ENZIMAS: Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6ª Edição (PDF)

6 Enzimas 6.1 Introdução às enzimas 189 talisam cada uma das reações das centenas de etapas que degradam as moléculas dos nutrientes, que conservam e 6.2 Como as enzimas funcionam 191...

6 Enzimas 6.1 Introdução às enzimas 189 talisam cada uma das reações das centenas de etapas que degradam as moléculas dos nutrientes, que conservam e 6.2 Como as enzimas funcionam 191 transformam energia química e que constroem as macro- 6.3 A cinética enzimática como abordagem à compreensão do moléculas biológicas a partir de precursores elementares. mecanismo 200 O estudo das enzimas tem imensa importância prática. Em algumas doenças, especialmente nas doenças genéticas 6.4 Exemplos de reações enzimáticas 214 hereditárias, pode haver uma deficiência ou mesmo ausên- 6.5 Enzimas regulatórias 226 cia total de uma ou mais enzimas. Outras doenças podem ser causadas pela atividade excessiva de determinada en- zima. A determinação das atividades de enzimas no plas- S ão duas as condições fundamentais para haver vida. ma sanguíneo, nas hemácias ou em amostras de tecidos é Primeiro, o organismo deve ser capaz de se autorre- importante no diagnóstico de certas enfermidades. Muitos plicar (tópico considerado na Parte III); segundo, ele medicamentos agem por interação com enzimas. As enzi- deve ser capaz de catalisar reações químicas com eficiên- mas também são ferramentas importantes na engenharia cia e seletividade. A importância central da catálise pode química, tecnologia de alimentos e agricultura. parecer surpreendente, mas é fácil de demonstrar. Como O capítulo inicia com descrições das propriedades das foi descrito no Capítulo 1, os sistemas vivos fazem uso da enzimas e os princípios que embasam seu poder catalítico, energia do ambiente. Muitos humanos, por exemplo, con- depois aborda a cinética enzimática, disciplina que fornece somem quantidades substanciais de sacarose (o açúcar muito do arcabouço para qualquer discussão a respeito de comum) como combustível, geralmente na forma de co- enzimas. Serão dados exemplos específicos de mecanismos midas e bebidas doces. A conversão de sacarose em CO2 de ação de algumas enzimas de modo a ilustrar os princí- e H2O, em presença de oxigênio, é um processo altamen- pios apresentados no início do capítulo. Por fim, o capítulo te exergônico, liberando energia livre que pode ser usada para pensar, mover-se, sentir gostos e enxergar. Entretan- discute como a atividade das enzimas é regulada. to, um saco de açúcar pode permanecer na prateleira por anos a fio sem qualquer conversão evidente em CO2 e H2O. Embora esse processo químico seja termodinamicamente 6.1 Introdução às enzimas favorável, ele é muito lento. Mesmo assim, quando a sa- Boa parte da história da bioquímica é a história da pesquisa carose é consumida por seres humanos (ou por qualquer sobre enzimas. A catálise biológica foi reconhecida e des- outro organismo), ela libera sua energia química em se- crita nos final dos anos de 1700 em estudos da digestão de gundos. A diferença é a catálise. Sem catálise, as reações carne por secreções do estômago. A pesquisa continuou no químicas como aquelas da oxidação da sacarose poderão século seguinte examinando a conversão do amido em açú- não ocorrer na escala de tempo adequada e então não po- car pela saliva e por vários extratos de plantas. Por volta dem sustentar a vida. de 1850, Louis Pasteur concluiu que a fermentação de açú- Neste capítulo, o foco se voltará para os catalisadores car em álcool por leveduras é catalisada por “fermentos”. das reações dos sistemas biológicos: as enzimas, as pro- Ele postulou que esses fermentos eram inseparáveis da es- teínas mais notáveis e mais altamente especializadas. As trutura das células de levedura vivas. Esse ponto de vista, enzimas têm um poder catalítico extraordinário, geral- chamado de vitalismo, prevaleceu por décadas. Então, em mente muito maior do que os catalisadores sintéticos ou 1897, Eduard Buchner descreveu que extratos de levedura inorgânicos. Elas têm um alto grau de especificidade para podiam fermentar açúcar em álcool, provando que a fer- os seus respectivos substratos, aceleram as reações quími- mentação era feita por moléculas que continuavam ativas cas e atuam em soluções aquosas sob condições suaves de mesmo após serem removidas das células. Os experimentos temperatura e pH. Poucos catalisadores não biológicos têm de Buchner, ao mesmo tempo, marcaram o final da visão vi- esse conjunto de propriedades. talista e o alvorecer da ciência bioquímica. Posteriormente, As enzimas estão no centro de cada um dos processos Frederick W. Kühne deu o nome de enzimas para as molé- bioquímicos. Atuando em sequências organizadas, elas ca- culas detectadas por Buchner. 190 D AV I D L. N E L S O N & M I C H A E L M. COX quantidades. As coenzimas serão estu- dadas com mais detalhe à medida que forem abordadas as vias metabólicas na Parte II. Algumas enzimas necessitam tanto de uma coenzima quanto de um ou mais íons metálicos para terem ati- vidade. Uma coenzima ou um íon metá- lico que se ligue muito firmemente, ou mesmo covalentemente, a uma enzima é denominado grupo prostético. Uma enzima completa, cataliticamente ativa junto com a sua coenzima e/ou íons me- Eduard Buchner, 1860-1917 James Sumner, 1887-1955 J. B. S. Haldane, 1892-1964 tálicos, é denominada holoenzima. A parte proteica de uma dessas enzimas é denominada apoenzima ou apoproteí- O isolamento e a cristalização da urease por James Su- na. Finalmente, algumas enzimas são modificadas covalen- mner em 1926 foi uma quebra de paradigma nos estudos temente por fosforilação, glicosilação e outros processos. iniciais sobre enzimas. Sumner descobriu que os cristais Muitas dessas modificações estão envolvidas na regulação de urease constituíam-se totalmente de proteína e postu- da atividade enzimática. lou que toda enzima é uma proteína. Na ausência de outros exemplos, essa ideia permaneceu controversa por algum As enzimas são classificadas segundo as reações tempo. Somente na década de 1930 é que a conclusão de Sumner foi amplamente aceita, isso depois que John Nor- que catalisam throp e Moses Kunitz cristalizaram a pepsina, a tripsina Muitas enzimas receberam seus nomes pela adição do sufi- e outras enzimas digestivas e descobriram que todas elas xo “ase” ao nome dos seus substratos ou a uma palavra que são proteínas. Durante esse período, J. B. S. Haldane es- descreve sua atividade. Assim, a urease catalisa a hidrólise creveu um tratado intitulado Enzymes. Embora a natureza da ureia e a DNA-polimerase catalisa a polimerização de molecular das enzimas não estivesse totalmente reconheci- nucleotídeos para formar DNA. Outras enzimas foram ba- da, Haldane fez a notável suposição de que ligações fracas tizadas pelos seus descobridores em razão de uma função entre a enzima e seu substrato poderiam ser usadas para ampla, antes que fosse conhecida a reação específica ca- catalisar a reação. Essa ideia ainda permanece essencial no talisada por elas. Por exemplo, uma enzima conhecida por conhecimento da catálise enzimática. atuar na digestão de alimentos foi denominada pepsina, do A partir da última parte do século XX, milhares de en- grego pepsis (digestão), e a lisozima foi denominada pela zimas foram purificadas, suas estruturas elucidadas e seus sua capacidade de lisar (degradar) a parede de bactérias. mecanismos explicados. Outras foram ainda denominadas a partir de sua fonte: a tripsina, denominada em parte do grego tryein (desgas- A maioria das enzimas é proteína tar), foi obtida esfregando tecido pancreático