Manipulation et étude des protéines PDF

On commence par la purifier. Elles sont présentes dans les cellules, et il faut la séparer des autres protéines. Ainsi, on peut déterminer plus facilement sa structure, sa fonction....

On commence par la purifier. Elles sont présentes dans les cellules, et il faut la séparer des autres protéines. Ainsi, on peut déterminer plus facilement sa structure, sa fonction. Manipulation et étude des protéines Purification Quantification Séquençage Détermination de la structure Détermination de la masse  Purification des protéines Pour etre séparées des autres, il faut mettre les protéines en solution. Toutes les protéines cellulaires ne sont pas présentes Pour être purifiées, les protéines dans tous les tissus, les organes. Il faut donc faire son doivent être en solution prelemevent en fonction de la localisation. On homogénéise en séparent les cellules les une des autres de notre prélèvement. Pour accéder au matériel intracellulaire, et donc la protéine, on lyse la cellule. On ne - Protéines extracellulaires en réalise pas la même centroguatuon en fonction de la solution dans le plasma sanguin : localisation. 1) Centrifuger le plasma 2) Récupérer les protéines dans le surnageant - Protéines cellulaires : 1) Prélever un fragment d’organe 2) Homogénéiser 3) Lyser les cellules de manière douce 4) Centrifuger à la vitesse qui convient en fonction de la localisation de la protéine La centrifugation est une première étape dans la purification car elle permet d’enrichir la préparation en protéine d’intérêt tout en éliminant les matériaux indésirables  Purificación de proteínas Centrifugation par gradient : on ne met pas n importe liquide, mais un liquide avec une certaine densité. Les choses plus denses que le liquide utilisé sont au fond du tube. Cette centrifugation permet de séparer les éléments en fonction de leur densité : on utilise pour des protéines très denses ou peu denses. Utilisation d’un gradient de concentration (ex : un gradient de sucrose) - Vitesse de sédimentation dépend de la différence entre la densité de la particule et la densité du solvant Si d(particule) > d(solvant) → sédimentation On récupère les différentes phases dans des tubes différents pour isoler les composés différents. La centrifugation sur gradient permet séparer des composés de densités différentes ’  On peut aussi séparer les protéines en utilisant la Chromatographie chromatographie. Cela repose sur l utilisation de deux phases : une immobile (billes par exemple) qu on met dans une colonne de chromatographie, et une mobile (liquide, gazeux). On dépose l échantillon avec beaucoup de protéines sur le sommet Technique permettant de séparer un de la phase immobile et la plaque liquide traverse le système. mélange de protéines Les protéines vont progresser à des vitesses différentes (qui dépend de leurs propriétés), ce qui permet de les séparer. 2 phases : -une phase immobile (par exemple du papier, un gel poreux, des billes etc) - une phase mobile (gaz ou un liquide). On dépose l’échantillon au sommet de la colonne puis on ajoute la phase mobile. Les protéines migrent avec la phase mobile. La vitesse de migration des protéines dépend de leurs propriétés ce qui permet de séparer les protéines. ’ ’ ’  Chromatographie d’échange d’ions Dans la colonne, on met des billes chargés (ici négativement) = phase immobile. Puis on verse le mélange sur la phase immobile. Les protéines cont être entraînés dans la colonne : la vitesse dépend des Séparation de protéines suivant leur caractéristiques des protéines (ici de la charge). Ici, les CHARGE billes qui sont chargés positivement vont interagir avec les billes et vont donc avoir des difficultés à traverser - Phase immobile = polymère chargé la colonne. Si on cherche à récupérer les protéines qui sont restées coincés par compétition : on ajoute de (billes) l eau salée (Na+ et cl-). Les ions (ici, Na+) vont - Phase mobile = solution aqueuse remplacés les protéines chargées positivement, les tamponnée protéines se décrochent donc et on peut alors les récupérer. → Les molécules neutres ou portant la La charge des protéines