Valoración De La Funcionalidad De La Inmunidad Celular (UD.7) PDF

UD.7 VALORACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LA INMUNIDAD CELULAR LA RESPUESTA INMUNE DE BASE CELULAR Esta respuesta está mediada por distintas células del sistema inmune, fundamentalmente por linfocitos T y macrófagos y, en menor medida, por las células NK, los neutrófilos y los basófilos. La valoraci...

UD.7 VALORACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LA INMUNIDAD CELULAR LA RESPUESTA INMUNE DE BASE CELULAR Esta respuesta está mediada por distintas células del sistema inmune, fundamentalmente por linfocitos T y macrófagos y, en menor medida, por las células NK, los neutrófilos y los basófilos. La valoración de la respuesta celular se emplea para conocer el estado inmunitario de los individuos, tanto los sanos como los que están desarrollando procesos en los que la respuesta inmunitaria de base celular esté implicada (enfermedades infecciosas producidas por virus, bacterias intracelulares, hongos, helmintos y protozoos, así como por inmunodeficiencias, reacciones de hipersensibilidad retardada, tumores o rechazo de injertos). ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE DE BASE CELULAR La respuesta inmune de base celular se puede determinar mediante diversas técnicas.De manera general, se clasifican las pruebas en: -​ In vivo. -​ In vitro. TÉCNICAS IN VITRO Las técnicas in vitro que emplean células sanguíneas requieren, en primer lugar, el aislamiento y la identificación de las células cuya función se quiere averiguar. A continuación, se procede a la separación de las poblaciones y las subpoblaciones celulares y a realizar los estudios de comportamiento o funcionalidad. En general, se utiliza sangre periférica entera con un anticoagulante (de elección), pero también se utilizan órganos y tejidos linfoides (post mortem). ESTUDIO DE MARCADORES Y ANTÍGENOS DE MEMBRANA a) Marcadores y receptores de membrana Estos métodos han sido tradicionalmente utilizados para diferenciar y cuantificar poblaciones de linfocitos B y T. Estos marcadores, están basados en las características específicas de ciertos receptores de membrana, presentes en ambas poblaciones de linfocitos. -​ Para los Linfocitos B: Se utilizan como marcadores las inmunoglobulinas presentes en su superficie, los receptores para el fragmento Fc de la inmunoglobulina, los receptores para el componente C3 del sistema de complemento y otros antígenos específicos como el CD19. En la mayoría de los casos son pruebas de Inmunofluorescencia Directa, (incubación de los linfocitos con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo). O Citometría de Flujo, (anticuerpos monoclonales fluorescentes frente a estos marcadores o receptores). Para los estudios de funcionalidad in vitro se puede utilizar el mitógeno pokeweed (mitógeno extraído de la raíz de la Phytolacca americana), que induce una proliferación, tanto de linfocitos T 1  como de linfocitos B, que permite evaluar la respuesta proliferativa de los linfocitos B en presencia de linfocitos T o en una mezcla de células mononucleares. La respuesta de los linfocitos a la estimulación con mitógenos puede considerarse un modelo de la capacidad funcional del sistema inmune para hacer frente a los agentes infecciosos, como virus y bacterias. -​ Para los Linfocitos T. También poseen Ag específicos en su superficie (CD) que se utilizan como marcadores para su recuento. Se emplean también Ac monoclonales marcados con fluoresceína. (Inmunofluorescencia directa o CF) Test de rosetas: Consiste en la formación espontánea de rosetas cuando se exponen a eritrocitos de carnero sin tratar. Los linfocitos T humanos tienen en su superficie un receptor (CD2 y CD58) que media en la unión con los hematíes de carnero in vitro, formando agrupaciones denominadas rosetas E. La función del CD2 es unirse a un antígeno de función leucocitaria LFA-3 (leukocyte function antigen). Los hematíes de carnero tienen una molécula análoga a LFA-3 en su superficie, que permite la unión a los linfocitos T. -​ Test de rosetas. Actualmente se usan métodos en los que los glóbulos rojos de carnero se tratan con neuroaminidasa o AET (bromuro de 2-amino etiliso-tiouronio) para aumentar la unión de las células T. Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el marcaje con naranja de acridina (teñir muestra); después, se pueden ver con el microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se marcan con la naranja de acridina; los linfocitos T forman rosetas, mientras que los B se marcan con la naranja de acridina, pero sin formar rosetas. SEPARACIÓN POR SUS ANTÍGENOS DE MEMBRANA Mediante anticuerpos monoclonales se pueden marcar las diferentes poblaciones linfocitarias. Los métodos más utilizados son: a) Citometría de flujo: Permite valorar varios fluorocromos a la vez y, por tanto, se pueden estudiar varias subpoblaciones celulares en la misma muestra de linfocitos. b) Inmunohistoquímica: Ac monoclonales marcados con fluorescencia o con enzima frente a los diferentes linfocitos; se pueden valorar estas células en cualquier tejido. También puede realizarse esta técnica utilizando dos anticuerpos monoclonales, cada uno frente a una población linfocitaria distinta, cada uno marcado con una enzima diferente. Este doble marcaje (peroxidasa-fosfatasa alcalina) permite estudiar dos poblaciones celulares a la vez en cualquier tejido. PRUEBAS QUE VALORAN LA FUNCIONALIDAD DE CÉLULAS INMUNES El estado inmunitario de un individuo viene determinado más por la capacidad funcional de los linfocitos que por su cantidad. Hay pruebas que permiten identificar cómo proliferan las células del sistema inmune cuando son estimuladas por sustancias químicas o antígenos, que normalmente activan el sistema inmunológico. Es necesario analizar además ciertas características como: 2  -​ La capacidad de producción de citoquinas -​ La respuesta a mitógenos -​ La citotoxicidad celular. Las pruebas utilizadas no pueden garantizar que esa funcionalidad se produzca de forma idéntica in vivo. PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD IN VITRO ​ Para linfocitos B: 1.​ Ensayo de células formadoras de placas (PFC) 2.​ Ensayo ELISPOT ​ Para linfocitos T: 1.​ Pruebas de proliferación celular: -​ Ensayo de linfoproliferación o estimulación blástica. -​ Reacción linfocitaria mixta. 2.​ Determinación de la producción de citoquinas: -​ Prueba del Interferón gamma. -​ ELISPOT. -​ Detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo. 3.​ Ensayos de citotoxicidad. -​ Liberación de Cromo 51. ​ La evaluación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. (CCDA) ​ Funcionalidad fagocítica de macrófagos y neutrófilos: 1.​ Test de actividad fagocítica. 2.​ Capacidad bactericida. 3.​ Prueba de reducción del NBT 4.​ Ensayos de quimiotaxis ​ Estudio de las alteraciones del complemento 1.​ Cuantificación de componentes C3 y C4 2.​ CH50 (capacidad hemolítica) ESTUDIOS DE FUNCIONALIDAD DE LOS LINFOCITOS B 1. Ensayo de células formadoras de placas (PFC) Es un indicador de la proliferación celular que permite determinar el número de células productoras de anticuerpos. Es un ensayo muy sensible. Se parte de una suspensión de linfocitos obtenida por centrifugación en gradiente de Ficoll de una muestra de sangre periférica. La muestra utilizada son linfocitos T y B, de los cuales se el nº, citómetro. 3 La técnica utiliza: -​ Eritrocitos de carnero sensibilizados con proteína A (extraída de la pared celular de Staphylococcus aureus) que actúa como Ag y provoca la generación de células plasmáticas que producen Ac. -​ Anti-Ig contra las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas IgA, IgM o IgG humanas que se unieron a la proteína A de los eritrocitos. -​ Complemento absorbido sobre eritrocitos de carnero. Se incuban todos los componentes a 37ºC en una placa Petri y al cabo de un tiempo se producirá hemólisis de los eritrocitos por el complemento si se forma el inmunocomplejo por los Ac generados. Las PFC se identifican como zonas más claras, sin células, en el agar. En la parte central se encuentra la célula plasmática. Los resultados se expresan como el recuento medio de PFC por millón de células sembradas. 2. Ensayo ELISPOT Se realiza sobre membranas de nitrocelulosa o placas de microtitulación. a) Se fija un Ag en el soporte (presupongo que la persona ha estado en contacto- microorganismo o en inmunodeficiencia donde Ag al que todo el mundo ha estado en contacto. b) Se incuba la muestra con linfocitos B en una dilución adecuada c) Los Ac que produzcan los LB activados se fijarán a los Ag del soporte. d) Lavar e) Se añade después anti-Ig-Enzima o anti-Ig biotiniladas + Estreptavidina-Enzima f) El enzima se revela con un cromógeno apropiado y se forma una mancha en el lugar que ocupaba la célula B activa. Las manchas pueden ser contadas manualmente utilizando un microscopio, o por medio de un lector automatizado que captura imágenes de los pocillos y las analiza para determinar el número de manchas formadas. Contando las manchas y sabiendo cuántas células se habían añadido al pocillo, se puede calcular la proporción de LB que producen el Ac específico. Es una técnica automatizable, con una sensibilidad muy alta. PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD IN VITRO PARA LINFOCITOS T 1. Pruebas de proliferación celular: Se basan en que los linfocitos que reconocen un antígeno determinado se estimulan y proliferan. Hay dos ensayos fundamentales: a) Ensayo de linfoproliferación o estimulación blástica. b) Reacción linfocitaria mixta. 