Tema 4A. Cuantificación de Parámetros y Ciclo Celular PDF

**TEMA 4A. CUANTIFICACIÓN DE PARÁMETROS Y CICLO CELULAR** **NÚMERO Y TAMAÑO DE CÉLULAS** **Contadores de células automáticos mediante:** - [Imagen directa] análogos al sistema de recuento manual en cámaras de Neubauer (recuento celular automático de imagen por tinción vital con azul tri...

**TEMA 4A. CUANTIFICACIÓN DE PARÁMETROS Y CICLO CELULAR** **NÚMERO Y TAMAÑO DE CÉLULAS** **Contadores de células automáticos mediante:** - [Imagen directa] análogos al sistema de recuento manual en cámaras de Neubauer (recuento celular automático de imagen por tinción vital con azul tripán) - [Resistencia eléctrica] (Electrical Sensing Zone (ESZ) method) - - - - [Citometría de flujo:] recuento y clasificación de células según sus características morfológicas (biomarcadores) - - - - - - - - [Citometría sorter (sorting)] - - Inconveniente: al trabajar con multifluorescencia, los espectros de emisión pueden solaparse. - Solución: compensación (calcula y elimina la fluorescencia recogida en otros canales). En equipos actuales se realiza automáticamente. - - - - **Fluorocromos** - Los fluorocromos son moléculas que absorben radiación UV y liberan parte de la energía en forma de longitud de onda más larga (luz visible), provocando destellos contra un fondo oscuro. - Se pueden usar para comprobar la difusión y movimiento a través de membranas celulares, sondas para determinar cantidad de un soluto/ion, estudios de hibridación ADN-ARN, unión a proteínas e inmunoglobulinas, etc. - Uso de filtros para captar la luz emitida. - Especificidad, elevado contraste y versatilidad **Tipos fluorocromos** Grupo funcional que absorbe energía a una longitud de onda específica y la vuelve a emitir a una longitud de onda mayor (con menos energía) - FITC: isotiocianato de fluoresceína - PE: ficoeritrina - APC: allophycocyanin (equivalente PE-Cy5; tándem fluorochrome) - PercP: Peridinin Chlorophyll Protein Complex - Más fotoestables: Alexa fluor, DyLight fluor, Brilliant Violet (BV) **ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO Y TASA DE SÍNTESIS DE ADN Y PROTEÍNAS** **Contenido de ADN** Puede cuantificarse mediante - [Técnicas de fluorescencia:] fluorímetro, microscopio de fluorescencia, citómetro - Colorantes más utilizados: DAPI, PicoGreen, Hoechst 33258 - Límite de sensibilidad: 10ng/ml - Requieren la presencia de DNA de doble cadena intacto - [Espectrofotómetro o Nanodrop]: absorbancia a 260 nm - Una unidad de absorbancia (A) = 1.0 corresponde a una concentración de 50 μg/ml para el ADN bicatenario (dsADN), 33 μg/ml para el ADN monocatenario y a 40 μg/ml para el ARN monocatenario (ley de Beer-Lambert: empírica, la absorbancia de una muestra a una λ (nm) depende de la cantidad y propiedades del material absorbente). - Inconveniente: interferencia con otros componentes celulares, método útil únicamente con ADN purificado. La relación de la absorbancia a 260 (nos permite saber el ADN bicatenario) y 280nm (permite saber si hay \[ \] de proteína) (A260/280) se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. - Relación más baja de 1,8 tenemos una mayor cantidad de lo que estamos midiendo a 280, es decir tenemos contaminación por proteína - Relación más de 2 alta \[ \] de ARN **Contenido de proteínas** Para estimar el contenido celular o constituyentes totales de las células → normalizar los resultados de experimentos - Espectrofotómetro o Nanodrop: absorbancia a 280 nm - Se considera que 1mg/ml de proteína tienen OD = 1.0 (ley de Beer-Lambert) - Mínima interferencia de ácidos nucleicos u otros constituyentes celulares - Suele utilizarse con \> 100mg de proteína o para más de 2x105 células - Ensayos colorimétricos - Más sensibles - Se basan en utilizar un producto que absorbe a una determinada λ al reaccionar con las proteínas presentes en una solución - Requieren generar una curva patrón (con distintas concentraciones estándar) para inferir la concentración de proteína de una solución problema - El más habitual es la reacción de Bradford (contiene azul Coomasie) **Tasa de síntesis de ADN** Se utiliza como una medida de estimación de la tasa de proliferación celular. Mediante adición de nucleósidos con radioisótopos al medio de cultivo de las células en crecimiento durante un tiempo determinado (entre 30 min y 24h) - Ej: timidina tritiada (Timidina3H o \[ 3H\]-TdR) y la desoxicitidina 3H - Actúan como precursores y se