dépend du pH, on peut donc même charge que celle de la phase jouer sur des variations de pH pour récupérer ce que immobile sont éluées. Celles de signe l on recherche. contraire restent dans la colonne. Ici, on a une chromatographie d échanges de cations = les billes retiennent les cations. → Récolte des protéines retenues dans la colonne par « compétition » : ajout d’un sel par ex : NaCl NB. La charge d’une protéine dépend du pH. Variation du pH → séparations très différentes. Une résine échangeuse de cations retiendra préférentiellement les cations (charges+) ’ ’ ’  Chromatographie d’exclusion La phase immobile est un polymère poreux, c est à dire des billes avec des petits trous. Les petites protéines vont avoir tendance à réagir avec les billes et à être retenue. Alors que les plus grosses protéines sont traverser Séparation de protéines suivant leur rapidement la colonne. TAILLE Cette méthode est l inverse de l electrophorese. -Phase immobile = polymère poreux (billes) Le temps de rétention est le temps qui s écoule entre le dans la colonne dépôt de la protéine et la sortie de la colonne. Dans ce -Phase mobile = solution aqueuse tamponnée cas, le temps de rétention d une grosse molécule est beaucoup plus faible que celui d une petite molécule. Les petites molécules entrent dans les pores du polymère ce qui freine leur élution alors que les protéines plus volumineuses passent dans les espaces qui existent entre les billes. → Les grosses molécules atteignent donc le bas de la colonne en premier → Récolte de différentes fractions dans des tubes différents Le temps entre dépôt et sortie de la colonne = le temps de rétention. ’ ’ ’ ’ ’ ’  Il existe une relation entre le temps de rétention et la masse de la protéine. Le temps de rétention est inversement proportionnel à la taille des protéines. La masse d’une protéine est liée à sa taille donc cette méthode permet une estimation approximative de la masse moléculaire des protéines de chaque fraction. NB. Intérêt de ce type d’approche dans le milieu biomédical : Il est également possible de séparer des protéines suivant leur taille par dialyse.  Chromatographie d’affinité Ici, la phase immobile a à sa surface le ligand de la protéine qui nous intéresse. Donc les protéines qui ont une grande affinité avec le ligand va s associer avec ce dernier et va rester dans la colonne. Pour utiliser cette Capture des protéines par leur LIGAND méthode, il faut connaître le ligand de la protéine étudiée. - Phase immobile = ligand de la protéine La protéine qui nous intéresse reste donc dans la colonne. Il faut donc décrocher la protéine en utilisant la d’intérêt fixé par liaison covalente à la compétition : on ajoute une solution qui contient le ligand. colonne La compétition est donc entre les ligands en solution et - Phase mobile = solution aqueuse ceux associés aux billes. tamponnée L association entre une protéine et son ligand se fait par liaisons faibles, ce qui est dynamique et permet le « changement » de ligand → Les protéines d’intérêt sont capturées par la colonne car elles s’associent à leur ligand → Récolte des protéines retenues dans la colonne par « compétition » : ajout d’une grande quantité de ligand soluble → les protéines peuvent se dissocier du ligand fixé à la colonne et s’associer à ce ligand soluble → les protéines sont éluées sous forme de complexe protéine-ligand ’ ’  Ici la phase immobile est constituée de billes Chromatographie liquide à haute performance HPLC incompressibles qui résistent à la pression. On va appliquer une pression, ce qui entraîne une augmentation (high performance liquid chromatography) de la vitesse du flux et la résolution de séparation. Cette méthode est plus rapide et précise = technique très puissante Même principe que la chromatographie classique sauf que : - Phase immobile = microbilles incompressibles de silicate ou d’alumine → Augmente la vitesse de flux → Améliore la résolution de la séparation  Technique très puissante  L’électrophorèse L elevtrophirese dépend de l utilisation d un gel, et de l application d un champ électrique, ce qui permet la migration des particules