com glicerina. Às vezes, a mesma enzima tem dois ou mais nomes, ou duas Exceto por um pequeno grupo de moléculas de RNA catalí- enzimas têm o mesmo nome. Devido a essa ambiguidade ticas (Capítulo 26), todas as enzimas são proteínas. A ativi- e também ao número cada vez maior de enzimas que são dade catalítica depende da integridade das suas conforma- ções nativas. Se uma enzima for desnaturada ou dissociada nas suas subunidades, geralmente a atividade catalítica é perdida. Se uma enzima for degradada até os aminoácidos que a compõem, a atividade catalítica é sempre destruída. TABELA 61 Alguns íons inorgânicos que servem de cofatores Então, as estruturas proteicas primária, secundária, terciá- para enzimas ria e quaternária das enzimas são essenciais para a ativida- de catalítica. Íons Enzimas As enzimas, assim como as outras proteínas, têm pesos Cu 21 Citocromo-oxidase moleculares variando de cerca de 12.000 a mais de um mi- 21 31 Fe ou Fe Citocromo-oxidase, catalase, peroxidase lhão. Algumas enzimas não necessitam de outros grupos químicos além dos seus próprios resíduos de aminoácidos. K 1 Piruvato-cinase Outras necessitam de um componente químico adicional Mg 21 Hexocinase, glicose-6-fosfatase, piruvato-cinase denominado cofator, que pode ser um ou mais íons inor- 21 21 21 21 21 Mn Arginase, ribonucleotídeo-redutase gânicos como Fe , Mg , Mn ou Zn (Tabela 6-1) ou uma molécula orgânica ou metalorgânica complexa, deno- Mo Dinitrogenase minada coenzima. As coenzimas agem como carreadores Ni 21 Urease transitórios de grupos funcionais específicos (Tabela 6-2). 21 Zn Anidrase carbônica, álcool-desidrogenase, A maioria deles é derivada das vitaminas, nutrientes or- carboxipeptidases A e B gânicos cuja presença na dieta é necessária em pequenas  PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 191 TABELA 62 Algumas coenzimas que servem como carreadores transitórios de átomos ou grupos funcionais específicos Coenzima Exemplo de grupo químico transferido Precursor presente na dieta de mamíferos Biocina CO2 Biotina Coenzima A Grupos acil Ácido pantotênico e outros compostos 59-Desoxiadenosilcobalamina (coenzima B12) Átomos de H e grupos alquil Vitamina B12 Flavina-adenina-dinucleotídeo Elétrons Riboflavina (vitamina B2) Lipoato Elétrons e grupos acil Não é necessário na dieta Nicotinamida-adeninadinucleotídeo Íon hidrido (:H–) Ácido nicotínico (niacina) Piridoxal-fosfato Grupos amino Piridoxina (vitamina B6) Tetra-hidrofolato Grupos de um carbono Folato Tiamina-pirofosfato Aldeídos Tiamina (vitamina B1) Nota: As estruturas e os modos de ação destas coenzimas estão descritos na Parte II. descobertas, os bioquímicos, por meio de um acordo inter- dedica-se principalmente aos princípios e às propriedades nacional, adotaram um sistema de nomenclatura e classifi- comuns a todas as enzimas. cação de enzimas. Esse sistema divide as enzimas em seis classes, cada uma com subclasses, com base nos tipos de RESUMO 6.1 Introdução às enzimas reações que catalisam (Tabela 6-3). Um número de classifi- c A vida depende de catalisadores poderosos e específi- cação de quatro partes e um nome sistemático, que identifi- cos: as enzimas. Praticamente todas as reações bioquí- ca a reação catalisada, são especificados para cada enzima. micas são catalisadas por enzimas. Como exemplo, o nome sistemático da enzima que catalisa a reação c Com a exceção de poucos RNA catalíticos, todas as en- zimas conhecidas são proteínas. Muitas necessitam de ATP 1 D-glicose S ADP 1 D-glicose-6-fosfato coenzimas ou cofatores não proteicos para exercerem a é ATP: glicose-fosfotransferase, indicando que ela catalisa a atividade catalítica. transferência de um grupo fosforribosil do ATP para a glico- c As enzimas são classificadas segundo o tipo de reação se. Seu número da Comissão de Enzimas (número E. C., do que catalisam. Todas as enzimas têm número E. C. e inglês Enzyme Commission) é 2.7.1.1. O primeiro número nome formais. Muitas têm nomes comuns. (2) indica o nome da classe (transferase); o segundo nú- mero (7), a subclasse (fosfotransferase); o terceiro número (1), uma fosfotransferase que tem um grupo hidroxila como 6.2 Como as enzimas funcionam aceptor, e o quarto número (1), D-glicose como o aceptor A catálise enzimática das reações é essencial para os siste- do grupo fosforil. Para muitas enzimas, é usado um nome mas vivos. Nas condições biológicas relevantes, as reações comum com mais frequência, hexocinase, nesse caso espe- não catalisadas tendem a ser lentas – a maioria das molé- cífico. Uma lista completa com a descrição dos milhares de culas biológicas é muito estável nas condições internas das enzimas conhecidas é mantida pelo Comitê de Nomenclatu- células com pH neutro, temperaturas amenas e ambiente ra da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecu- aquoso. Além disso, muitos processos químicos corriquei- lar (www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme). Este capítulo ros, como a formação transitória de intermediários instáveis TABELA 63 Classificação internacional das enzimas o Classe n Nome da classe Tipo de reação catalisada 1 Oxidorredutases Transferência de elétrons (íons hidrido ou átomos de H) 2 Transferases Reações de transferência de grupos 3 Hidrolases Reações de hidrólise (transferência de grupos funcionais para a água) 4 Liases Clivagem de C¬C, C¬O, C¬N ou outras ligações por eliminação, rompimento de ligações duplas ou anéis, ou adição de grupos a ligações duplas. 5 Isomerases Transferência de grupos dentro de uma mesma molécula produzindo formas isoméricas 6 Ligases Formação de ligações C¬C, C¬S, C¬O e C¬N por reações de condensação acopladas à hidrólise de ATP ou cofatores similares 192 D AV I D L. N E L S O N & M I C H A E L M. COX carregados ou a colisão de duas ou mais moléculas exata- uma reação. A função do catalisador é aumentar a veloci- mente na orientação exata necessária para que as reações dade da reação. A catálise não afeta o equilíbrio da rea- ocorram, são desfavoráveis ou improváveis no ambiente ce- ção. Qualquer reação, como S P, pode ser descrita por lular. As reações necessárias para digerir os alimentos, en- um diagrama de coordenadas da reação (Figura 6-2), que viar sinais nervosos ou contrair os músculos simplesmente representa a variação de energia durante a reação. A ener- não ocorrem em velocidades adequadas sem catálise. gia é descrita nos sistemas biológicos, como foi discutido As enzimas contornam esses problemas ao proporciona- no Capítulo 1, em termos de energia livre, G. No diagra- rem um ambiente específico adequado para que uma dada ma de coordenadas da reação, a energia livre do sistema é reação possa ocorrer mais rapidamente. A propriedade colocada no gráfico em função do progresso da reação (a característica das reações catalisadas por enzimas é que a coordenada da reação). O ponto de partida tanto da rea- reação ocorre confinada em um bolsão da enzima denomi- ção direta quanto da reação reversa é denominado estado nado sítio ativo (Figura 6-1). A molécula que liga no sítio fundamental, a contribuição que uma molécula média (S ativo e sobre a qual a enzima age é denominada substra- ou P) fornece para a energia livre do sistema, sob dadas to. O contorno da superfície do sítio ativo é delimitado por condições do sistema. resíduos de aminoácidos com grupos nas cadeias laterais CONVENÇÃOCHAVE: Para descrever a variação de energia livre que ligam o substrato e que catalisam a sua transformação das reações, químicos definiram um conjunto de condições química. Frequentemente, o sítio ativo engloba o substrato, padrão (temperatura de 298 K; pressão parcial de cada gás