incorporan a las cadenas en síntesis - La radiactividad incorporada al cultivo celular se mide en contadores de centelleo (Scintillation Counters: phosphoroimagers) obteniéndose una medida de estimación de la tasa de síntesis de ADN. Mediante **citometría de flujo o inmunocitoquímica**: - Bromo-deoxy-uridina (BrdU) y anticuerpos contra este análogo de la timidina. - Incorporación a cadenas en síntesis - Es necesario un paso de desnaturalización de la doble hélice de ADN Mediante **inmunocitoquímica o citometría de flujo**: - Etinil-deoxy-uridina (EdU): alternativa superior a BrdU alternativa superior a BrdU (va a permitir evitar este paso que puede ser perjudicial para mantener otras señales) - Las células que crecen en presencia de EdU lo incorporan a las bases de timidina durante la fase S - Azida marcada con un fluoróforo reacciona con EdU para permitir su detección **Tasa síntesis de proteínas** Mediciones secuenciales a lo largo de un tiempo pueden utilizarse para medir la acumulación (síntesis) o pérdida (degradación) neta de proteína - Incubar las células con aminoácidos marcados radiactivamente: - Ej: leucina tritiada (Leu 3H) o metionina 35S a mayor reactividad, mayor leucina tritiada, más síntesis de proteínas - Medir en un contador de centelleo la cantidad de radiactividad incorporada por cada 106 células o por miligramo de proteína durante un periodo de tiempo establecido **PROLIFERACIÓN CELULAR: CURVAS CRECIMIENTO. MIGRACIÓN CELULAR** **Proliferación celular** - Proceso que produce un aumento del número de células Es definida por el equilibrio entre las divisiones celulares y la pérdida de células por muerte o diferenciación celular **Aplicaciones** - Monitorizar el cultivo - Determinar el mejor momento para llevar a cabo un subcultivo o tratamiento - Determinar la eficiencia del subcultivo - Determinar el efecto de diferentes medios o sueros - Evaluar la salud celular, citotoxicidad, y eficacia de fármacos **Técnicas para determinar la tasa de proliferación celular** - Determinación de la curva de crecimiento por recuento de células (cinética de crecimiento) - Marcaje de la síntesis de ADN - Determinación de fases o proteínas del ciclo celular - La determinación de células viables - Eficiencia del plaqueado o clonación - Tinción con colorantes vitales - Medición de ATP mitocondrial **Tinción con colorantes vitales** - Permite continuar manteniendo en cultivo a las células - Marcadores que pueden cruzar la membrana plasmática y unirse covalentemente a estructuras intracelulares sin causar cambios en su morfología o fisiología. - Tinción fluorescente con muy poca variación entre células dentro de la misma generación, permitiendo que cada generación pueda diferenciarse: al menos 6 generaciones - El fluorescente se diluye progresivamente a medida que las células se dividen: las divisiones celulares posteriores resultan en un mayor número de células con la mitad la intensidad de fluorescencia de las células parentales - La 1ª generación que ha tomado el colorante va a expresar la totalidad del colorante. Cuando la célula se divida, va a dividir el colorante entre las 2 cel hijas cuando estas se vuelvan a dividir vuelven a dividir la \[ \] del colorante etc. Por lo que la 1ª gen. va a estar más teñida que la última. - Sirve para ver cuantas veces se ha dividido una célula - Ej: el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE). **Medición de ATP mitocondrial** - Indica como prolifera el cultivo. Determina el número de células viables en cultivo en base a la cuantificación de ATP: indicador de células metabólicamente activas. - Las células se lisan y el lisado se mezcla con un sustrato quimioluminiscente que genera una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP → La cantidad de ATP es directamente proporcional al número de células presentes en el cultivo - A mayor \[ \], mayor velocidad de reacción por lo tanto, mayor presencia de ATP **Nivel de duplicación de la población (PDL)** - Número total de veces que las células en la población se han duplicado desde su aislamiento primario in vitro - Estimación redondeada al número entero más próximo - Depende de: - 1\. Las células que proliferan: no todas lo hacen por igual, algunas están en senescencia o se dividen a velocidades diferentes - 2\. La tasa de muerte celular - Fórmula para calcular la duplicación de la población: N = número de células en este momento N0 = número de células