Cuestionario de Preguntas y Respuestas 2024 PDF

SESIÓN 1 Pregunta 1 ¿Qué información de las células se puede obtener usando citometría de flujo? Por medio de la citometría de flujo se puede obtener información de células que van desde los monocitos (15 micras) hasta las bacterias (0,5 micras). A partir de un citómetro de flujo se puede recopil...

SESIÓN 1 Pregunta 1 ¿Qué información de las células se puede obtener usando citometría de flujo? Por medio de la citometría de flujo se puede obtener información de células que van desde los monocitos (15 micras) hasta las bacterias (0,5 micras). A partir de un citómetro de flujo se puede recopilar información referente al tamaño, por medio de la difracción de la luz hacia adelante (cuanto más abierta, más tamaño celular es reconocido), y la complejidad o granulosidad interna, basada en la dispersión de luz lateral que es capaz de aportar información respecto a la composición interna celular. Asociando las dos metodologías anteriores, se puede reconocer en diferentes secciones de la muestra donde no hay componentes no celulares, que pueden ser posiblemente debris u otros eventos. Por otra parte, aplicando fluorescencia se puede estudiar el volumen celular y realizar un recuento de las mismas. Pregunta 2 ¿Cuáles son los cuatro tipos de sistemas que tiene un citómetro de flujo? Los cuatro sistemas de citometría de flujo son: Fluídico: las células que se encuentran sin formar agrupaciones y en suspensión, mediante un flujo laminar se llevan al paso de un rayo lumínico para ser expuestas y analizadas. Óptico: se trata de un tipo de láser y de una combinación de espejos, filtros y cristales que permiten llevar la señal hasta una serie de receptores fotomultiplicadores. 2 Informático: se trata del análisis de un sistema informático adquiriendo datos de este. Electrónico: se encarga de la conversión a valores digitales, además amplifica PMTs. Pregunta 3 ¿Qué fuente de luz es la más usada en los citómetros de flujo? La fuente de luz que más se emplea son los láseres. Podemos trabajar con uno solo a una determinada longitud de onda, pero en la actualidad se suelen combinar varios con diferentes longitudes de onda dentro de los que destacan los siguientes: - Láser azul argón de 488 nm - Láser de ultravioleta (UV) de 365 nm - Láser rojo de 633 nm También suele ser frecuente trabajar con láseres violetas, amarillos, verdes, entre otros. Pregunta 4 ¿Por qué es importante conocer la fuente excitadora de luz que tiene un citómetro? Es importante conocer la fuente excitadora ya que cada citómetro tiene una fuente diferente como lámparas de arco, LED o láser, y dependiendo de la fuente excitadora, la emisión será variable. De manera que si excitamos la muestra con un láser de luz de una cierta longitud de onda, la emisión de la muestra será una longitud de onda de mayor longitud que la emitida. 3 Pregunta 5 Indique las dos principales características en las que se basa un citómetro de flujo para evaluar los parámetros (características de las células) A la hora de analizar los distintos parámetros de una célula, la citometría de flujo se basa principalmente en dos características celulares: el tamaño de la célula y su complejidad o granulosidad interna. Pregunta 6 Señale los dos tipos de dispersión de luz que detecta el citómetro y con cuáles características celulares se relacionan. El citómetro es capaz de detectar dos tipos de dispersiones de la luz diferentes, en función de la acción celular, como son la dispersión frontal, o FSC, y la dispersión lateral, o SSC. La dispersión frontal es producida por efecto de la membrana celular y aporta una información respecto al tamaño de la célula, mientras que la dispersión lateral se produce por las membranas internas. Cuantas más membranas internas presente la célula, se podrá observar una mayor dispersión lateral. Pregunta 7 Mencione algunas ventajas del análisis por medio de citometría de flujo Las principales ventajas que se dan en el análisis por medio de citometría de flujo son: -Posee un rápido procesamiento de las muestras, llegando a poder procesar 2000 células por segundo. -Puede realizar un estudio de subpoblación celular basándose en diferentes características y de ese modo poder aislar células individuales. 