sequestrando-o completamente da solução. O complexo en- de 1 atm [ou 101,3 kPa]; concentração de cada soluto de 1 zima-substrato, cuja existência foi primeiramente proposta M) e expressam as mudanças de energia livre de um siste- por Charles-Adolphe Wurtz em 1880, é fundamental para a ma reagindo sob essas condições como DG°, a variação de ação enzimática. Também é o ponto de partida para o tra- energia livre padrão. Uma vez que os sistemas bioquími- tamento matemático que define o comportamento cinético 1 cos geralmente envolvem concentrações de H muito abai- das reações catalisadas por enzimas e para a descrição teó- xo de 1 M, bioquímicos definiram uma variação de ener- rica dos mecanismos das enzimas. gia livre padrão bioquímica, DG9°, a variação de energia livre padrão em pH 7,0. Essa definição será usada neste As enzimas alteram a velocidade da reação, livro. Uma definição mais completa de DG9° é fornecida no não o equilíbrio Capítulo 13. Uma reação enzimática simples pode ser escrita como O equilíbrio entre S e P reflete a diferença entre as ener- gias livres dos seus estados fundamentais. No exemplo mos- (6-1) trado na Figura 6-2, a energia livre do estado fundamental onde E, S e P representam enzima, substrato e produto; ES de P é menor do que a de S, e então DG9° para a reação é e EP são complexos transitórios da enzima com o substrato negativa (reação exergônica) e o equilíbrio favorece mais P e com o produto. que S. A posição e a direção do equilíbrio não são afetadas Para entender a catálise, deve-se primeiro avaliar a im- pelos catalisadores. portância de distinguir entre o equilíbrio e a velocidade de Um equilíbrio favorável não significa que a conversão S S P ocorra em uma velocidade detectável. A veloci- dade da reação depende de um parâmetro totalmente diferente. Há uma barreira energética entre S e P: a ener- gia necessária para alinhar os grupos reagentes, para a Estado de transição (‡) Resíduos-chave Substrato do sítio ativo DG‡ Energia livre, G S P ‡ DG P S S DG98 Estado P fundamental Estado fundamental Coordenada da reação FIGURA 62 Diagrama da coordenada da reação. A energia livre do sis- tema está colocada no gráfico versus o progresso da reação S S P. Diagramas deste tipo descrevem as mudanças de energia durante a reação. O eixo ho- FIGURA 61 Ligação de um substrato no sítio ativo de uma enzima. rizontal (coordenada da reação) reflete as mudanças químicas progressivas A enzima quimotripsina, com o substrato ligado (PBD ID 7GCH). Alguns dos (p. ex., quebra ou formação da ligação) à medida que S é convertido em P. resíduos-chave do sítio ativo aparecem como uma mancha vermelha na su- As energias de ativação, DG‡, para as reações S S P e P S S estão indicadas. perfície da enzima. DG9° é a variação total da energia livre padrão na direção S S P.  PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 193 formação de cargas instáveis transitórias, rearranjos de Esse princípio geral é ilustrado pela conversão de saca- ligações e ainda outras transformações necessárias para rose e oxigênio em dióxido de carbono e água: que a reação ocorra em qualquer direção. Isso é ilustrado C12H22O11 1 12 O2 12 CO2 1 11 H2O pela curva de energia nas Figuras 6-2 e 6-3. Para que a reação ocorra, as moléculas devem suplantar essa barrei- Essa conversão, que ocorre por meio de uma série de rea- ra e atingir um nível de energia mais alto. O topo da curva ções separadas, tem DG9° muito grande e negativo, e, no de energia é um ponto a partir do qual o decaimento para equilíbrio, a quantidade de sacarose presente é desprezí- o estado S ou para o estado P tem a mesma probabilidade vel. Ainda assim, a sacarose é um composto estável, porque de ocorrer (nos dois casos a curva é descendente). Isso é a barreira da energia de ativação que deve ser suplantada denominado estado de transição. O estado de transição antes que reaja com oxigênio é bastante alta. A sacarose não é uma forma química com alguma estabilidade signi- pode ser armazenada em um recipiente com oxigênio qua- ficativa e não deve ser confundido com os intermediários se que indefinidamente sem reagir com ele. Nas células, da reação (como ES ou EP). O estado de transição é um entretanto, a sacarose é prontamente degradada em CO2 momento molecular transitório em que eventos como a e H2O em uma série de reações catalisadas por enzimas. quebra de ligação, a formação de ligação ou o desenvol- Essas enzimas não apenas aceleram as reações, mas tam- vimento de carga ocorrem com a mesma probabilidade bém as organizam e as controlam de modo que boa parte de seguirem tanto para formar novamente o substrato da energia liberada é recuperada em outras formas quími- como para formar o produto. A diferença entre os níveis cas, sendo disponibilizada para as células realizarem outras energéticos do estado basal e do estado de transição é a tarefas. A via de reações na qual a sacarose (e outros açú- ‡ energia de ativação, DG. A velocidade da reação re- cares) é degradada constituiu a via primária de produção flete essa energia de ativação: uma energia de ativação de energia das células. As enzimas dessa via permitem que maior corresponde a uma reação mais lenta. A velocidade a sequência de reações ocorra em uma escala de tempo da reação pode aumentar pela elevação da temperatura biologicamente útil. e/ou da pressão, o que aumenta o número de moléculas As reações podem ter várias etapas, incluindo a for- com energia suficiente para suplantar a barreira energé- mação e o consumo de espécies químicas transitórias de- 1 tica. Alternativamente, a energia de ativação pode ser di- nominadas intermediários da reação. Qualquer espé- minuída pela adição de um catalisador (Figura 6-3). Os cie da rota da reação que tenha uma vida química finita –13 catalisadores aumentam a velocidade das reações por (maior do que a vibração molecular, ,10 segundos) é diminuírem as energias de ativação. um intermediário da reação. Quando a reação S Pé As enzimas não são exceções à regra de que os ca- catalisada por uma enzima, os complexos ES e EP podem talisadores não afetam o equilíbrio da reação. As flechas ser considerados intermediários, mesmo que S e P sejam bidirecionais na Equação 6-1 indicam isso: qualquer enzi- espécies químicas estáveis (Equação 6-1); os complexos ma que catalise a reação S S P também catalisa a reação ES e EP ocupam vales no diagrama das coordenadas da P S S. O papel da enzima é acelerar a interconversão reação (Figura 6-3). Além disso, no curso de uma rea- entre S e P. A enzima não é gasta no processo e o ponto ção catalisada por enzima geralmente existem interme- de equilíbrio não é afetado. Entretanto, a reação atinge diários químicos menos estáveis. A interconversão entre o equilíbrio muito mais rapidamente quando a enzima dois intermediários da reação que ocorrem em sequência apropriada estiver presente, pois a velocidade da reação constitui uma etapa da reação. Quando uma reação tem é aumentada. várias etapas, a velocidade final é determinada pela etapa (ou etapas) com a maior energia de ativação. Essa etapa é denominada etapa limitante da velocidade. Em um Estado de transição (‡) caso simples, a etapa limitante da velocidade é o ponto de maior energia no diagrama da interconversão entre S e ‡ P. Na prática, a etapa limitante da reação pode variar se- DG não catalisada Energia livre, G gundo as condições de reação, sendo que muitas enzimas ‡ podem ter várias etapas com energias de ativação simila- DG‡catalisada res, significando que todas essas etapas são parcialmente ES EP S limitantes da velocidade. P A energia de ativação é uma barreira energética para as reações