chargés (ADN par exemple). L’électrophorèse permet la migration de particules CHARGÉES dans un CHAMP ÉLECTRIQUE. La distance de migration dépend de la vitesse de migration Gel après migration et coloration au bleu de Coomassie ’ ’ ’ ’ ’  Le SDS est un facteur dénaturant. Le SDS est chargé L’électrophorèse SDS-PAGE négativement : quand on l utilise, la protéine perd sa structure tridimensionnelle, et plusieurs molécules de SDS vont s associer aux protéines dénaturés, ce qui la SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) submerge de charges négatives. SDS : agent dénaturant apportant des charges négatives. Le but de l électrophorese est que les protéine migrent Il se lie aux protéines et submerge les charges des protéines. selon leur taille et pas de leurs charges. Le SDS est donc → Toutes les protéines sont accélérées avec la même force quelle que soit leur charge de aussi intéressant pour faciliter la migration des protéines départ. (car elles ne sont plus compactes) et que toutes les protéines soient accélère avec la même force peu importe la charge de départ. Ainsi, les plus petites molécules vont En revanche, elles seront séparées suivant leur taille se déplacer plus vite que les grosses. → les petites protéines se déplacent plus vite que les grosses. L’analyse de la distance de migration peut donc indiquer la taille d’une protéine. Pour qu une protéine migre correctement, elle doit avoir perdu sa structure tridimensionnelle, avec l aide d un SDS agent dénaturant (qui rompt les lissions faibles). Mais p attention, il n y a pas que des liaisons faibles : il y a aussi Protéine dénaturée et submergée de charges négatives des ponts désulfurés (covalences) = il faut donc un autre élément pour dénaturer complètement (un agent Protéine native réducteur) NB: Si la structure 3D de la protéine est également stabilisée par des ponts disulfures, il faudra compléter ce traitement par l’utilisation d’agents réducteurs pour rompre les ponts disulfures. ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’  L’électrophorèse SDS-PAGE In utilise toujours un marqueur (pourquoi ?). Plus la masse est importante, plus la vitesse de migration est faible On obtient deux information : la qualité de la purification - Le nombre de bandes (si à la suite de la purification, on peut faire cette apparaissant sur une méthode pour savoir si ça a bien fonctionner ou pas = le électrophorèse SDS-PAGE nombre de bandes sur la colonne…) permet l’évaluation qualitative On peut aussi faire test quantitatif : plus la bande est d’une purification. intense, plus on a réussi à purifier de protéines. Il est important d utiliser un révélateur (bleu de - L’épaisseur des bandes permet comassie) car la plupart des protéines sont une évaluation quantitative transparentes) Révélation des protéines par utilisation du BLEU DE COMASSIE ’ ’  L’électrophorèse SDS-PAGE Elle peut nous donner des informations sur la présence des protéines en fonction des contions de la cellule (normale, ou bien des chocs thermiques, des modifs de pH) Ici, on observe une modification du profil des protéines en fonction de la condition On peut aussi déterminer le poids moléculaire des protéines : e n est pas très précis, mais ça donne un ordre de grandeur. - L’analyse d’une électrophorèse SDS-PAGE permet de comparer la présence en protéines dans des cellules soumises à des conditions différentes. - Permet aussi de déterminer le poids moléculaire d’une protéine. Révélation des protéines par utilisation du BLEU DE COMASSIE ’  Détermination du poids moléculaire d’une protéine On peut d abord utiliser un marqueur. On dépose la protéine qui nous intéresse puis on mesure la distance La distance de migration sur électrophorèse SDS-PAGE est directement liée à la taille de migration. On peut ensuite faire un graphique de la des protéines et donc à leur masse. L’utilisation de marqueurs de taille (= protéines taille de la protéine en fonction de la migration dont on connaît la taille) permet de déterminer le poids moléculaire d’une protéine. L’électrophorèse est une méthode de choix pour séparer des mélanges complexes de protéines et pour