en el inóculo para iniciar el subcultivo S = nivel de duplicación del inóculo usado para iniciar el subcultivo (es el PDL inicial) - Los cultivos primarios se subcultivan generalmente en una relación 1:2, es decir, se dividen por la mitad con cada pase del cultivo - La mayoría de líneas cel continuas replican a tasas más altas y se subcultivan en un ratio \> 1:2 - Número de pases: número de veces que las células se subcultivan en un nuevo frasco o placa - Para cultivos diploides: el número de pases es aproximadamente igual al PDL desde el inicio del cultivo - Para líneas celulares continuas: se pasan a \> split ratio → PDL no se calcula para líneas celulares continuas - En mayoria de casos, PDL es una estimación: no tiene en cuenta las células que se han perdido en el cultivo por apoptosis o las células que están en senescencia y ya no se dividen - PDL se correlaciona directamente con la senescencia replicativa, vinculada a la pérdida de potencia del cultivo - PDL se correlaciona directamente con la inestabilidad genómica - PDL es un predictor importante de senescencia, inestabilidad genómica y pérdida de potencia del cultivo en algunos tipos celulares PDL podría variar entre los diferentes cultivos de células. **Tiempo de duplicación de la población (PDT)** - Tiempo requerido para que un cultivo duplique su número - Las células crecen a tasas diferentes en cada de las diferentes fases del crecimiento/ ciclo celular → el tiempo calculado para la duplicación puede ser una combinación del crecimiento durante más de una de estas fases - El crecimiento exponencial (fase log) es bastante constante y reproducible - Fórmula para calcular PDT: **Curvas de crecimiento** Los cultivos celulares se comportan de manera más consistente y uniforme en la fase logarítmica (experimentos más reproducibles) Para obtener más reproducibilidad es importante hacer réplicas de los experimentos en la misma fase de la curva de crecimiento Tanto la tasa de proliferación como otros parámetros (ej: el nivel de expresión de proteínas) pueden cambiar debido al número de pases o subcultivos que tiene el cultivo en el momento de realizar el experimento. **Migración celular** - Motilidad de las células en cultivo - Los fibroblastos, macrófagos o células tumorales son capaces de moverse o migrar a través del sustrato en función de la densidad celular y la presencia de estímulos quimiotácticos - Este fenómeno puede ser cuantificado usando placas transwell - Se utiliza para el ensayo de cicatrización de heridas **Ensayo de cicatrización: wound healing assay** - Gap closure migration assays - Resultados más consistentes comparados con los ensayos de arañar el cultivo - Los insertos inertes son preferibles al arañado del cultivo: no dejan residuos que puedan impedir la proliferación o migración de las células - Útil para medir migración celular, proliferación celular, cierre de heridas **ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO. SINCRONICACIÓN CELULAR** **Ciclo celular** - Periodo entre dos divisiones sucesivas de una célula - Durante este periodo el material genético debe replicarse de manera precisa **Fases del ciclo** - Fase G1 o gap 1: se controla el avance del ciclo celular dependiendo del estado intracelular y extracelular (restrictions points). La célula tiene dos opciones: - 1\. Progresión a fase G0: la célula se mantiene quiescente, sin dividirse - 2\. Progresión a fase de síntesis (S) - Fase S o de síntesis de ADN: el ADN se replica a partir de cada cromátida. Existen puntos de control o checkpoints al comienzo de la fase S para asegurar la integridad del ADN - Fase G2 o gap 2: la célula entra en mitosis (termina el aumento del contenido de orgánulos, síntesis de ARN y proteínas). Hay nuevos checkpoints - Fase M o mitosis: cada cromátida hermana se segrega para repartirse entre las dos células hijas **Complejos CDK-ciclina** Cdk4/5/6 - ciclina D Progresión en la fase G1 Cdk2 - ciclina E Transición de la fase G1 a la fase S Cdk2 - ciclina A Progresión en la fase S Cdk1 - ciclina B Transición de la fase G2 a la fase M **Contenido de ADN en las diferentes fases del ciclo** - Las células animales en G1 son diploides (2n): contienen dos copias de cada cromosoma → su cantidad de ADN es 2n. - Durante la fase S (replicación del ADN), la cantidad de ADN de la célula pasa de 2n a 4n → las células en fase S tendrán una cantidad de ADN entre 2n y 4n. - En las fases G2 y M se