químicas. Essas barreiras são cruciais para a pró- pria vida. A velocidade na qual uma molécula sofre uma Coordenada da reação determinada reação diminui à medida que a barreira da rea- ção aumenta. Sem essas barreiras energéticas, as macro- FIGURA 63 Diagrama da coordenada da reação comparando uma reação catalisada por enzima com uma não catalisada. Na reação 1 Neste capítulo, etapa e intermediário referem-se às espécies químicas S S P, os intermediários ES e EP ocupam o nível mínimo na curva da pro- na via de uma única reação catalisada por uma enzima. No contexto de gressão da energia de uma reação catalisada por uma enzima. Os termos vias metabólicas envolvendo muitas enzimas (discutido na Parte II), esses DG‡não catalisada e DG‡catalisada correspondem, respectivamente, à energia de termos são usados de maneira diferente. Uma reação enzimática inteira ge- ativação da reação não catalisada e à energia de ativação total da reação ralmente é tomada como uma “etapa” da via, e o produto de uma reação catalisada. A energia de ativação é menor quando a reação é catalisada por enzimática (que é o substrato para a próxima enzima da via) é referido uma enzima. como “intermediário”. 194 D AV I D L. N E L S O N & M I C H A E L M. COX moléculas complexas poderiam reverter espontaneamente reação, V (representando a quantidade de S que reage para formas moleculares mais simples, e as estruturas com- por unidade de tempo), é expressa por uma equação de plexas e altamente ordenadas e os processos metabólicos velocidade: das células não poderiam existir. Durante o curso da evolu- (6-4) ção, as enzimas desenvolveram-se para diminuir seletiva- mente as energias de ativação das reações necessárias para Nessa reação, a velocidade depende apenas da concentra- a sobrevivência celular. ção de S, sendo uma reação de primeira ordem. O fator k é uma constante de proporcionalidade que reflete a proba- bilidade de que a reação ocorra em determinado conjunto A velocidade e o equilíbrio da reação têm definições de condições (pH, temperatura, etc.). Aqui, k é a constan- termodinâmicas precisas te de velocidade de primeira ordem e tem como unidade a O equilíbrio da reação está inexoravelmente ligado à va- recíproca do tempo, como s–1. Se uma reação de primeira riação da energia livre padrão da reação, DG9° e a veloci- ordem tiver uma constante de velocidade k de 0,03 s–1, isso ‡ dade da reação está ligada à energia de ativação, DG. Uma pode ser interpretado (quantitativamente) como que 3% do introdução básica sobre essas relações termodinâmicas é a S disponível serão convertidos em P em 1 s. Uma reação próxima etapa para compreender como as enzimas agem. com uma constante de velocidade de 2.000 s–1 ocorrerá em Um equilíbrio como S P é descrito por uma cons- uma pequena fração de segundo. Se a velocidade de reação tante de equilíbrio, Keq, ou simplesmente K (p. 25). depender da concentração de dois compostos diferentes, Nas condições padrão usadas para comparar os proces- ou se a reação for entre duas moléculas de um mesmo com- sos bioquímicos, a constante de equilíbrio é designada K9eq posto, a reação será de segunda ordem, e k é a constante (ou K9): de velocidade de segunda ordem, com unidade de M–1s–1. A equação da velocidade passa a ser (6-2) (6-5) Segundo a termodinâmica, a relação entre K9eq e DG9° pode A partir da teoria do estado de transição pode-se derivar ser descrita pela expressão uma expressão relacionando a magnitude da constante de velocidade com a energia de ativação: (6-3) onde R é a constante dos gases, 8,315 J/mol ? K, e T é a (6-6) temperatura absoluta, 298 K (25°C). A Equação 6-3 é de- senvolvida e discutida com mais detalhes no Capítulo 13. onde k é a constante de Boltzmann e h é a constante de Aqui, o ponto importante é que a constante de equilíbrio Planck. Nesse momento, o ponto importante é que a rela- é diretamente relacionada com o total da energia livre pa- ção entre a constante de velocidade k e a energia de ativa- drão da reação (Tabela 6-4). Um grande valor negativo de ção DG‡ é inversa e exponencial. De maneira simples, essa DG9° reflete um equilíbrio de reação favorável, mas, como é a base para afirmar que energia de ativação mais baixa foi observado, isso não significa que a reação ocorrerá com significa velocidade de reação mais rápida. velocidade alta. Depois de analisar o que as enzimas fazem, é possível A velocidade de uma reação é determinada pela con- focalizar como elas o fazem. centração do reagente (ou reagentes) e por uma cons- tante de velocidade, normalmente designada por k. Poucos princípios são suficientes para explicar o poder Para uma reação unimolecular S S P, a velocidade da catalítico e a especificidade das enzimas As enzimas são catalisadores extraordinários. O aumento de velocidade conferido pelas enzimas situa-se na faixa TABELA 64 Relações entre K9eq e DG9° de 5 a 17 ordens de magnitude (Tabela 6-5). As enzimas também são muito específicas, distinguindo facilmente K9eq DG9° (kJ/mol) substratos com estruturas muito semelhantes. Como é –6 10 34,2 que esse enorme e altamente seletivo aumento de veloci- 10 –5 28,5 dade pode ser explicado? Qual é a fonte de energia para essa grande diminuição nas energias de ativação de rea- 10–4 22,8 ções específicas? 10–3 17,1 A resposta para essas questões tem duas partes distin- 10 –2 11,4 tas, embora interligadas. A primeira parte baseia-se no re- 10–1 5,7 arranjo de ligações covalentes durante a reação catalisada pela enzima. Muitos tipos de reações químicas ocorrem en- 1 0 tre substratos e grupos funcionais da enzima (cadeias espe- 101 –5,7 cíficas de aminoácidos, íons metálicos e coenzimas). Gru- 102 –11,4 pos funcionais catalíticos na enzima podem formar ligações 3 covalentes transitórias com um substrato e ativá-lo para a 10 –17,1 reação, ou um grupo pode ser transitoriamente transferi- Nota: Esta relação é calculada a partir de DG9° 5 –RT ln K9eq (Equação 6-3). do do substrato para a enzima. Geralmente, essas reações  PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 195 TABELA 65 Esses termos são essenciais para o entendimento das enzi- Alguns aumentos de velocidade proporcionados mas e constituem importante foco deste capítulo. por enzimas 5 Ciclofilina 10 As interações fracas entre enzima e substrato são 7 Anidrase carbônica 10 9 otimizadas no estado de transição Triose-fosfato-isomerase 10 Como é que as enzimas utilizam a energia de ligação para 11 Carboxipeptidase A 10 diminuírem a energia de ativação de uma reação? A forma- Fosfoglicomutase 10 12 ção do complexo ES não é, por si só, uma explicação, embo- ra algumas das primeiras considerações sobre os mecanis- Succinil-CoA-transferase 1013 14 mos de ação das enzimas tenham começado com essa ideia. Urease 10 Estudos sobre a especificidade das enzimas, realizados por Orotidina-monofosfato-descarboxilase 10 17 Emil Fischer, o levaram a propor, em 1894, que as enzimas seriam estruturalmente complementares aos seus subs- tratos de modo a se encaixarem como uma chave em uma fechadura (Figura 6-4). Essa ideia elegante, de que uma ocorrem apenas no sítio ativo da enzima. Interações cova- interação específica (portanto, exclusiva) entre duas molé- lentes entre enzimas e substratos diminuem a energia de culas biológicas seria mediada por superfícies moleculares ativação, acelerando a reação, por fornecerem condições com formas complementares, influenciou muito o desenvol- para que a reação ocorra por uma via alternativa de baixa vimento da bioquímica; efetivamente, essas interações são energia. Os tipos específicos de rearranjos que ocorrem es- centrais para muitos processos bioquímicos. Entretanto, a