4 a) Ensayo de linfoproliferación o estimulación blástica. ​ Se realiza sobre linfocitos aislados mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Se emplea con dos fines: -​ Medir el estado global de la respuesta celular. -​ Diagnosticar la exposición previa a un microorganismo intracelular (por vacunación o infección natural). ​ Este ensayo es actualmente una de las técnicas más precisas y difundidas para el estudio de la capacidad de estimulación específica y no específica de los linfocitos in vitro. Esta técnica se basa en la capacidad que tienen los linfocitos para responder frente a un antígeno (respuesta específica) que ha inducido linfocitos de memoria. Un nuevo contacto con el antígeno induce una transformación blástica. Esta estimulación blástica (blastogénesis) también puede ser inducida de forma no específica gracias a la capacidad de los linfocitos de reaccionar con diferentes tipos de lectinas de origen vegetal, como la fitohemaglutinina o la concanavalina A. Las lectinas inducen una estimulación blástica de tipo inespecífico tanto en los linfocitos B como en los T. Cultivar los linfocitos aislados con los antígenos que quieren ser estudiados en presencia de la lectina, que provocará una estimulación no específica. Tras un tiempo de incubación (unos días) se añade un isótopo radiactivo (timidina tritiada) al medio de cultivo en el que están los linfocitos. Si hay estimulación blástica (inmunoproliferación), la timidina(marcada con un isótopo radiactivo) se incorporará al ADN de los nuevos linfocitos, y las células se marcarán radiactivamente. Cuanta más timidina tritiada se añada, mayor estimulación blástica se habrá producido. Paralelamente se realizará con un control sin lectina. La radiactividad incorporada en las nuevas células puede medirse después de recogerlas utilizando un dispositivo denominado colector de células (harvester). Las células quedan retenidas en un filtro. Estos filtros se llevan a un contador de partículas beta (contador de centelleo líquido). Cuanta mayor sea la incorporación de timidina tritiada, mayor es la respuesta proliferativa. Se calcula el Índice de estimulación como el cociente entre la radiactividad de los cultivos estimulados con mitógeno y la radiactividad del control de células no estimuladas. b) Reacción linfocitaria mixta: Se basa en que los linfocitos proliferan cuando se incuban en presencia de otras células con antígenos CMH II diferentes. Se emplea para determinar la histocompatibilidad en trasplantes. 5 2. Determinación de la producción de citoquinas: Valoración de la funcionalidad de linfocitos T CD4+ La producción de citoquinas evidencia la funcionalidad de los linfocitos Th, e incluso puede identificar la subpoblación de los mismos (Th1 o Th2). A continuación, se describen los ensayos más utilizados. a)​ Prueba del Interferón gamma b)​ ELISPOT c)​ Detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo. a) Prueba de Interferón gamma Prueba del Interferón-γ. Se basa en la detección, mediante un ELISA tipo sándwich, del IFN-γ producido por linfocitos Th1 tras su estimulación con el antígeno. SSolo se estimulan los linfocitos con contacto previo con el mismo antígeno. Se realiza en sangre entera con heparina y es una prueba complementaria a la de tuberculina para el diagnóstico de la tuberculosis. b) ELISPOT (ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas de puntos) Sirve para medir los linfocitos T secretores de una determinada citoquina mediante una modificación del ELISA de captura. Se trata de un estudio similar al anterior en cuanto a su fundamento teórico, aunque con variantes de tipo técnico. Los ensayos ELISPOT son más sensibles que los ELISA. En este ensayo se utiliza una placa de poliestireno que permite fijar proteínas o, PVDF (polifluoruro de vinilideno) tapizada con un anticuerpo monoclonal anti-citocina de alta afinidad. Las células estimuladas con el mitógeno o el antígeno se añaden en los pocillos y son incubadas durante un periodo de tiempo, lo que permite que cualquier citocina secretada pueda ser capturada por el anticuerpo. Después de un lavado para eliminar las células y cualquier sustancia que no se haya unido, las citocinas pegadas se detectan utilizando un anticuerpo biotinado. Se añade después avidina-E y el sustrato que se escinde por acción del enzima y precipita. El paso final es la precipitación, exponiendo los sitios de secreción de citocinas como un punto. Estos pueden contarse con un lector ELISPOT automatizado o manualmente, utilizando un microscopio. La prueba ELISPOT está diseñada para detectar células secretoras de citocinas. Puede calcularse la frecuencia de aparición de células T que responden. La información obtenida con esta prueba es tanto cuantitativa como cualitativa, da información sobre el tipo de respuesta que ha sido producida. La principal aplicación es monitorizar respuestas inmunes, tanto en humanos como en animales. 