Citometría de flujo PDF - Definición, Componentes y Aplicaciones

UD 5. CITOMETRÍA DE FLUJO La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis de poblaciones celulares en suspensión. Características: -​ Tiene un alto poder de resolución. -​ Permite analizar grandes cantidades de células de un modo multiparamétrico. Sus objetivos son: -​...

UD 5. CITOMETRÍA DE FLUJO La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis de poblaciones celulares en suspensión. Características: -​ Tiene un alto poder de resolución. -​ Permite analizar grandes cantidades de células de un modo multiparamétrico. Sus objetivos son: -​ Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas. Como p. ej. la caracterización de las distintas subpoblaciones de linfocitos. -​ Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas, lo que se llama “electronic cell sorting”. FACS - Separador de células activado por fluorescencia. -​ Medir la capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas. FUNDAMENTO Se basa en hacer pasar una suspensión de células u otras partículas incluidas en un flujo de líquido isotónico alineadas y de una en una por delante de uno o varios detectores que recogen y miden sus diversas características físicas y/o químicas, a la vez que las ilumina con un haz de luz láser focalizado. En esquema, tendríamos una suspensión de células inyectada en un líquido capaz de ordenar el flujo de células de manera individual y a gran velocidad. Sobre cada célula incide la luz de al menos un láser, que se transforma en emisiones a diferentes longitudes de onda (diferentes fluorescencias), algunas de las cuales son recogidas por detectores que amplifican las señales y las transforman a formato digital. Toda esta información es integrada en un ordenador, capaz de almacenarla para su análisis posterior. Las características que se analizan por la citometría de flujo corresponden a dos tipos de parámetros que se miden sobre cada célula o partícula de forma individual. a)​ Los derivados de la luz que se dispersa al incidir sobre la célula o partícula. Son intrínsecos, derivados de características morfológicas de la célula, como su tamaño y complejidad del núcleo y citoplasma (su granularidad) b)​ Los asociados con la luz generada como consecuencia de la presencia de fluorocromos sobre la célula o partícula, de forma natural (autofluorescencia) o unidos a ella artificialmente (Ac marcados). Están relacionados con las características antigénicas de cada célula, poniendo de manifiesto estructuras localizadas en la membrana, en el citoplasma o en el núcleo. Este es el inmunofenotipo. COMPONENTES DE UN CITÓMETRO DE FLUJO 1.​ Sistema hidráulico / sistema de fluidos (inyección de la muestra y cámara de flujo). Permite individualizar las células 2.​ Sistema de iluminación 3.​ Sistema óptico (detectores, lentes, espejos y filtros). 4.​ Sistema electrónico (amplificador-convertidor analógico/digital) 5.​ Sistema informático (software de adquisición / análisis de datos). 1. SISTEMA HIDRÁULICO Un sistema hidráulico transporta las células hacia el centro del láser de una en una. Conduce la suspensión celular a velocidad constante y controlada a través de la cámara de flujo. En la cámara de flujo se produce un flujo laminar al interaccionar dos fluidos, el de la muestra y el de la vaina o envolvente (PBS), que rodea al fluido que contiene la muestra Las células penetran en el centro del fluido de la vaina, pero el PBS y la muestra no se mezclan. La suspensión celular pasa a mayor presión que el fluido. Se establece un flujo hacia abajo y las células salen por el tubo que conecta con la muestra, primero apelotonadas y desordenadas, pero después se alinean hasta quedar en fila de modo que pasen de una en una ante el rayo láser. 2. SISTEMA DE ILUMINACIÓN Consta, en primer lugar, de una fuente de iluminación excitante normalmente fuente láser, que ilumina la muestra. La luz emitida por el láser es una mezcla de longitudes de onda, conocidas como líneas láser. (dibujo apuntes) Los más utilizados son láseres de baja potencia refrigerados por aire (de Argón, λ 488 nm). 3. SISTEMA ÓPTICO A medida que las células o las partículas van atravesando el haz luminoso, este sistema enfoca su iluminación, detectando la luz que dispersan y seleccionando la fluorescencia emitida. Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos: a)​ Señales de dispersión. b)​ Señales de fluorescencia. a)​ Señales de dispersión La dispersión se produce cuando la luz interacciona con una partícula y cambia de dirección (no de longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. La dispersión depende de: -​ El tamaño celular -​ La membrana celular -​ El núcleo -​ El material granular del interior de la célula, llamado complejidad. Podemos ver dos tipos de dispersión. La luz dispersada en un ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Dispersión frontal (se coloca en la ordenadas) Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión. Difracción (tamaño) Refracción (estructura externa) La luz dispersada en ángulo recto 90º llamada SSC (Side Scatter). Dispersión lateral (accisas) Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. + Dispersión. b) Señales de fluorescencia. (marcador) Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante y se produce un cambio de color. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida siempre es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff y nos da una idea de la calidad de un fluorocromo. Mayor diferencia de longitud de onda, menor distorsión. Los fluorocromos más utilizados son la fluoresceína (FITC) con excitación máxima a 495nm y emisión máxima a 520nm, la ficoeritrina (PE) con excitación a 495nm y emisión a 576nm, lo que permite utilizarlos simultáneamente con un láser de 488nm. El fluorocromo empleado dependerá del tipo de láser de que dispone el citómetro, ya que la luz que emita debe tener la longitud de onda adecuada para excitar al fluorocromo. Además, el fluorocromo debe emitir luz de longitud de onda lo más alejada posible de la de excitación, para facilitar su detección. También se pueden emplear fluorocromos combinados, de modo que un fluorocromo se excita con la luz del láser y la luz que emite este es absorbida por un segundo fluorocromo, cuya emisión de luz es la que se mide Además de las lentes, el citómetro tiene filtros que sirven para eliminar y separar la luz recogida. Los filtros son de 2 tipos: -​ Filtros coloreados o de absorción, son filtros de paso y pueden ser: -​ Band Pass: Dejan pasar un rango de longitud de onda. -​ Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda. -​ Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda. -​ Filtros dicroicos o de interferencia, reflejan la luz que tiene una longitud de onda superior o inferior a la que dejan pasar. No absorben la luz la reflejan. 4. SISTEMA ELECTRÓNICO Los detectores son de 2 tipos: -​ Fotomultiplicadores para detección de señales (90º) SSC -​ Fotodetectores diodos para la detección de señales FSC y fluorescencia. Los pulsos detectados por los fotodetectores pasan a un amplificador y después la señal se convierte de analógica a digital. Se puede seleccionar un umbral de señal, de forma que se descartan las señales inferiores. 5. SISTEMA DE ADQUISICIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS Permite la obtención de datos de múltiples parámetros, el análisis en tiempo real de los datos y el análisis de las subpoblaciones seleccionadas. Si las células han sido incubadas con Ac específicos de los diferentes marcadores de membrana conjugados con fluorocromos, la luz láser excita los fluorocromos fijados a las células y los tubos fotomultiplicadores detectan las señales lumínicas emitidas. Se pueden analizar hasta 5, 6 o más marcadores celulares. Los datos se reflejan en forma de histogramas de un parámetro o biparamétricos. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE POBLACIONES CELULARES: Los datos generados por los citómetros de flujo se llaman citogramas o histogramas, y generalmente se presentan sobre un eje de coordenadas X/Y. Pueden ser dibujados en relación a una sola variable (Histogramas monoparamétricos), como es el tamaño de la célula. Como gráficos de puntos= diagramas de dispersión o dot-plot: Son de dos dimensiones y dos o más variables. O incluso en gráficos biparamétricos = diagramas de contornos o contour-plots (curvas de nivel que delimitan el nº de células). Este tipo de gráficos biparamétricos se dividen en cuadrantes. Incluso tridimensionales = Gráficos isométricos (altura= nº de células). Esto va a depender de sus características físicas de dispersión y antigénicas. En estos gráficos podemos delimitar distintas regiones en función de la intensidad de la fluorescencia emitida por las células. Con esto creamos unos subgrupos celulares, llamados “gates”. El “gating” es la separación de estos grupos, normalmente con fines diagnósticos y se usa con mucha frecuencia en el laboratorio. Gráfico CD8/CD3 Podemos distinguir las siguientes poblaciones: -​ Cuadrante superior derecho. Células CD8+/CD3+ (linfocitos Tc). -​ Cuadrante inferior derecho. Células CD8+/CD3- (células NK). -​ Cuadrante superior izquierdo. Células CD8-/CD3+ (linfocitos T CD8-, es decir linfocitosTh). -​ Cuadrante inferior izquierdo. Células CD8-/CD3- (linfocitos B y monocitos) Gráfico CD3/CD4 Podemos distinguir las siguientes poblaciones: -​ Cuadrante superior derecho. Células CD4+/CD3+ (linfocitos Th). -​ Cuadrante inferior derecho. Células CD4+/CD3 (monocitos). -​ Cuadrante superior izquierdo. Células CD4-/CD3+ (linfocitos T CD4-, es decir linfocitosTc). -​ Cuadrante inferior izquierdo. Células CD4-/CD3- (linfocitos B y células NK). MUESTRAS EMPLEADAS Todas las muestras utilizadas para su caracterización por medio del citómetro de flujo CMF deben ser convertidas en una suspensión celular monodispersa (tamaños similares, para lo que se usa un filtro). Irán debidamente identificadas, indicando los datos del paciente, la presunción diagnóstica, el recuento celular diferencial y los resultados de los frotis y la citoquímica realizada. Deben procesarse lo antes posible para evitar la pérdida selectiva de antígenos que caracterizan las células CD. PREPARACIÓN DE SUSPENSIONES CELULARES Es fundamental que la muestra se encuentre en forma de suspensión monodispersa. Esta suspensión debe ser representativa del tejido estudiado, no tener agregados o que sean mínimos, también tener pocos desechos celulares (debris, son células rotas, deshechos) y debe preservar convenientemente las características celulares. Debe haber suficiente muestra celular. Para disgregar el material sólido (como tumores sólidos o muestras parafinadas) podemos emplear métodos mecánicos (haciendo cortes en el tejido) o enzimáticos (tripsina, proteasas, colagenasas o DNAsas) pero estos pueden producir alteraciones de las características celulares o de los Ag de membrana. En ocasiones, es conveniente hacer un enriquecimiento celular de la muestra, sobre todo si vamos a emplear “cell sorting”, es decir, separación de subpoblaciones celulares. El método más empleado es la centrifugación, que se basa en el tamaño y densidad celular (separar poblaciones) Pero también podemos usar la depleción por bolas magnéticas y/o la lisis de eritrocitos. Debemos trabajar siempre a 4 ºC, tratar las células con mucha delicadeza para perder el menor porcentaje posible y filtrar las muestras en filtros de unas 30 micras justo antes de pasar por el citómetro. CALIBRACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD 1.