Il DNA: struttura, funzione e replicazione PDF

Il DNA: struttura, funzione, replicazione © David S. Goodsell 2005 Il DNA: struttura, funzione e replicazione Tutti gli organismi dipendono dalle capacità delle loro cellule di conservare, ricuperare e utilizzare l’istruzioni per produrre gli elementi che li conforma...

Il DNA: struttura, funzione, replicazione © David S. Goodsell 2005 Il DNA: struttura, funzione e replicazione Tutti gli organismi dipendono dalle capacità delle loro cellule di conservare, ricuperare e utilizzare l’istruzioni per produrre gli elementi che li conformano. Tutte le specie dipendono dalle capacità degli individui di trasmettere queste istruzioni da una generazione alla seguente. Al inizio del secolo XX nasce la Genetica, per studiare i geni: le unità che contengono queste informazioni per la costruzione degli elementi che formano cellule e organismi. Negli anni ‘40 si fanno due grandi passi avanti: - si scopre che il materiale genetico è fatto di DNA; - e che il DNA contiene l’informazione per fare le proteine, le molecole che svolgono la maggior parte delle funzioni cellulari. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Nei primi ‘900 si pensava che l’informazione genetica fosse codificata dalle proteine. Questa visione è cambiata grazie a sperimenti chiave. Sperimenti di Griffith (1928): i batteri letali S (smooth, dotati da capsula polisacaridica di protezione) contengono qualcosa che trasforma un ceppo innocuo R (rough, senza capsula) in uno mortale: materiale genetico capace di trasformare i batteri. Colture batteriche risultanti dal sangue dei topi infettati con ogni ceppo Il DNA: struttura, funzione e replicazione Sperimenti di Avery e colleghi (1944): la purificazione dei diversi componenti dimostra che il DNA è il ‘principio trasformante’. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Gli scienziati hanno capito presto (anni ‘20) che i geni erano nei cromosomi, ma questi, chimicamente, erano fatti da DNA e proteina. Dopo diversi studi, si conferma che la molecola che trasmette le informazioni genetiche è il DNA: esperimento del “frullatore”, Hershey & Chase, 1952 Ma il DNA è una molecola chimicamente molto semplice… BASE AZOTATA NUCLEOTIDE Erwin Chargaff nel 1950: Il DNA di cellule diverse della stessa specie mostra le stesse % di ognuna delle 4 basi Ci sono differenze in % tra diverse specie Le regole di Chargaff: ✓ La quantità di A è uguale alla quantità di T (A=T) ✓ La quantità di G è uguale alla quantità di C (G=C) ✓ Quantità purine = quantità pirimidine (A+G=T+C) Il DNA: struttura, funzione e replicazione Allora come può il DNA portare tantissima informazione? Scoperta della struttura del DNA Il passo fondamentale per la biologia molecolare avviene nel 1953 con la scoperta della struttura del DNA, grazie agli studi di James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins: capire la struttura del DNA ha reso possibile decifrare il suo funzionamento. Premio Nobel 1962 Il vero ruolo di Rosalind Franklin nella scoperta della struttura del DNA: https://www.nature.com/articles/d41586-023-01313-5 Il DNA: struttura, funzione e replicazione LA STRUTTURA DEL DNA L’acido deossiribonucleico (ADN o DNA) è fatto da quattro nucleotidi, fatti da deossiribosio, fosfato e una base azotata: Purinica: A - adenina G - guanina Pirimidinica: T: timina C: citosina che formano lunghe catene di polinucleotidi (catene o filamenti del DNA) legandosi covalentemente (legame fosfodiestere). La struttura (e le funzioni) del DNA si basa in quattro aspetti: - la molecola è una doppia elica destrorsa; - l’elica è antiparallela; - le catene di zuccheri e fosfato formano lo scheletro al esterno e le basi azotate stanno al interno; - le basi si appaiano verso l’interno in maniera specifica: una base purinica e una pirimidinica. E’ l’appaiamento di basi complementari (base pairing). Queste regole: - Permettono lo stato di minima energia: le distanze fra i filamenti di DNA e fra le basi sono costanti, ogni 10 paia di basi l’elica fa un giro. - Sono fondamentali per la replicazione e la trascrizione del DNA. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Il DNA: struttura, funzione e replicazione Solco secondario o minore Solco principale o maggiore 1 giro 10 bp 1 bp 3,4nm 0,34nm Bianco: H Rosso: O Giallo: P Azurro: N Il DNA: struttura, funzione e replicazione DNA_structure Il DNA: struttura, funzione e replicazione LA REPLICAZIONE DEL DNA Il DNA si può replicare a 1000 nucleotidi per secondo (nei batteri): la replicazione deve essere efficiente ma pure precisa. Gli errori causano mutazioni, in gran parte dannose, anche se allo stesso tempo sono la base della variabilità e l’evoluzione. Il meccanismo di replicazione del DNA si basa sulla natura complementare delle due catene che fanno la doppia elica: ogni filamento di DNA fa di stampo per fare una nuova catena. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Possibili modelli teorici di replicazione del DNA molecola prima parentale generazione (F1) semiconservativa conservativa dispersiva In grigio il filamento di DNA parentale In blu il filamento di DNA neosintetizzato Il DNA: struttura, funzione e replicazione Sperimento di Meselson e Stahl (1958) Il DNA: struttura, funzione e replicazione La replicazione del DNA è semiconservativa: le doppie eliche ‘figlie’ contengono ognuna una catena della doppia elica parentale. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Risultato della replicazione semiconservativa dopo tre eventi di replicazione: Il DNA: struttura, funzione e replicazione La doppia elica di DNA è molto stabile, per separare le due catene in laboratorio bisogna riscaldare quasi a 100oC, ma per la replicazione bisogna separarle: le proteine iniziatrici della replicazione separano le catene in punti specifici, ricchi in A=T, chiamati origini de replicazione. I batteri hanno uno, Origine di replicazione le cellule umane ˜10.000, per accelerare la replicazione del genoma: in 8 ore si ‘scrivono’ 1000 La doppia elica si apre libri grossi (con solo uno o grazie alle proteine due errori, al massimo!). iniziatrici della replicazione Stampi di DNA a singola catena pronti per la sintesi di DNA Il DNA: struttura, funzione e replicazione La doppia elica per essere copiata deve essere srotolata. Jonh Cairns (1963) dimostrò che lo srotolamento ha inizio in un punto del cromosoma circolare batterico: origine di replicazione. Utilizzò isotopi radioattivi e la tecnica dell’autoradiografia. Il DNA: struttura, funzione e replicazione L’autoradiografia ha anche dimostrato la direzione di sintesi una volta iniziata la replicazione: si è visto che il segnale radioattivo si concentra in due punti, corrispondenti alle due forche (o forcelle) di replicazione che avanzano in direzioni opposte. Il DNA: struttura, funzione e replicazione PROCARIOTI EUCARIOTI 1 sola origine di replicazione Origini di replicazione multiple, da 10.000-100.000 per genoma Il DNA: struttura, funzione e replicazione Il DNA: struttura, funzione e replicazione Dopo la separazione del DNA nei punti d’origine di replicazione, subentra la macchina replicativa, che avanza lungo la catena parentale di DNA e separa i filamenti parentali man mano che sintetizza i nuovi filamenti di DNA nelle due forche replicative. I due filamenti si separano rompendo i legami a idrogeno tra le basi azotate, per Macchina azione dell’enzima elicasi, con consumo replicativa di energia da ATP. L’azione enzimatica permette la rottura dei legami a idrogeno senza aumento di temperatura. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Problema: Le forche di replicazione si muovono alla velocità di 166 giri/secondo (despiralizzazione della doppia elica nella forcella), provocando un movimento di torsione della molecola di DNA (lunga e relativamente immobile) e quindi il suo super- avvolgimento (tensione torsionale). Il DNA: struttura, funzione e replicazione Soluzione: La topoisomerasi (o girasi): cambia la topologia del DNA, producendo una rottura transitoria di un filamento; dopo aver rilassato la torsione, risalda il filamento. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Al cuore della macchina replicativa si trova la DNA polimerasi, che catalizza l’addizione di nucleotidi alla nuova catena di DNA, copiando quella parentale. Nei batteri la polimerasi polimerizza nuovo DNA a 1000 nucleotidi per secondo, nei uomini a 100 per secondo. Procarioti: DNA pol I, II e III Eucarioti: DNA pol α, , γ, δ, ε Il DNA: struttura, funzione e replicazione La DNA polimerasi non è in grado di cominciare la sintesi di DNA da zero, ha bisogno di una estremità 3’ dove aggiungere il prossimo nucleotide: la sintesi del nuovo filamento comincia con un piccolo tratto di RNA (innesco o primer, ˜10 nucleotidi) fatto da un altro enzima: una RNA polimerasi chiamata primasi, che può cominciare da zero. L’RNA è molto simile al DNA e si lega pure in modo complementare, anche se usando U (uracile) in vece di T, quindi A-U e C-G. Il DNA: struttura, funzione e replicazione Ogni nuovo nucleotide arriva come nucleotide trifosfato, carico di energia per formare il nuovo legame fosfodiestere con la catena in sintesi. Questa energia viene fornita dalla scissione del gruppo pirofosfato (P-P). Il DNA: struttura, funzione e replicazione Nella forcella replicativa c’e un problema d’orientamento: Il DNA si sintetizza soltanto in direzione 5’ 3’ , la DNA polimerasi può solo catalizzare l’aggiunta di nucleotidi in questa direzione a causa della diversa natura chimica delle due estremità. Quindi uno dei due nuovi filamenti va bene, ma come si fa l’altro? ? Il filamento lento, che si allunga verso l’estremità 5’, si fa a pezzi: i frammenti di Okazaki, che dopo si devono legare tra di se per fare una catena continua. Frammenti di Okazaki Filamento lento Filamento guida Filamento lento Filamento guida Per ché questo meccanismo così laborioso? Perché la DNA polimerasi possiede due attività enzimatiche: - Una attività polimerasica in direzione 5’ a 3’ , che fa errori solo una volta ogni 10.000 paia di basi: lega quasi sempre la base che appaia correttamente con il filamento stampo. - Una attività di autocorrezione (proofreading) nella direzione 3’ a 5’, che è possibile solo in questa direzione, e aumenta ancora di più la fedeltà della replicazione (1 errore ogni 107 basi). Il DNA: struttura, funzione e replicazione La struttura della DNA polimerasi assomiglia ad una mano destra parzialmente chiusa, nella quale si colloca il complesso stampo-innesco. Il palmo è costituito da un foglietto beta, contiene il sito catalitico e controlla la correttezza dell’appaiamento delle basi. Il DNA: struttura, funzione e replicazione L’incorporazione del nucleotide corretto è 104 volte più rapida Come funziona l’autocorrezione? Questo meccanismo spiega perché la sintesi può avvenire solo in direzione 5’ verso 3’ (aggiunta di nuovo nucleotide all’estremità 3’) Il DNA: struttura, funzione e replicazione DNA_polymerase Il DNA: struttura, funzione e replicazione La sintesi dei frammenti di Okazaki (100-1000 nucleotidi) inizia dall’innesco RNA Partendo dall’innesco, la DNA polimerasi sintetizza il frammento fino a quello precedente Dopo che la DNA polimerasi ha fatto il suo lavoro, subentrano: - Una nucleasi, che elimina l’innesco di RNA - Una DNA polimerasi riparativa, che parte dal frammento di Okazaki per sintetizzare DNA nello spazio dove c’era l’innesco RNA - Una DNA ligasi, che lega i pezzi di DNA creando il legame covalente mancante Il DNA: struttura, funzione e replicazione La replicazione avviene grazie a una macchina replicativa composta da tante proteine che lavorano insieme. Morsetto scorrevole DNA polimerasi (filamento guida) DNA elicasi RNA primasi Il nuovo frammento di Okazaki comincia qui Proteine che legano DNA a singolo filamento DNA polimerasi (filamento lento) finendo un frammento di Okazaki Il DNA: struttura, funzione e replicazione In realtà si pensa che il filamento lento si ripiega ad ansa, per facilitare l’interazione di tutti i componenti della macchina replicativa nelle due catene. Il DNA: struttura, funzione e replicazione DNA_replication_fork