6 c) Detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo Permite determinar el perfil de citoquinas producidas por un tipo celular mediante una citometría de flujo que permite la entrada de los anticuerpos al interior de la célula. Para las Th1 se cuantifica la expresión de la interleucina 2 (IL2) y la del interferón gamma, para Th2 IL4 y IL10. El estudio de los linfocitos T reguladores se realiza mediante la identificación del factor de transcripción FoxP3 y de CD25 en la membrana. FoxP3 es considerado el marcador fenotípico más importante. Solo los LT reguladores presentan una expresión alta y sostenida del marcador, a pesar de manifestarse también en otras poblaciones celulares. 3. Ensayos de citotoxicidad: valoración de la funcionalidad de los linfocitos T CD8+ o citotóxicos y de las células NK (conozco el número de células y de linfocitos o NK) La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD8+) frente a una célula diana (que presente el complejo péptido-CMH I), se puede estudiar midiendo la capacidad que tiene un determinado número de linfocitos T para destruir un determinado número de células diana, al estar ambas poblaciones en contacto. Hay varios métodos para poder valorar el porcentaje de lisis o muerte celular que expresan las células diana, aunque el más utilizado por su precisión, sensibilidad y reproductibilidad, es el de la liberación de cromo-51 procedente de las células diana. Este método consiste en que las células diana (que expresan los antígenos determinados en su membrana) se marcan con cromo-51 (51Cr) (isótopo radiactivo) y se ponen en contacto en una proporción adecuada con las células efectoras (CD8, NK, etc.). Tras incubar conjuntamente ambas poblaciones celulares durante un periodo determinado, se centrifugan; en una parte del sobrenadante, el porcentaje de 51Cr liberado al medio se mide mediante un contador de partículas gamma. A mayor cantidad de cromo liberado, mayor actividad citotóxica. 7 LA EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD CELULAR DEPENDIENTE DE ANTICUERPOS. (CCDA) Es un ensayo similar al descrito para linfocitos Tc y células NK, en el que se incluye un paso previo de incubación de las células con anticuerpos específicos frente a ellas, que se unen a las células. A continuación, se añaden las células implicadas en esta respuesta inmunitaria (monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y células NK) que se unen a la fracción Fc de los anticuerpos fijados a las células activando así los mecanismos citotóxicos propios de cada tipo celular. FUNCIONALIDAD FAGOCÍTICA DE NEUTRÓFILOS Y MACRÓFAGOS Aunque hay grandes diferencias entre estos tipos de células, la metodología de estudio es coincidente, puesto que ambos son responsables de la fagocitosis en la respuesta inmunológica innata. Existen diferentes métodos para evaluar la capacidad fagocítica como son: 1.​ El test de actividad fagocítica. 2.​ La capacidad bactericida. 3.​ La prueba de reducción de nitroblue tetrazolium. 4.​ Ensayos de quimiotaxis 1.​ Test de actividad fagocítica Consiste en la incubación de las células fagocíticas del paciente junto con partículas o microorganismos recubiertos por opsoninas (complemento o anticuerpo). Posteriormente se detecta el porcentaje de partículas en el interior de las células por distintos métodos, como la tinción y el recuento con el microscopio óptico o por citometría de flujo (sí las partículas fagocitadas están marcadas con una sustancia fluorescente). Los resultados se expresan como un índice fagocítico, o número de bacterias ingeridas por 100 PMN. También se puede realizar añadiendo una cantidad conocida de bacterias como Staphylococcus aureus marcadas con un isótopo radiactivo como 3H o 14C a la muestra con células fagocíticas. Se incuban juntos durante un tiempo, se centrifuga a baja velocidad, se elimina el sobrenadante y se lava para separar las bacterias libres no fagocitadas. Finalmente se determina la radiactividad presente en el sedimento celular que será proporcional a las bacterias fagocitadas. 2.