tão descritos na Seção 6.4. hipótese da “chave e fechadura” pode ser enganadora quan- A segunda parte da explicação fundamenta-se em in- terações não covalentes entre enzima e substrato. É im- portante lembrar (Capítulo 4) que interações fracas não NADP1 covalentes ajudam a estabilizar a estrutura das proteínas e Não ligado as interações proteína-proteína. Essas mesmas interações são cruciais para a formação de complexos entre proteínas e moléculas pequenas, incluindo os substratos de enzimas. Muito da energia necessária para diminuir a energia de ati- vação provém de interações fracas não covalentes entre substrato e enzima. O que realmente distingue as enzimas de outros catalisadores é a formação de um complexo ES específico. A interação entre substrato e enzima nesse com- Tetra-hidrofolato plexo é mediada pelas mesmas forças que estabilizam a es- trutura das proteínas, incluindo ligações de hidrogênio e in- terações hidrofóbicas e iônicas (Capítulo 4). A formação de cada interação fraca no complexo ES é acompanhada pela liberação de uma pequena quantidade de energia livre que estabiliza a interação. A energia proveniente da interação Ligado enzima-substrato é denominada energia de ligação, DGB. O seu significado abrange mais que uma simples interação enzima-substrato. A energia de ligação é a principal fon- te de energia livre utilizada pelas enzimas para a dimi- nuição da energia de ativação das reações. Dois princípios fundamentais inter-relacionados possi- bilitam uma explicação geral de como as enzimas utilizam a energia de ligação não covalente. 1. Muito do poder catalítico das enzimas provém ba- sicamente da energia livre liberada na formação de muitas ligações fracas e interações entre a enzima e seu substrato. Essa energia de ligação contribui tanto para a especificidade como também para a FIGURA 64 Complementaridade de formas entre o substrato e o catálise. seu sítio de ligação na enzima. A enzima di-hidrofolato-redutase com o 2. Interações fracas são otimizadas no estado de tran- seu substrato NADP1 (em vermelho) não ligado (acima) e ligado (abaixo). sição da reação. Os sítios ativos das enzimas são O tetra-hidrofolato (em amarelo) também é visível (PDB 1D 1RA2). Neste modelo, o NADP1 liga-se a um bolsão complementar à sua forma e às suas complementares não aos substratos por si mesmos, propriedades iônicas, ilustração da hipótese de “chave e fechadura” proposta mas aos estados de transição pelos quais os subs- por Emil Fischer para a ação enzimática. Na realidade, a complementaridade tratos passam ao serem convertidos em produtos entre proteína e ligante (neste caso, o substrato) raramente é perfeita, como durante a reação enzimática. visto no Capítulo 5. 196 D AV I D L. N E L S O N & M I C H A E L M. COX do aplicada à catálise enzimática. Uma enzima totalmente néticas entre o bastão e a enzima. Uma enzima desse tipo complementar ao seu substrato seria uma enzima muito po- impede a reação, porque estabiliza o substrato em vez de bre, como se pode demonstrar. desestabilizá-lo. No diagrama de coordenadas da reação Por exemplo, considere uma reação imaginária, a que- (Figura 6-5b), esse tipo de complexo ES corresponderia a bra de um bastão de metal magnetizado; a reação não uma energia da qual o substrato teria dificuldade de esca- catalisada está mostrada na Figura 6-5a. Duas enzimas par. Uma enzima dessas seria inútil. imaginárias – duas “bastonases” – poderiam catalisar essa A noção moderna da catálise enzimática, primeira- reação. Ambas utilizam forças magnéticas como paradig- mente proposta por Michael Polanyi (1921) e Haldane ma para a energia de ligação utilizada por enzimas reais. (1930), foi elaborada por Linus Pauling em 1946 e por Primeiro, será desenhada uma enzima perfeitamente William P. Jencks na década de 1970. Para poder catalisar complementar ao substrato (Figura 6-5b). O sítio ativo reações, as enzimas devem ser complementares ao esta- dessa bastonase é um bolsão delimitado por ímãs. Para do de transição da reação. Isso significa que interações reagir (quebrar), o bastão deve atingir o estado de transi- ótimas entre substratos e enzimas só ocorrem no estado ção da reação, mas o bastão se encaixa tão perfeitamente de transição. A Figura 6-5c demonstra como uma enzima ao sítio ativo que não consegue se dobrar, pois ao se do- dessas pode funcionar. O bastão de metal liga-se à bas- brar haveria a eliminação de algumas das interações mag- tonase, mas apenas um subconjunto das interações mag- (a) Sem enzima ‡ Substrato Estado de transição Produto Energia livre, G (bastão metálico) (bastão curvado) (bastão quebrado) DG‡não cat S P ‡ S P Coordenada da reação (b) Enzima complementar ao substrato ‡ Energia livre, G Enzima DG‡não cat Magnetos DG‡cat Poucos produtos S ES P DGM ES Coordenada da reação (c) Enzima complementar ao estado de transição ‡ E Energia livre, G DG‡não cat DGM ‡ ‡ DG‡ ES 1 S ES P P Coordenada da reação FIGURA 65 Proposta de uma enzima imaginária (bastonase) que energia livre necessária para curvar o bastão. Os diagramas das coordenadas catalise a quebra de um bastão metálico. (a) Antes da quebra, o bas- das reações (à direita) mostram as consequências energéticas da comple- tão primeiro deve ser curvado (o estado de transição). Nos dois exemplos mentaridade ao substrato versus a complementaridade ao estado de transi- de bastonase, interações magnéticas representam as ligações fracas entre a ção (os complexos EP estão omitidos). DGM, a diferença entre as energias dos enzima e o substrato. (b) A bastonase com um bolsão magnético de estru- estados de transição da reação catalisada e da não catalisada, reflete a con- tura complementar a do bastão (o substrato) estabiliza o substrato. O curva- tribuição das interações magnéticas entre o bastão e a bastonase. Quando mento é impedido pelas atrações magnéticas entre o bastão e a bastonase. a enzima for complementar ao substrato (b), o complexo ES é mais estável (c) Uma enzima com bolsão complementar ao estado de transição da rea- e tem menos energia livre no estado basal que o substrato isoladamente. O ção ajuda a desestabilizar o bastão, contribuindo para a catálise da reação. resultado é um aumento na energia de ativação. A energia de ligação das interações magnéticas compensa o aumento da  PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 197 néticas possíveis é usado para formar o complexo ES. O nar precisamente esses grupos de modo que a energia de substrato ligado ainda deve ter aumento na energia livre ligação seja otimizada no estado de transição. A formação para atingir o estado de transição. Agora, entretanto, o de uma ligação adequada é atingida mais facilmente pelo aumento de energia livre necessário para tensionar o bas- posicionamento do substrato em uma cavidade (o sítio ati- tão em uma curvatura e quebrar parcialmente a confor- vo) onde é efetivamente removido da água. O tamanho das mação é compensado (“pago”) pelas interações (energia proteínas reflete a necessidade de uma superestrutura para de ligação) que se formam entre a enzima e o substrato no manter os grupos interativos posicionados adequadamente estado de transição. Muitas dessas interações envolvem e para evitar o colapso da cavidade. partes do bastão distantes do ponto de quebra. Assim, as interações entre a bastonase e as regiões não reagentes A energia de ligação contribui para a especificidade da do bastão fornecem parte da energia necessária para ca- talisar a quebra do bastão. Esse “pagamento de energia” reação e a catálise traduz-se em diminuição efetiva na energia de ativação e É possível demonstrar quantitativamente que a