εμβρυϊκός ύδρωπας, προκαλείται από μητρικά αντισώματα κατά την ευαισθητοποίηση της Rhesus αρνητικής (Rh-) μητέρας στον παράγοντα ρέζους (Rh+). Το ανοσοποιητικό σύστημα της μητέρας αναγνωρίζει τον παράγοντα ρέζους στα ερυθρά αιμοσφαίρια του εμβρύου ως «ξένο σώμα», και παράγει αντισώματα για την εξόντωση τους. Η λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων του εμβρύου προκαλεί σοβαρή αναιμία που μπορεί να οδηγήσει σε ύδρωπα και θάνατο του εμβρύου. Για να συμβεί η εμβρυική ερυθροβλάστωση, θα πρέπει η μητέρα να είναι Rh αρνητική, ο πατέρας να είναι θετικός και το κύημα έχει κληρονομήσει το Rh + χαρακτηριστικό από τον πατέρα του. Η μητέρα έχει αναπτύξει τις συγκολλητίνες αντι-Rh οι οποίες περνούν με διάχυση από τον πλακούντα προς το έμβρυο, με αποτέλεσμα να προκαλέσουν τη συγκόλληση των ερυθρών του αιμοσφαιρίων. Μια μητέρα Rh- μπορεί να αναπτύξει συγκολλητίνες αντι-Rh ή μετά από κυοφορία ενός Rh+ εμβρύου ή μετά από λανθασμένη μετάγγιση με Rh+ αίμα. Συχνότητα αιμολυτικής νόσου. Σε αρνητική κατά Rh μητέρα, που έχει κάνει το πρώτο της Rh+ παιδί, συνήθως δεν αναπτύσσονται αρκετές συγγκολλητίνες για να προκαλέσουν οποιαδήποτε βλάβη. Εν τούτοις, σε ποσoστό 3% περίπου, τα δεύτερα Rh+ παιδιά εμφανίζουν ορισμένα σημεία ερυθροβλάστωσης του εμβρύου και το ποσοστό αυτό γίνεται 10% σε παιδιά της τρίτης κύησης και αυξάνεται περισσότερο σε μεταγενέστερες κυήσεις. Η γενετική θέση Rh βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1. Μέχρι τώρα δεν έχει διευκρινιστεί αν το σύστημα αυτό αποτελείται από μία ομάδα στενά συνδεδεμένων γονιδίων, το καθένα από τα οποία μπορεί να εμφανίζει μία σειρά αλληλομόρφων ή αποτελείται από μία γενετική θέση με πολλαπλά αλληλόμορφα, που καθορίζουν την αμινοξική αλληλουχία ενός συστατικού της κυτταρικής μεμβράνης των ερυθροκυττάρων. Κάθε αλληλόμορφο καθορίζει μία πολυπεπτιδική αλυσίδα με πολλαπλές αντιγονικές θέσεις, οι οποίες εμφανίζουν ποικιλότητα, δηλαδή αμινοξικές διαφορές, σε περισσότερες από μία θέσεις της αλυσίδας. Υπάρχουν έξι κοινοί τύποι αντιγόνων Rh, που το καθένα ονομάζεται παράγων Rh. Οι παράγοντες αυτοί είναι οι C, D, E, c, d και e. Το αντιγόνο D εμφανίζεται πολύ συχνά στον πληθυσμό και έχει σημαντικά ισχυρότερη αντιγονικότητα, σε σύγκριση με τα άλλα αντιγόνα του συστήματος Rh. 7  Πίνακας 1 : Σύστημα Rhesus Εικόνα 1 : Ευαισθητοποίηση στον παράγοντα Rh (κύηση ή μετάγγιση). 8 Εργαστηριακό μέρος Υλικά Γενική αίματος Ειδικές πλαστικές οπές Οδοντογλυφίδες Αντιδραστήριο αντί-A Αντιδραστήριο αντί-B Αντιδραστήριο αντί-D Τρόπος εργασίας 1. Προσθέτουμε μία σταγόνα αίμα σε 3 διαφορετικές οπές. 2. Προσθέτουμε μια σταγόνα αντιδραστηρίου αντι-Α, μια σταγόνα αντιδραστηρίου αντι-Β και μία σταγόνα αντιδραστηρίου αντι-D στις αντίστοιχες οπές. 3. Χρησιμοποιώντας διαφορετικές οδοντογλυφίδες αναμειγνύουμε με κυκλικές κινήσεις την σταγόνα του αίματος με το αντιδραστήριο. 4. Παρατηρούμε την ανάπτυξη συγκόλησης. 4. Καταγράφουμε ποια είναι η ομάδα αίματος (ΑΒΟ) και ρέζους του δείγματός μας. 9