4  -Posee un alto poder estadístico. -Se puede utilizar para detectar células diferentes, por ejemplo el caso de células tumorales. -Se puede realizar análisis multiparamétricos. Pregunta 8 ¿Por qué es importante la calibración de un citómetro de flujo? Es necesario un procedimiento de control de calidad para comprobar el adecuado funcionamiento del equipo y de esta manera poder obtener resultados de calidad y de la mayor precisión posible. Además es importante debido a la compensación de las fluorescencias presentes en las muestras biológicas ya que debido a que las microesferas plásticas de calibración y que las células tienen propiedades ópticas diferentes, deben visualizarse previamente las características de desviación de luz y fluorescencia. De esta manera se puede ajustar y optimizar el equipo para una adecuada lectura. Pregunta 9 ¿Qué es la compensación en citometría? La compensación en citometría es el proceso por el cual se elimina la sobreposición de los fluorocromos y de esta manera, evitar que un detector capte la señal de un fluorocromo de una longitud de onda que no le corresponde. La compensación es muy importante para obtener datos confiables de las muestras analizadas, por lo que se han diseñado programas de computación que permiten realizar este proceso, en forma manual, o completamente 5 automática y con la opción de una compensación de los datos posterior a la adquisición. Pregunta 10 Contestar falso o verdadero: 1) Verdadero → Es necesario para que el sistema sea capaz de transportar y alinear las células dentro de una cámara en la cual incide un haz de luz para analizarlas. 2) Falso → La muestra pasa a través del haz de luz de forma individual. 3) Verdadero → Tiene la capacidad de proporcionar información de cada célula individualmente. 4) Verdadero → Es capaz de medir simultáneamente diferentes parámetros celulares como el tamaño y la forma al igual que cualquier componente celular o función. 5) Verdadero → Permite identificar poblaciones de células distintas aunque se encuentren en concentraciones muy bajas. 6 SESIÓN 2 Pregunta 11 ¿Qué es la compensación? La compensación es el proceso matemático por el cual se elimina la superposición entre fluorocromos, es muy importante para obtener datos confiables de las muestras analizadas por lo que se han diseñado programas de computación que permiten realizar este proceso en forma manual o completamente automática. Pregunta 12 ¿Cuál es la función de las microesferas plásticas? La función que realizan las microesferas plásticas es la determinación celular, es decir, la concentración y el tamaño de las células. Estas microesferas pueden estar marcadas por fluorocromos. Además estas microesferas se utilizan para la calibración de citocromo y para seguir la función de este. 7 Pregunta 13 Indique en qué consiste la separación de células o “cell sorting” por citometría de flujo. Explique cuál es el fundamento básico para llevar a cabo la separación de células Este proceso se basa en la separación de células mediante un campo magnético aplicado a un flujo de gotas cargado eléctricamente de forma que la corriente de líquido inicial es separado en gotas mediante vibración, pudiendo encontrar una célula en cada una de las gotas formadas. Esas células pasan a través del láser antes de la aparición de las gotas lo que permite que éstas puedan ser marcadas mediante carga eléctrica para su posterior clasificación. Pregunta 14 En los siguientes esquemas, indique cuál control de compensación debe mover para ajustar la señal en cada inciso y señale con una flecha si la resta debe incrementarse (↑) o disminuirse (↓), en el cuadro correspondiente. En un principio, evaluando las disposiciones de cada uno de los controles se puede deducir que tanto el control A como el control B no están bien compensados debido a que no se encuentran en el mismo rango de señalización que el control positivo (figura gris). Por lo tanto, para compensar el desajuste en ambos casos se debería disminuir la señal (↓). Mientras que el control C se podría considerar compensado debido a que la señal se encuentra dentro del rango control. 8 Pregunta 15 El siguiente histograma muestra el contenido de ADN característico de cada fase del ciclo celular. Indique qué fase del ciclo celular representa cada pico y explique el significado biológico de la superposición de las células que inician la fase S con las células que están en G1, así como la superposición de células al final de la fase S con las células que están en G2. Teniendo en cuenta, que el histograma representa el contenido de ADN característico de cada fase celular; el primer pico se corresponde con la fase S (donde se lleva a cabo la duplicación del ADN y, por eso, presenta el pico más elevado), mientras que el segundo pico se corresponde con la fase G2 donde el ADN empieza a condensarse y la célula se prepara para duplicarse. La fase G1 vendría representada al inicio del primer pico, pero es enmascarada de manera natural por la duplicación de ADN producida en la fase S. A lo largo del ciclo celular, se pueden producir diferentes superposiciones debido a que cada célula presenta un ritmo diferente y único. Dentro