​ La capacidad bactericida. Se recogen alícuotas a diferentes tiempos. Consiste en incubar una suspensión de leucocitos con bacterias en rotación continua a 37 ºC. Se toman alícuotas para el recuento de las colonias por dilución en una placa, a los 0, 30, 60 y 120 minutos. Los resultados se expresan como un índice bactericida, o número de bacterias vivas a los 120 minutos/número de bacterias vivas a los 30 minutos. Ambas pruebas se complementan, ya que el test de actividad fagocítica determina la capacidad de fagocitar de los leucocitos, pero no el poder de digerir las partículas fagocitadas, mientras que el ensayo de actividad bactericida permite valorar si las 8 bacterias fagocitadas son o no destruidas por las lisozimas de los fagosomas de los leucocitos. Medida de la capacidad bactericida (color diferentes vivas y muertas) La actividad bactericida, se puede medir también utilizando la técnica del naranja de acridina. El naranja de acridina es un fluorocromo que se une al DNA de las bacterias vivas emitiendo una fluorescencia verde mientras que tiñe en color naranja las bacterias muertas. La técnica se realiza incubando Escherichia coli con los fagocitos a estudiar. Después de la incubación, los fagocitos se lisan y el sobrenadante se trata con naranja de acridina. En el sobrenadante se podrán observar bacterias fagocitadas aún vivas (fluorescencia verde) y bacterias muertas (fluorescencia naranja). Se realiza la observación y el recuento utilizando el microscopio de fluorescencia El resultado se expresa como porcentaje de bacterias fagocitadas y destruidas por las células fagocíticas 3.​ Prueba de reducción de nitroblue tetrazolium (NBT) Cuantifica la activación del metabolismo celular de los fagocitos. El estallido respiratorio o explosión es el proceso por el que algunas células son capaces de producir y liberar especies reactivas de oxígeno, como los radicales libres y el superóxido y peróxido de hidrógeno. Reduce el colorante del interior de la célula. Es un mecanismo utilizado habitualmente por las células del sistema inmunitario para producir compuestos con capacidad microbicida, tales como el peróxido de hidrógeno y el anión hipoclorito. El cloruro de nitroblue tetrazolium, también conocido como nitroazul de tetrazolio o NBT es un c El estado reducido del NBT se llama formazán; es un compuesto insoluble en agua, de color azul muy intenso, prácticamente negro. El principio en el que se basa esta prueba es que las células que son capaces de producir un estallido respiratorio competente son también capaces de reducir el NBT. En este ensayo, las células se exponen a una solución que contiene NBT y a un estimulante de la fagocitosis, (por ejemplo PMA= aceto-miristato de forbol). Las células estimuladas forman pequeñas vesículas fagocíticas que incorporan el NBT de la solución. Si cuentan con un mecanismo de explosión respiratoria funcional, reducen al NBTompuesto químico soluble, de color amarillo en estado oxidado. Cuando se observan al microscopio, las células que han producido el estallido respiratorio muestran gránulos intensamente coloreados de negro (las vesículas fagocíticas en las que se ha producido la reducción del NBT). Se realizará un recuento del porcentaje de células fagocíticas coloreadas sobre el número de células fagocíticas total. En pacientes sanos se observa que la gran mayoría de las células genera cristales de formazán, mientras que la ausencia de reducción del NBT indica la presencia de un trastorno en la fagocitosis. 9 4.​ Ensayos de quimiotaxis Miden la respuesta de los neutrófilos hacia estímulos de atracción utilizando los ensayos en gel de agarosa y los ensayos en cámaras Boyden. Se puede realizar en placas de Petri con gel de agarosa. En el gel, se recortan tres pocillos, el central se rellena con leucocitos del paciente, otro es un pocillo control con leucocitos de un individuo sano y el otro contiene una solución de tripéptido sintético quimiotáctico (FMLP)- sustancia quimiotáctica. El factor quimiotáctico difunde a través de la agarosa y atrae las células del pocillo central, las células migran y después de un período de incubación adoptan una distribución ovoidal. Las células se tiñen con un colorante. Se observan al microscopio óptico, se mide la diferencia entre la migración de las células hacia el factor quimiotáctico y la migración al azar, espontánea, de las mismas células en el gel. Actualmente se pueden utilizar microplacas de 96 pocillos que son en realidad 96 cámaras de Boyden formadas por estructuras superpuestas.Los resultados se obtienen por visualización directa al microscopio óptico, por colorimetría o mediante la medida de la intensidad de fluorescencia. ESTUDIO DE ALTERACIONES DEL COMPLEMENTO Para iniciar el estudio se cuantifican los niveles de C3 y