energia aumento na velocidade da reação. de ligação é responsável pela enorme aceleração na ve- As enzimas reais agem segundo um princípio análogo. locidade proporcionada pelas enzimas? A resposta é sim. No complexo ES há a formação de interações fracas, mas Como ponto de referência, a Equação 6-6 permite calcular ‡ a completa complementaridade entre o substrato e a enzi- que, nas condições normais das células, DG deve ser di- ma ocorre apenas quando o substrato estiver no estado de minuído em cerca de 5,7 kJ/mol para acelerar uma reação transição. A energia livre (energia de ligação) liberada du- de primeira ordem por um fator de 10. A energia que é rante a formação dessas interações compensa parcialmente disponibilizada pela formação de uma única interação fraca a energia necessária para atingir o topo da curva de energia. geralmente é estimada em 4 a 30 kJ/mol. A energia total ‡ A soma da energia de ativação DG desfavorável (positiva) disponibilizada por um certo número dessas interações é, e a energia de ligação favorável DGB (negativa) resulta em portanto, suficiente para uma diminuição da energia de ati- uma redução líquida da energia de ativação (Figura 6-6). vação entre os 60 e os 100 kJ/mol necessários para explicar Mesmo quando ligado à enzima, o estado de transição não o grande aumento na velocidade das reações observado em é uma forma estável, mas sim o curto período de tempo em muitas enzimas. que o substrato permanece no topo da curva de energia. A mesma energia de ligação que fornece energia para Reações catalisadas por enzimas são muito mais rápidas a catálise também dá às enzimas sua especificidade, isto que os processos não catalisados, pois a barreira energética é, a capacidade de distinguir entre substratos e moléculas a ser vencida é muito menor. O princípio importante é que competidoras. Conceitualmente, especificidade é fácil de interações com ligações fracas entre a enzima e o subs- distinguir de catálise, contudo, essa diferenciação é mui- trato fornecem uma substancial força propulsora para to mais difícil de demonstrar experimentalmente, pois a a catálise enzimática. Os grupos presentes no substrato e catálise e a especificidade provêm do mesmo fenômeno. envolvidos nessas ligações fracas podem atuar a alguma dis- Se o sítio ativo de uma enzima tiver grupos funcionais or- tância das ligações rompidas ou modificadas. As interações ganizados otimamente de modo que se forme uma grande fracas formadas apenas no estado de transição são as que variedade de interações fracas com determinado substra- fazem a principal contribuição para a catálise. to no correspondente estado de transição, a enzima não A necessidade de múltiplas interações fracas para impe- será capaz de interagir com a mesma intensidade com al- lir a catálise ajuda a explicar por que as enzimas (e algumas guma outra molécula. Por exemplo, se o substrato tiver coenzimas) são tão grandes. A enzima deve fornecer grupos um grupo hidroxila que forme uma ligação de hidrogênio funcionais para as interações iônicas, ligações de hidrogê- com um resíduo específico de Glu de uma enzima, qual- nio e outras interações importantes e também deve posicio- quer molécula que não tiver um grupo hidroxila naquela determinada posição será um substrato pobre para essa enzima. Ainda, qualquer molécula que tiver um grupo ‡ funcional extra para o qual a enzima não tenha um bol- são ou um sítio de ligação provavelmente será excluída DG‡não cat DGB da enzima. De maneira geral, a especificidade deriva da Energia livre, G ‡ formação de muitas interações fracas entre a enzima e a ‡ molécula específica do substrato. DG cat ES EP A importância da energia de ligação para a catálise pode S ser facilmente demonstrada. Por exemplo, a enzima glicolí- P tica triose-fosfato-isomerase catalisa a interconversão entre gliceraldeído-3-fosfato e di-hidroxiacetona-fosfato: 1 Coordenada da reação HC O H 2C OH 2 FIGURA 66 Papel da energia de ligação na catálise. Para diminuir a HC OH C O energia de ativação da reação, o sistema deve adquirir uma quantidade de Triose- 3 energia equivalente ao valor da diminuição de DG‡. Boa parte dessa energia CH2OPO322 -fosfato- CH2OPO322 vem da energia de ligação (DGB) proporcionada pela formação de interações -isomerase fracas não covalentes entre substrato e enzima que ocorrem no estado de Gliceraldeído- Di-hidroxiace- transição. O papel de DGB é análogo ao de DGM da Figura 6-5. -3-fosfato tonafosfato 198 D AV I D L. N E L S O N & M I C H A E L M. COX Esta reação rearranja os grupos carbonila e hidroxila dos Reação Aumento de carbonos 1 e 2. Entretanto, mais de 80% da aceleração da velocidade velocidade da reação catalisada pela enzima foi relaciona- (a) O O do com as interações enzima-substrato envolvendo o gru- CH3 C OR 2 OR po fosfato do carbono 3 do substrato. Isso foi determina- CH3 C 1 1 do comparando as reações catalisadas pela enzima usando k (M21s21) O como substratos gliceraldeído-3-fosfato e gliceraldeído O CH3 C (sem grupo fosfato na posição 3). CH3 C O2 O O princípio geral apresentado anteriormente pode ser ilustrado por vários mecanismos catalíticos bem conheci- (b) O O dos. Esses mecanismos não são mutuamente excludentes, de modo que uma mesma enzima pode incorporar vários C OR 2 OR C tipos de mecanismos no seu mecanismo total de ação. O 105 M Considerando o que é necessário para a reação acon- C O2 k (s21) C tecer, verifica-se que fatores físicos e termodinâmicos pre- ponderantes contribuem para DG‡, a barreira para a reação. O O Entre esses mecanismos, é possível incluir (1) a entropia (liberdade de movimento) das moléculas em solução, que (c) O O O O reduz a possibilidade de que elas reajam entre si; (2) a ca- 2 OR mada de solvatação das moléculas de água ligadas por liga- C OR C 108 M O k (s21) ções de hidrogênio e que rodeiam e ajudam a estabilizar a O maioria das moléculas biológicas em solução aquosa; (3) a C O2 C distorção dos substratos que ocorre em muitas reações; (4) O a necessidade de um alinhamento apropriado dos grupos funcionais catalíticos da enzima. A energia de ligação pode FIGURA 67 Aumento da velocidade por redução da entropia. A figu- ser usada para superar todas essas barreiras. ra mostra reações de ésteres com grupos carboxilatos formando anidridos. Primeiro, uma grande restrição à mobilidade relativa Em todos os casos, o grupo R é o mesmo. (a) Nesta reação bimolecular, a constante k é de segunda ordem, com unidades de M–1s–1. (b) Quando os de dois substratos prestes a reagir, ou redução da en- dois grupos reagentes estão em uma mesma molécula, e então têm menor tropia, é um benefício óbvio proporcionado pela ligação liberdade de movimento, a reação é muito mais rápida. Nesta reação unimo- deles à enzima. A energia de ligação mantém o substrato lecular, k tem unidade de s–1. Dividindo a constante de velocidade de (b) pela na orientação apropriada para reagir, uma contribuição constante de velocidade de (a) obtém-se um fator de aumento de veloci- substancial para a catálise, porque colisões produtivas dade de 105 M. (O aumento de velocidade tem como unidade a molaridade, entre as moléculas da solução podem ser muito raras. Os pois neste caso uma reação unimolecular foi comparada com uma reação bimolecular.) Colocando de outra maneira, se o reagente em (b) estiver em substratos podem ser alinhados precisamente com a en- uma concentração de 1 M, o comportamento dos grupos reativos será o mes- zima com muitas interações fracas entre cada substrato e mo que teria caso estivesse em uma concentração de 105 M. Observe que a grupos estrategicamente posicionados na enzima fixando reação em (b) tem liberdade