de este histograma, se pueden reconocer, debido a la gran diferencia de altura, que en el primer pico se produce la primera superposición de células donde unas están pasando de la fase G1 al inicio de la fase S, donde el ADN se está duplicando de manera constante. Y, en el segundo pico, se podría reconocer la superposición de las células que pasan de la fase S a la G2, donde queda un residuo celular que sigue duplicándose. De manera normal, se hubiesen observado picos correspondientes a las fases G1 y G2 porque presentan una mínima cantidad de ADN (aunque la segunda 9 habría sido más marcada que la primera), pero se debe de tener en cuenta que el marcaje de cada pico está influenciado por la amplitud de la fase S. Pregunta 16 Mencione los factores implicados en la eficiencia de la separación de células (sorting). Existen diferentes factores implicados en la separación de células dependiendo del método usado: En cuanto a la deflexión electrostática se deben pasar gotas por placas cargadas que las dirigen a los tubos de recuperación. La ventaja principal es la alta viabilidad de las células separadas y la principal desventaja es el uso complejo de equipos grandes. De manera que en cuanto a la mecánica o hidráulica se hace uso de un tubo de captura colocado sobre la celda. Cuando se selecciona una célula, el tubo se activa y se coloca sobre la corriente de la muestra, para desviar a la célula a los tubos de recuperación. La principal ventaja es el uso fácil de este método y la desventaja es la baja concentración celular, debido a que el tubo de captura desvía fluido envolvente mientras espera a la célula seleccionada para separación. Pregunta 17 En la siguiente tabla, haga una lista de moléculas intercalantes de los ácidos nucleicos y mencione las ventajas y desventajas de cada uno de ellos. Molécula Intercalante Ventajas Desventajas Es uno de los más Produce mutagénesis y utilizados en la residuos Bromuro de etidio contaminantes que 10  tinción de ADN, por son complicados de su gran calidad. manejar para las Esta sustancia personas que reacciona a la luz trabajan diariamente ultravioleta con este producto. emitiendo una luz roja-anaranjada, y a su vez esta señal se amplifica 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN. Ayuda en la Es tóxico y cancerígeno, permeabilización de así que su uso la membrana. continuado es 7-amino actimicina D (7- Además es un peligroso AAD) intercalante del ADN. Se utiliza para amplificar La principal desventaja SYBR Green la secuencia de ADN es que produce bicatenario de señales de falsos forma sencilla, positivos, puesto que puesto que se une este colorante se fácilmente. une a ADN Con este colorante no bicatenario muy se necesita sondas si fácilmente, por lo sus primers están que se puede unir a bien diseñados y se ADN bicatenario ha caracterizado inespecífico que no bien la reacción. sea necesario. Esto permite evitar un gasto en el funcionamiento y la configuración del ensayo. 11 Pregunta 18 Defina brevemente, qué es el coeficiente de variación. Explique cuál es el significado biológico del coeficiente de variación. El coeficiente de variación es un parámetro estadístico que representa la relación entre la desviación típica de una muestra y su media dando como resultado el valor de la variabilidad en porcentaje. Su significado biológico está relacionado con que el coeficiente de variación y es independiente de la unidad de medida permitiendo comparar poblaciones muy diferentes entre sí fácilmente. Pregunta 19 Indique la relación existente entre la tasa de proliferación celular, el contenido de ADN y la progresión del ciclo celular. El ciclo celular se divide en: >Interfase: G1 o síntesis de ARN y proteínas, fase S o de síntesis de ADN, G2 con crecimiento celular, síntesis proteica y preparación para la división. > Fase M, mitosis y citocinesis Pero, dependiendo del tipo celular se encontrarán diferencias significativas en la actividad y la proliferación. La proliferación celular comprende al proceso que permite que una célula crezca y se divida para que partiendo de una célula madre, se obtengan dos células hijas. Ahora bien, durante el transcurso de la interfase aumenta el contenido de material genético celular. De modo que una elevada proliferación celular se asocia directamente con una gran velocidad de la progresión del ciclo celular y con ello, un incremento en el contenido de ADN, es decir, la densidad celular. Así se puede establecer una relación directa entre estos 3 conceptos. 