C4, mediante inmunodifusión radial o inmunonefelometría. Análisis de la vía clásica La valoración de la capacidad funcional de los componentes de la vía clásica del complemento se realiza mediante la medida de la capacidad hemolítica total del complemento y el CH50. El test CH50 es un ensayo de cribado (screening) sensible a la disminución, ausencia o inactividad de cualquier componente de la vía clásica. El ensayo mide la función de toda la vía clásica del complemento, desde C1 hasta C9, y si esta determinación está fuera del rango normal, entonces se pueden medir individualmente cada uno de los componentes del complemento para estudiar deficiencias hereditarias o adquiridas. (Muestra → suero o plasma, se forma en el complejo Ag-Ac para que actúe el complemento) Mide la capacidad de la vía clásica y del complejo de ataque a la membrana para lisar eritrocitos de carnero sensibilizados con anticuerpos IgM de conejo anti-eritrocito de carnero (hemolisinas). Cuando estos eritrocitos se incuban con el suero de un paciente, se activa la vía clásica del complemento y se produce una hemólisis que se puede cuantificar después de centrifugar midiendo la absorbancia de la hemoglobina liberada en el sobrenadante. En el test CH50 se calcula el volumen de suero que lisa el 50% de los eritrocitos, desde una curva patrón realizada con los resultados de hemólisis de cantidades cada vez mayores de complemento. Se mide el grado de hemólisis de cada tubo dividiendo su absorbancia por la de un tubo que contiene agua 10 destilada(100% de hemolisis) en lugar de suero, y con los datos obtenidos se traza una gráfica para determinar qué volumen ha lisado el 50 % de los eritrocitos Para medir CH50 también pueden utilizarse inmunoensayos automatizados basados en liposomas. Los liposomas(superficie hapteno (Ag) + Ac), integrados por láminas concéntricas de bicapas lipídicas separadas por espacios acuosos (célula artificial), se utilizan en el estudio del daño producido en las membranas celulares por el sistema de complemento. Para medir CH50 se emplea una población homogénea de liposomas de pequeño tamaño, que proporcionan una dispersión estable. El grado de lisis se determina a través de la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, englobada en el interior de los liposomas. La muestra se mezcla con liposomas que incorporan un hapteno, el dinitrofenil fosfato (DNP), y con anticuerpos anti-DNP. El inmunocomplejo formado activa el complemento presente en la muestra del paciente hasta que se forma el complejo de ataque a membrana que provoca la ruptura de la membrana del liposoma, tal como sucedería en la membrana de una célula. La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se libera desde el interior del liposoma y reacciona con el coenzima NAD+ y la glucosa-6-fosfato presentes en el reactivo. La reacción enzimática genera NADH cuya absorbancia. El aumento de absorbancia es proporcional a la actividad del complemento en la muestra. Análisis vía clásica -​ La identificación del componente específico que falta se realiza por métodos imnunoquímicos y funcionales. -​ Generalmente el estudio se inicia mediante una inmunodifusión doble bidimensional (de Ouchterlony), analizando el suero problema con antisueros policlonales frente a cada uno de los componentes de la vía clásica del complemento. Se observa si hay o no reacción con cada uno de ellos. -​ La comprobación de la ausencia de un componente se investiga añadiendo ese componente al ensayo y comprobando que se restaura la lisis. -​ Después se pueden realizar análisis de los niveles de cada componente mediante ELISA (Cuantificación). 11 -​ La deficiencia de los componentes de la vía alternativa (factores D, H, I y P) puede ser analizada mediante ensayos hemolíticos, utilizando eritrocitos de conejo, que son potentes activadores de esta vía. -​ Los pacientes con deficiencias de alguno de estos componentes no lisan los eritrocitos de conejo INMUNODEFICIENCIA Inmunodeficiencia se refiere a algún fallo en la función del sistema inmunitario. Según la causa existen 2 tipos de inmunodeficiencias: 1. Inmunodeficiencia primaria: -​ La provocada por alguna anomalía intrínseca o congénita. Normalmente es de naturaleza congénita, pero puede ser el resultado de errores aleatorios que hayan ocurrido durante algunas etapas del desarrollo. -​ Suelen ser procesos graves y persistentes. -​ Las manifestaciones clínicas se inician generalmente en la primera infancia, pero también hay algunas que comienzan a manifestarse en niños con más edad. 2. Inmunodeficiencia secundaria o adquirida: Es consecuencia de una infección, un tratamiento, un cáncer o una deficiencia