de rotação em três de suas ligações (mostradas as moléculas de substrato na posição apropriada. Estudos por meio de setas curvas), mas, mesmo assim, isso representa uma redução mostraram que restrições à mobilidade de dois reagentes substancial de entropia em relação a (a). Se as rotações das ligações que gi- podem produzir um aumento de várias ordens de grandeza ram em (b) forem tolhidas como em (c), a entropia é reduzida ainda mais e a reação apresenta um aumento de velocidade de 108 M em relação a (a). na velocidade (Figura 6-7). Segundo, a formação de ligações fracas entre substrato e enzima resulta na dessolvatação do substrato. Intera- induzido serve para levar grupos funcionais específicos da ções enzima-substrato substituem a maioria das ligações de enzima para uma posição apropriada para catalisar a rea- hidrogênio entre o substrato e as moléculas de água que ção. As mudanças conformacionais também permitem a for- são um impedimento para a reação. Terceiro, a energia de mação de ligações fracas adicionais no estado de transição. ligação envolvendo interações fracas, que se formam ape- Em ambos os casos, a nova conformação da enzima apre- nas no estado de transição da reação, ajudam a compensar senta propriedades catalíticas aumentadas. Como foi visto, termodinamicamente qualquer distorção, principalmente a o ajuste induzido é uma característica comum da interação redistribuição de elétrons, de modo que então o substrato reversível de ligantes com proteínas (Capítulo 5). O ajuste pode sofrer a reação. induzido também é importante para a interação de pratica- Finalmente, em geral a enzima também sofre uma mu- mente todas as enzimas com seus substratos. dança de conformação quando o substrato se liga a ela, in- duzindo múltiplas interações fracas com o substrato. Isso é chamado de ajuste induzido, mecanismo postulado por Grupos catalíticos específicos contribuem para a catálise Daniel Koshland em 1958. Esses movimentos podem afetar Em muitas enzimas, a energia de ligação utilizada para for- apenas uma pequena parte da enzima nas proximidades do mar o complexo ES é apenas um dos vários contribuintes sítio ativo ou podem envolver mudanças no posicionamen- para o mecanismo total de catálise. Uma vez que o subs- to de domínios inteiros da enzima. Em geral, uma rede de trato esteja ligado a uma enzima, grupos funcionais catalí- movimentos acoplados ocorre por toda a enzima, que final- ticos posicionados de modo apropriado ajudam no rompi- mente leva às mudanças necessárias no sítio ativo. O ajuste mento e na formação de ligações por vários mecanismos,  PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 199 incluindo catálise geral acidobásica, catálise covalente e como modelo. Nessas reações não enzimáticas, a transfe- catálise por íons metálicos. Esses mecanismos são diferen- rência de prótons pode envolver apenas constituintes da tes dos mecanismos com base na energia de ligação, pois água ou então de outros doadores ou aceptores fracos de 1 1 geralmente envolvem uma interação transitória covalente próton. Catalisadores que utilizam apenas íons H (H3O ) – com o substrato ou a transferência de um grupo do subs- ou OH presentes na água são chamados de catalisadores trato ou para ele. acidobásicos. Se prótons forem transferidos entre o inter- mediário e a água mais rapidamente do que a quebra do Catálise geral acidobásica. A transferência de prótons é a rea- intermediário em reagentes, o intermediário é estabilizado ção mais comum em bioquímica. No curso da maioria das cada vez que se formar e nenhuma catálise adicional media- reações que ocorrem nas células há transferência de um ou, da por outros aceptores ou doadores de prótons ocorrerá. geralmente, de muitos prótons. Muitas reações bioquímicas Em muitos casos, entretanto, apenas água é insuficiente. O envolvem a formação de intermediários carregados instá- termo catálise geral acidobásica refere-se à transferên- veis que tendem a quebrarem-se rapidamente nas espécies cia de prótons mediada por alguma outra molécula que não reagentes que os constituem, impossibilitando assim a rea- água. Nas reações não catalisadas por enzimas que ocor- ção (Figura 6-8). Intermediários carregados, geralmen- rem em soluções aquosas, a adição de ácidos ou bases for- te, podem ser estabilizados pela transferência de prótons tes proporciona uma aceleração da velocidade observável para os substratos (ou dos substratos) ou intermediários somente se o intermediário instável da reação quebrar-se formando uma espécie que se transforma mais rapidamen- em reagentes com mais rapidez do que a transferência de te em produtos. O efeito da catálise por ácidos ou bases prótons apenas da água (ou transferência de prótons para é geralmente estudado usando reações não enzimáticas formar água). Nessa situação, muitos ácidos orgânicos fra- cos podem suplementar a água como doadores de prótons, ou então bases orgânicas fracas podem servir como acepto- R1 R3 res de prótons. Espécies reagentes H C OH 1 C O No sítio ativo das enzimas, onde moléculas de água tal- : R 2 N H vez não estejam disponíveis como doadoras ou aceptoras de prótons, a catálise acidobásica geral torna-se crucial. Algu- R4 Sem catálise, o intermediário mas cadeias laterais de aminoácidos podem assumir o papel (carregado) instável de agentes doadores e aceptores de prótons (Figura 6-9). quebra-se rapidamente, Esses grupos podem estar posicionados precisamente no R1 R3 formando os reagentes. sítio ativo da enzima de modo a possibilitar a transferência H H C O C O2 de prótons, proporcionando um aumento de velocidade da 2 5 Quando a 1 Quando a transferência ordem de 10 a 10. Esse tipo de catálise ocorre na grande R2 N H transferência de de um próton de ou maioria das enzimas. um próton de ou R4 para H2O for menor do para H2O for mais que a velocidade de OH 2 B: rápida do que a quebra dos H 2OH1 HA velocidade de intermediários, apenas Resíduo de Forma geral ácida Forma geral básica quebra dos parte dos aminoácido (doador de próton) (aceptor de próton) intermediários, a 1 intermediários presença de outro HOH BH formados é estabilizada. doador ou HOH A2 A presença de um Glu, Asp R COOH R COO2 aceptor de próton doador (HA) ou aceptor não aumenta a R1 R3 (B:) alternativo de H : velocidade da prótons aumenta a Lys, Arg R 1N H R NH 2 H C O C O2 H reação. velocidade da reação. R2 H N1 H Cys R SH R S2 4 R R C CH R C CH 1 His HN NH HN N: R1 R3 H H C C H H Produtos H C O C O 1 N R 2 R4 Ser R OH R O2 FIGURA 68 Como o catalisador contorna o incremento de cargas desfavoráveis durante a hidrólise de uma amida. A hidrólise da liga- Tyr R OH R O2 ção amida, mostrada aqui, é a mesma reação catalisada pela quimotripsina e outras proteases. O incremento de cargas é desfavorável e pode ser contor- nado pela doação de um próton por parte de H3O1 (catálise ácida específica) FIGURA 69 Aminoácidos na catálise geral acidobásica. Muitas rea- ou HA (catálise ácida geral), sendo que HA representa qualquer ácido. De ções orgânicas são favorecidas por doadores (ácidos gerais) ou aceptores maneira semelhante, a carga pode ser neutralizada pela subtração de um (bases gerais) de prótons. Os sítios ativos de algumas enzimas têm grupos OH– (catálise básica específica) ou de B: (catálise básica geral), na qual B: re- funcionais de aminoácidos, como os mostrados aqui, que podem participar presenta uma base qualquer. dos processos catalíticos como doadores ou aceptores de prótons. 