12 Pregunta 20 ¿Cómo se puede determinar la viabilidad celular en un cultivo? (Con citometría y sin citometría de flujo) La viabilidad celular se puede definir o describir atendiendo a distintos criterios como la integridad de la membrana celular o la actividad metabólica. Para ello, podemos usar diversos modos de análisis para determinarla usando bien colorantes, bien fluorocromos, principalmente basados en el estado de la membrana. Si la citometría de flujo no está implicada, usaremos colorantes, de los que destacaremos el Azul Tripán que sólamente penetra en las células con daños en la membrana. Para ello, debe añadirse el colorante a una suspensión de muestra y una vez mezclado, debe introducirse en una cámara de Neubauer. A continuación habría que contar tanto las células viables, que serían aquellas que no tienen coloración interna, como las células totales en todos los cuadrantes. Así finalmente se podrá calcular el porcentaje de viabilidad celular, el problema es que de este modo se sobrestima la viabilidad celular ya que no no afecta a las células en proceso apoptótico. En contraposición, en caso de emplear la citometría de flujo, se usarían fluorocromos. Se puede usar sólamente uno o se puede hacer una análisis simultáneo de varios para hacer una discriminación celular de mayor precisión. Así para la tinción de células muertas es común usar yoduro de propidio (IP) o 7AAD, que tienen la capacidad de intercalarse en el ADN de las células muertas tras penetrar por los poros. Mientras que para la tinción de células vivas se usa principalmente diacetato de fluoresceína (FDA), que tiene capacidad de difundir y es metabolizado en caso de que la célula sea viable. Una vez aplicados los fluorocromos, se procede al análisis con el citómetro y se determina qué subpoblación es la correspondiente a las células viables. Será aquella positiva para FDA y negativa para IP. 13 Pregunta 21 ¿Cuál es la diferencia entre los colorantes de exclusión y los colorantes de retención? Los colorantes de exclusión tiñen los ácidos nucleicos de las células con membranas deterioradas y los de retención generalmente utilizan sustratos fluorescentes que son degradados por las enzimas intracelulares y que generan productos fluorescentes. Pregunta 22 Explique el fundamento de la técnica de tinción celular con yoduro de propidio y 7-AAD. El fundamento de la técnica de tinción celular con yoduro de propidio y 7-AAD se basa en reconocer la viabilidad celular utilizando ambos fluorocromos. El yoduro de propidio es un colorante que tiñe muy bien a las células no viables, y que es muy utilizado en la técnica. Por otro lado 7-AAD facilita el uso del marcador. Después con el citómetro de flujo se pueden localizar el conjunto de ADN de las células muertas Pregunta 23 Explique cuál es el fundamento de la inmunotipificación de subpoblaciones celulares por citometría de flujo. Esta técnica se caracteriza por basarse en la reacción antígeno-anticuerpo de forma que, se utilizan anticuerpos capaces de identificar las células de interés de las distintas poblaciones heterogéneas celulares mediante la detección de antígenos determinados expresados por esas células. Dichos antígenos suelen ser proteínas funcionales de membrana que actúan en la comunicación celular, la adhesión. 14 Pregunta 24 Investigue qué otros métodos, diferentes de la citometría de flujo, existen para cuantificar ADN. ¿Cuál es la ventaja de la citometría de flujo frente a esas técnicas? Encontramos diversas técnicas que nos permiten la cuantificación de ADN, entre las que se encuentran por ejemplo la determinación mediante análisis espectrofotométrico. Este equipo puede determinar tanto la concentración media como su pureza de ADN en este caso, basándose en el patrón específico de absorción de luz UV de nuestro ácido nucleico de interés. La concentración se determina de acuerdo con el valor de absorbancia obtenido a 260 nm y usando la ley de Lambert-Beer y el coeficiente de extinción molar promedio para el ADN. Otra opción podría ser el análisis con etiquetado con un colorante fluorescente para la realización de una PCR cuantitativa. En este lo que se hace es añadir un fluorocromo específico para que se una a la muestra de ADN. De manera que fluorescen selectivamente cuando se encuentran unidos. Se trata de un método bastante sensible que mejora esa característica frente al análisis espectrofotométrico. Para poder llevarse a cabo es necesario un termociclador un tanto especial ya que debe debe emitir y absorber luz a una cierta longitud de onda. Sin embargo, la citometría de flujo es un método analítico bastante ventajoso frente a otros métodos que también trabajan con fluorocromos por los siguientes hechos. Ofrece resultados objetivos, elevada sensibilidad, además de una gran velocidad de análisis. A ello se le sumaría la posibilidad de trabajar con células vivas, hecho totalmente incompatible en los otros procedimientos. 15