mantiene el contenido de ADN en 4n y se reduce a 2n tras la citocinesis. **Medida del ciclo celular** [Citometría de flujo en células fijadas ] - Tinción del ADN: - Marcaje fluorescente del ADN: yoduro de propidio, Hoechst, 7-aminoactinomicina D (7-AAD) -- no atraviesan la membrana intacta, la célula debe estar fijada o muerta - Yoduro de propidio - Identificación de arresto del ciclo celular - Medida de la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU, análogo de la timina) durante la fase S y marcaje con anticuerpos fluorescentes anti-BrdU - Marcaje de proteínas específicas de distintas fases del ciclo con anticuerpos conjugados con fluorocromos: Ki67, PCNA, ciclinas y CDKs, p21, p53, Rb - - [Immunoblotting (western blot)] - Marcaje de proteínas específicas de distintas fases del ciclo con anticuerpos conjugados con horse-radish peroxidasa (HRP) - p21: gen que codifica para el inhibidor CDKN1A de los complejos ciclina-CDK de la fase G1/S y ciclina-CDK de la fase - S. p53 (proteína supresora de tumores) se encarga de activar la transcripción de p21 cuando hay un daño en el ADN **Sincronización celular** - Dos tipos de cultivos celulares según la sincronía de su ciclo celular: - Población sincrónica: las células van atravesando las distintas etapas del ciclo a la vez y se dividen al mismo tiempo. - Población asincrónica: las células están en momentos desfasados del ciclo, hay células en todas las etapas del ciclo celular. - Para trabajar sobre un cultivo celular homogéneo es necesario sincronizar el ciclo celular: utilizar técnicas que permitan que gran número de células del cultivo se dividan al mismo tiempo - La sincronización del cultivo se realiza fundamentalmente por dos mecanismos: - 1\. Starving o depleción: eliminar del medio moléculas que inducen proliferación (sueros, factores de crecimiento): - - - 2\. Añadir inhibidores químicos de las fases del ciclo celular: Detienen la síntesis de DNA o alteran la función de los microtúbulos - - - - **VIABILIDAD Y CITOTOXICIDAD** **Viabilidad** - - Tinciones vitales (yoduro de propidio, 7-AAD) que solo penetran si la membrana está alterada - Marcaje fluorescente de moléculas que reconocen marcadores específicos de la apoptosis: - Anexina V, que se une a la fosfatidilserina - Anticuerpos de unión a caspasas activas - Colorantes fluorescentes que determinan la alteración del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) - JC-1 (carbocianina catiónica): se acumula en la mitocondria - - - Colorantes fluorescentes que determinan la liberación de citocromo c del espacio intermembranal de la mitocondria - Ensayos metabólicos: - Las células se incuban con sales de tetrazolio que son metabolizadas a compuestos coloreados si la maquinaria celular es operativa (Pej., MTT, XTT, WST-1) - Determinación de la tasa metabólica en un espectrofotómetro: colorimetría - Ensayos metabólicos: ensayo MTT - 1. Cultivar 1.000-100.000 células por pocillo - 2\. Incubar durante 6 a 24 horas - 3\. Añadir 10 uL del reactivo MTT - 4\. Incubar durante 2-4 horas, hasta que pueda observar el precipitado púrpura - 5\. Añadir 100 uL del detergente - 6\. Hacer un lavado a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 horas - 7\. Medir la absorbancia a 570 nm - Determinación de la última fase de la apoptosis analizando la rotura del ADN genómico mediante electroforesis en gel de agarosa - Determinación de la última fase de la apoptosis analizando la rotura del ADN genómico mediante ensayo de tunel (terminal deoxynucleotidyl- transferase dUTP nick end labeling). - Tunel: - - **Citotoxicidad** Determinación de citotoxicidad: curvas dosis-respuesta - La relación dosis-respuesta representa el efecto biológico inducido por diferentes concentraciones de una sustancia - Debería ser determinada siempre que se inicia un nuevo estudio con agentes químicos, para poder fijar las condiciones óptimas del ensayo, tanto de eficacia como de toxicidad - Se determinan distintas constantes para cada compuesto y cultivo celular empleados: - EC50: half maximal effective concentration, representa la concentración del compuesto con efectividad (toxicidad) en el 50% del cultivo - IC50: half maximal inhibitory concentration, representa la concentración del compuesto que produce inhibición de un proceso en el 50% del cultivo - LD50: half maximal lethal dose, representa la concentración del compuesto letal que produce la muerte en el 50% del cultivo