- Calibrado del aparato (láser) empleando un standard o patrón de normalidad (población general, conozco características), con valores determinados de fluorescencia o dispersión de la luz. El estandar puede ser una mezcla de microesferas marcadas con una mezcla de fluorocromos que son excitados por el láser y que emiten fluorescencia detectable por los detectores empleados. Hay microesferas de 3 niveles de intensidad: brillante (bright), medio (mid) y opaco (dim) La calibración se realiza para: -​ Maximizar la resolución -​ Establecer el ruido de fondo para eliminarlo de las mediciones -​ Establecer un nivel o línea de base (con células sin marcar) para la detección de fluorescencia (discriminar población + de población -). Este conlleva una disminución de las interferencias y un aumento de la reproducibilidad. Se debe realizar cada 6 meses o cuando el control diario de un resultado erróneo. 2.- Alineado del láser respecto a la celda de flujo, con los estándares de alineamiento para detectar cambios o problemas en la configuración óptica y en el sistema de señales. 3.- Control de calidad diario: a)​ Control negativo de células sin marcaje para evitar la autofluorescencia de las células, (marcar línea de base) b)​ Control de la especificidad del anticuerpo conjugado que vamos a emplear en el análisis de la muestra. Para ello se emplean los controles isotipo. Controles conocidos para comprobar calidad de reactivos, reproducibilidad y calidad de los métodos de preparación celular. c)​ Control positivo para comparar con nuestros resultados y comprobar que la técnica funciona. Muchos citómetros analizan dos o más señales de fluorescencia, por lo que debemos marcar las células con fluorocromos distintos para poner de manifiesto las propiedades de esas células y detectar las distintas señales sin desviaciones por interferencias entre ellas. Algunos de los fluorocromos más utilizados tienen espectros de emisión que se superponen en cierta medida y, para evitar un error en la cuantificación, los citómetros disponen de un sistema de compensación o sustracción de señal. MANTENIMIENTO DEL CITÓMETRO DE FLUJO ​ Antes de comenzar las determinaciones: ○​ Encender: 1.​ El láser 2.​ La bomba del tanque de la solución de flujo (PBS) 3.​ El ordenador ○​ Esperar a que el citómetro sea detectado ○​ Purgar el equipo (comprobar que no hay burbujas en el circuito) ○​ Comprobar que el tanque de sol. de flujo está lleno (2/3) y el de recogida de la sol. de flujo vacío. ​ Entre determinaciones: ○​ Lavar circuito 1º con lejía diluida (5´) y después H2O destilada. Si no se va a utilizar en 30´, apagar. ​ Al final del día: ○​ Lavar circuito 1º lejía diluida (5´), solución de aclarado y H2O destilada. ○​ Apagar: 1.​ La Bomba del tanque 2.​ El ordenador 3.​ Lo último el láser APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO -​ Contribuye al diagnóstico de tumores por diferenciación antigénica de células y para la detección de la enfermedad mínima residual (EMR) en leucemias agudas en remisión para el diagnóstico precoz de recaídas. -​ Diagnóstico de leucemias y linfomas, entre ellas la leucemia linfoblástica aguda, la causa más frecuente de cáncer en niños. -​ Diagnóstico y clasificación de las inmunodeficiencias primarias Monitorización de enfermedades autoinmunes. -​ Cuantificación en sangre periférica de los linfocitos CD4+ y CD8+, que aporta un valor diagnóstico y pronóstico en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). -​ Cuantificación de ADN y ARN. -​ Realización de un cariotipo de flujo, como complemento a los métodos clásicos de estudio de los cromosomas en metafase. CELL SORTING Es un proceso de separación celular por citometría de flujo. La clasificación comúnmente utilizada de la citometría de flujo se conoce como clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se emplean unos aparatos especiales en los que se realiza una separación física de las células o partículas, en función de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo convencional. La separación se puede hacer por métodos mecánicos, hidraúlicos o electrostáticos. Los sistemas electrostáticos fraccionan la muestra en pequeñas gotas mediante un sistema de vibración. Cada una de estas gotas lleva una sola célula o está vacía. Si el sistema detecta que en esa gota hay una partícula o célula deseada, le aplica una corriente eléctrica que desvía la trayectoria de la partícula para que caiga en un tubo recolector determinado. Las gotas que llevan partículas no deseadas caen en una trayectoria recta que las lleva a un tubo recolector para desecharlas.