nutricional, es decir, factores extrínsecos capaces de alterar el funcionamiento del sistema inmunológico. Es siempre posterior al nacimiento, y se manifiesta en cualquier etapa de la vida. Tanto en inmunodeficiencias primarias como secundarias, las personas afectadas son más susceptibles a contraer infecciones y, dependiendo del tipo de inmunodeficiencia, especialmente a las producidas por determinados patógenos. CAUSAS A)​ Desnutrición B)​ Tratamientos farmacológicos El funcionamiento normal del sistema inmunitario se puede ver alterado por un efecto secundario de un tratamiento médico. Fundamentalmente ocurre como consecuencia de los tratamientos que se administran a: -​ Los receptores de trasplantes -​ Pacientes con alguna enfermedad autoinmune -​ Pacientes con cáncer. C)​ Infecciones Se han descrito alteraciones del sistema inmunitario tanto en infecciones bacterianas, como fúngicas, parasitarias y víricas. Los mecanismos de acción son varios: la destrucción de células inmunitarias o cambios que les impiden realizar su función, también puede ser la producción de factores o de toxinas que modifican el medio o la permeabilidad de las membranas,… Infecciones por virus Entre todos los agentes que inducen inmunosupresión el más importante es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). 12  El VIH destruye los linfocitos CD4+, su pérdida progresiva lleva consigo una disminución de la respuesta inmune humoral y celular, y un aumento de la susceptibilidad a infecciones oportunistas que pueden ser mortales. Se observan 3 fases en la evolución: 1.​ La fase aguda es el periodo de viremia caracterizado por síntomas inespecíficos de infección. Hay una cifra máxima de virus en sangre y una moderada reducción de linfocitos T CD4+, que puede volver a la normalidad. En esta fase detectan Ag. 2.​ La fase crónica o de latencia clínica, que puede durar años. Se inicia alrededor de las 12 semanas después de la infección, con la reducción considerable de virus en sangre. Durante este tiempo el virus queda retenido en tejidos linfáticos y se recupera moderadamente el nivel de linfocitos T CD4+, que después irá disminuyendo paulatinamente. 3.​ La fase final de la enfermedad es realmente el denominado Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), que evoluciona con aumento importante de la viremia y disminución de linfocitos T CD4+ por debajo de 200 células /mm3. Desde el punto de vista de diagnóstico, la infección aguda por VIH es el periodo de infección antes de la seroconversión, y se confirma por la detección del antígeno denominado p24 o de ARN viral en ausencia de una respuesta positiva a las pruebas de ELISA y de western blot. Normalmente la seroconversión ocurre entre las 6 y las 12 semanas de exposición. d) Cáncer Los periodos de inmunodepresión que provoca la quimioterapia hacen que los pacientes puedan sufrir más infecciones, y algunas más graves. DIAGNÓSTICO DE INMUNODEFICIENCIAS ​ Inmunodeficiencias primarias Las pruebas de primera etapa son análisis clínicos generales que proporcionan una orientación sobre la enfermedad y sobre las pruebas que es conveniente realizar después. Las de segunda generación son pruebas de valoración del sistema inmunitario. Finalmente, las de tercera etapa miden la función de los linfocitos y las células fagocíticas. La historia clínica y la información que se obtiene en las pruebas permite llegar a un diagnóstico definitivo ​ Inmunodeficiencias secundarias La propia enfermedad primaria es orientativa de los trastornos que se pueden producir en el sistema inmune, y los procedimientos de diagnóstico pueden variar dependiendo de las causas que han desencadenado la inmunodepresión. Especialmente en el caso de las infecciones, es necesario utilizar los métodos de diagnóstico según cual sea el agente patógeno desencadenante. PRUEBAS DE PRIMERA ETAPA -​ Hemograma, VSG, frotis de s.p y recuento de plaquetas. -​ Electroforesis de proteínas séricas. Importante la relación albúmina y globulinas que informa sobre el estado nutricional. 