200 D AV I D L. N E L S O N & M I C H A E L M. COX Catálise covalente.Na catálise covalente há a formação de provém de interações fracas (ligações de hidrogênio e uma ligação covalente transitória entre a enzima e o subs- interações hidrofóbicas e iônicas) entre substrato e en- trato. Considere a hidrólise de uma ligação entre os grupos zima. O sítio ativo das enzimas é estruturado de modo A e B: tal que algumas dessas ligações fracas ocorrem pre- ferencialmente no estado de transição, estabilizando esse estado. A necessidade de interações múltiplas é Na presença de um catalisador covalente (enzima com gru- uma das razões para o grande tamanho das enzimas. A po nucleofílico X:), a reação torna-se energia de ligação, DGB, é usada de diversas maneiras ‡ para diminuir a energia necessária para a ativação, DG. Ela pode ser usada, por exemplo, para diminuir a en- Isso modifica o caminho da reação e resulta em catálise tropia, para a dessolvatação do substrato ou para pro- apenas quando o novo caminho tiver uma energia de ati- vocar uma mudança conformacional na enzima (ajuste vação menor do que a da reação não catalisada. Ambas as induzido). A energia de ligação também é responsável novas etapas devem ser mais rápidas do que a reação não pela extraordinária especificidade das enzimas por seus catalisada. Várias cadeias laterais de aminoácidos, incluindo substratos. as mostradas na Figura 6-9, e grupos funcionais de alguns c Mecanismos catalíticos adicionais utilizados pelas enzi- cofatores de enzimas servem como agentes nucleofílicos mas incluem a catálise geral acidobásica, a catálise co- na formação de ligações covalentes com substratos. Esses valente e a catálise por íons metálicos. A catálise geral- complexos covalentes sempre passam por uma reação adi- mente envolve interações covalentes transitórias entre cional para regenerar a enzima livre. A ligação covalente o substrato e a enzima, ou a transferência de grupo da entre enzima e substrato pode ativar o substrato para uma enzima ou para a enzima, de modo a proporcionar um reação posterior de um modo geralmente específico para caminho novo e com menor energia de ativação para um grupo ou uma coenzima. as reações. Em qualquer dos casos, as enzimas retor- nam ao estado não ligado uma vez que a reação tenha Catálise por íons metálicos. Metais, tanto ligados firmemente se completado. à enzima quanto tomados da solução juntamente com o substrato, podem participar na catálise de várias manei- ras. Interações iônicas entre metais ligados a enzimas e substratos podem ajudar a orientar o substrato para a rea- 6.3 A cinética enzimática como abordagem à ção ou estabilizar estados de transição carregados. Esse compreensão do mecanismo tipo de uso de interações fracas entre metais e substratos Normalmente os bioquímicos utilizam várias abordagens é similar a alguns dos usos da energia de ligação enzima- para estudar o mecanismo de ação de enzimas purificadas. -substrato descritos anteriormente. Os metais também A estrutura tridimensional das proteínas fornece informa- podem ser mediadores de reações de oxidorredução por ções importantes, que são incrementadas pela química de mudanças reversíveis no estado de oxidação do íon me- proteínas e por modernos métodos de mutagênese sítio- tálico. Aproximadamente um terço de todas as enzimas -dirigida (mudança na sequência de aminoácidos de uma conhecidas necessita de um ou mais íons metálicos para a proteína por engenharia genética; ver Figura 9-10). Essas atividade catalítica. tecnologias permitem que os enzimologistas examinem o A maioria das enzimas combina várias estratégias de papel de aminoácidos individualmente na estrutura e na catálise para proporcionar um aumento na velocidade das atividade de uma enzima. Entretanto, a abordagem mais reações. Um bom exemplo é o uso de catálise covalente, antiga para entender o mecanismo das enzimas, e que per- catálise geral acidobásica e estabilização do estado de tran- manece ainda entre as mais importantes, é determinar a sição na reação catalisada pela quimotripsina, apresentada velocidade da reação e como ela se modifica em resposta a em detalhes na Seção 6.4. mudanças nos parâmetros experimentais, disciplina conhe- cida como cinética enzimática. A seguir, será apresenta- RESUMO 6.2 Como as enzimas funcionam da uma breve introdução à cinética das reações catalisadas c As enzimas são catalisadores altamente eficazes, geral- por enzimas. Visões mais avançadas estão disponíveis nas mente aumentando as velocidades de reação por um fa- fontes citadas ao final deste capítulo. 5 17 tor de 10 a 10. c As reações catalisadas por enzimas são caracterizadas A concentração do substrato influi na velocidade das pela formação de um complexo entre o substrato e a en- reações catalisadas por enzimas zima (complexo ES). A ligação ao substrato ocorre em Um fator-chave que afeta a velocidade das reações catali- um bolsão da enzima denominado sítio ativo. sadas por enzimas é a concentração do substrato, [S]. En- c A função das enzimas e dos outros catalisadores é dimi- tretanto, o estudo dos efeitos da concentração do subs- ‡ nuir a energia de ativação, DG , da reação, aumentando, trato é complicado pelo fato de [S] modificar-se durante o assim, a velocidade das reações. O equilíbrio da reação curso de uma reação in vitro à medida que o substrato é não é afetado pela enzima. convertido em produto. Uma abordagem que simplifica os c Uma parte significativa da energia utilizada no aumento experimentos de cinética enzimática é medir a velocida- da velocidade das reações proporcionada por enzimas de inicial, designada como V0 (Figura 6-10). Em uma  PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER 201 Vmáx [S] = 1,0 mM Velocidade inicial, V0 (mM/min) Concentração de produto, [P] 1 2 Vmáx [S] = Km = 0,5 mM [S] = 0,2 mM Km Concentração de substrato, [S] (mM) Tempo FIGURA 611 Efeito da concentração do substrato sobre a velocida- de inicial de uma reação catalisada por enzima. A velocidade máxima, FIGURA 610 Velocidades iniciais de reações catalisadas por enzi- Vmáx, é extrapolada a partir de gráficos como este, pois a V0 aproxima-se, mas mas. Uma enzima teórica catalisa a reação S P. A enzima está presente nunca atinge a Vmáx. A concentração do substrato na qual V0 é metade da em uma concentração suficiente para catalisar a reação a uma velocidade Vmáx é o Km, a constante de Michaelis. A concentração da enzima em expe- máxima, Vmáx, de 1 mM/min. A constante de Michaelis, Km (explicada no texto), rimentos como este geralmente é tão baixa que [S] W [E], mesmo quando é 0,5 mM. Estão mostradas as curvas de progressão da reação para as concen- [S] é descrita como baixa ou relativamente baixa. As unidades usadas neste trações abaixo, exatamente no Km e acima dele. A velocidade de uma reação gráfico são unidades típicas para reações não catalisadas e apenas ajudam a catalisada por uma enzima diminui à medida que o substrato é convertido ilustrar o significado de V0 e [S]. (Observe que a curva descreve parte de uma em produto. A tangente de cada curva, no tempo zero, define a velocidade hipérbole retangular com uma das assíntotas em Vmáx. Caso a curva continu- inicial, V0, de cada uma das reações. asse abaixo de [S] 5 0, ela se aproximaria da assíntota vertical em [S] 5 –Km.) reação típica, a enzima pode estar presente em quanti- Então, o complexo ES é rompido em uma segunda etapa dades nanomolares, enquanto [S] pode estar em uma mais lenta, fornecendo a enzima livre e o produto P: ordem de magnitude cinco ou seis vezes maior. Se ape- nas o início da reação for monitorado (frequentemente (6-8) os primeiros 60 segundos, ou menos), a mudança em [S] pode estar limitada a alguns poucos pontos percentuais e Uma vez que a segunda reação, por ser mais lenta (Equação [S] pode ser considerada co