13  Se puede determinar, por ejemplo, la enorme disminución de gamma globulinas séricas que sucede en la hipogammaglobulinemia, cuando se ven afectadas las IgG, sobre todo el isotipo predominante. -​ Diagnóstico de imagen. PRUEBAS DE SEGUNDA ETAPA Las pruebas se centran en el sistema inmunitario. Pruebas para medir la producción de anticuerpos Cuantificación de tipos y subtipos de Ig séricas. Habitualmente se efectúan determinaciones de niveles de IgA, IgM e IgG mediante inmunodifusión radial (IDR), turbidimetría, nefelometría o ELISA. Cuantificación de linfocitos B. Se determina en sangre periférica por citometría de flujo, utilizando Ac monoclonales anti-CD19 marcados con fluorocromo. También se pueden utilizar otros marcadores de los linfocitos B como CD20, CD21 y CD22. CD característicos, inmunoglobulinas y receptores. Pruebas para medir la inmunidad mediada por linfocitos T -​ Prueba de hipersensibilidad retardada: se realiza en pacientes mayores de 1 año. Mide la respuesta a Candida albicans. Se utiliza un Ag llamado candidina, que se inyecta por vía intradérmica. Se considera que la prueba es positiva si aparece una induración mayor de 5mm al cabo de 48h. Si no hay pápula no hay respuesta por parte de los T, inmunodeficiencia. -​ Mediante citometría de flujo: utilizando los Ac monoclonales frente a marcadores, receptores TCR o BRC, receptores tipo Toll (inmunidad innata). -​ Técnica APAAP (complejo Fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina) Pruebas para medir la actividad de las células fagocíticas -​ Reducción de nitroazul de tetrazolio (NBT). -​ La medición de radicales libres de oxígeno. -​ Ensayos de quimiotaxis. Pruebas para medir la actividad de las células fagocíticas Medición de radicales libres de oxígeno. Permite detectar defectos en la explosión respiratoria de las células fagocíticas. La única técnica analítica que mide directamente las especies de oxígeno reactivas es una técnica de espectrometría que se conoce como resonancia de espín electrónico o resonancia paramagnética electrónica. Esta técnica no se utiliza habitualmente por el coste y la complejidad. Pruebas para medir la actividad del complemento Las deficiencias en el sistema del complemento se pueden producir por la falta de cualquiera de sus componentes. Las determinaciones más habituales para el diagnóstico de inmunodeficiencias son: -​ Determinación de los niveles de C3 y C4. Por IDR -​ Determinación de la capacidad hemolítica CH50. Análisis de la vía clásica -​ Determinación del antígeno CD59 en eritrocitos. Cuando el CD59 está disminuido o ausente aumenta el riesgo de hemólisis mediada por complemento. Se determina por citometría de flujo. PRUEBAS DE TERCERA ETAPA Las pruebas se centran en el estudio de la función de las células que participan en la respuesta inmune linfocitos B, linfocitos T y células fagocíticas. 14 Pruebas para medir la función de los linfocitos B Intentan detectar deficiencias en la inmunidad humoral específica -​ Producción de anticuerpos in vitro. Se realiza por cultivo de linfocitos B, una estimulación con mitógenos y con antígenos, se evalúan los Ac en el sobrenadante con ELISA. -​ Ensayo ELISPOT. -​ Ensayo de células formadoras de placas (PFC). -​ Western blot. Se evalúa la expresión de proteínas responsables de defectos en la funcionalidad de los linfocitos B. -​ Estudios moleculares para la caracterización de mutaciones genéticas. Se detectan las distintas conformaciones de fragmentos de ADN de cadena sencilla por el cambio de movilidad en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes, se forman bandas nuevas en el gel. Pruebas para medir la función de los linfocitos T -​ Estudios de proliferación de linfocitos T en respuesta a mitógenos. -​ Determinación de citoquinas en el sobrenadante del cultivo de linfocitos T con Ag específico y moléculas coestimuladoras. La determinación se puede realizar por ELISA, ELISPOT o citometría de flujo -​ Determinación de la expresión de moléculas coestimuladoras como CD40L o CD28 en la superficie de los linfocitos por citometría de flujo. -​ Determinación de proteínas por western blot. Dos proteínas muy interesantes en inmunodeficiencias son ZAP-70 que se expresa sólo en linfocitos T y NK, e interviene en la selección tímica de los linfocitos. JAK3 enzima que interviene en la finalización del desarrollo de los linfocitos T. Estas 2 proteínas están alteradas en la inmunodeficiencia combinada severa y se analizan para su diagnóstico. (son proteínas de distintas etapas de diferenciación de los linfos). Pruebas para medir la función de las células fagocíticas -​ Determinación de la expresión de las proteínas del complejo NADPH oxidasa mediante Western blot. -​ Evaluación de la capacidad fagocítica y actividad microbicida de los neutrófilos. Se mide el estallido respiratorio. Las células fagocíticas se tiñen con diacetato de diclorofluoresceína que al entrar en contacto con el H2O2 generado durante el estallido respiratorio se oxida y se transforma en un compuesto fluorescente. A continuación, se mide la fluorescencia que será proporcional al estallido respiratorio y por tanto a la fagocitosis. -​ Marcar los microorganismos con sustancias fluorescentes y luego cuantificar la señal de fluorescencia de los macrófagos por citometría de flujo 15