estimer le poids moléculaire des protéines inconnues. ’  Rupture de ponts dissulfures : le DDT, un exemple d’agent réducteur  Isoélectrofocalisation Si on met des protéines à pH très acide, elles sont chargés positivement et inversement. Quand on plonge une protéine et qu elle est neutre, le PH est dit isoelectrqiue. Ce point permet la séparation Séparation des protéines en fonction de des protéines (car chaque protéine a des pi LEUR POINT ISOELECTRIQUE (PI) différentes). Les protéines arrêtent de migrer quand elles sont La charge nette des protéines dépend du pH. neutres, donc quand elles sont au point isoélectrique. Au point isoélectrique, une protéine soumise à On peut utiliser une protéine purifiée pour déterminer la un champ électrique ne migre pas. valeur du pi de la protéine. → un tube avec gradient de pH est soumis à un champ électrique : chaque protéine migre jusqu’à la zone de pH où elle ne porte pas de charge électrique, cad son point isoélectrique. 2 applications : -Séparer des mélanges complexes de protéines, en fonction de leur PI -Déterminer le PI d’une protéine purifiée mais inconnue. ’  Electrophorèse bidimensionnelle On peut aussi combiner plusieurs méthodes : isoelectrofocalisation pour séparer les protéines en Séparation des protéines en fonction de leur PI fonction de leur charge, et à partir de ce gel, on fait une et de leur taille lectriphorese SDS. Cela permet donc de séparer les protéines qui ont un même pi en fonction de leur taille. 1)Isoélectrofocalisation → migration des protéines Ainsi, on obtient une electrophirese bidimensionnelle jusqu’à leur PI 2)Electrophorèse SDS-PAGE→ migration des Cette méthode est très puissante : donc chaque point protéines en fonction de leur taille qu on obtient bien à une seule protéine donnée. Les points différents dans deux conditions de culture cellulaire différentes, on peut en déduire les protéines qui sont impliqués dans l apoptose et le cycle cellulaire. ’ ’ Manipulación y estudio de proteínas Purification Quantification Séquençage Détermination de la structure Détermination de la masse  L’électrophorèse SDS-PAGE - L’épaisseur des bandes permet une évaluation quantitative peu précise Révélation des protéines par utilisation du BLEU DE COMASSIE  Spectrophotométrie Certains acides aminés aromatiques absorbent à une certaines longueur d onde (280nm). Plus la valeur d absorbante, plus l échantillon contient de protéines en général (pas une en particulier) Longueur d’onde : 280 nm Limite : ne permet pas de déterminer la quantité d’une protéine d’intérêt contenue dans un mélange de protéines (protéine non purifiée) ’ ’ ’  Immunodétection : ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Pour éviter la purification (qui est peu sûre) pour connaître la quantité d une seule protéine, on fait un test Quantification d’une protéine d’intérêt grâce à DES ANTICORPS (Ac) Elisa qui est basé sur l utilisation d anticorps. ELISA sandwich direct 1) Ac de capture adsorbé sur la plaque. Il reconnaît spécifiquement la protéine d’intérêt 2) Lavage des Ac de capture non adsorbés 3) Ajout de l’extrait contenant la protéine d’intérêt 4) Lavage des constituants de l’extrait non retenus par les Ac de capture 5) Ajout de Ac de détection spécifique de la protéine et qui est couplé à une enzyme 6) Lavage pour enlever les Ac de détection non fixés à la protéine. 7) Ajout du substrat de l’enzyme : réaction colorimétrique entre le substrat et l’enzyme 8) Quantification de la coloration → Détermination précise de la quantité en une protéine d’intérêt d’un échantillon ’ ’ ’  Immunodétection : ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Quantification d’une protéine grâce à DES ANTICORPS (Ac) Protéine d’intérêt ELISA sandwich direct Ac de détection spécifique de la protéine et couplé à une enzyme  Immunodétection : ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Quantification d’une protéine grâce à DES ANTICORPS (Ac) Substrat Ac IIaire Protéine Ac Iaire Protéine d’intérêt d’intérêt Ac de capture ELISA ELISA sandwich sandwich direct indirect  Immunodétection : ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Quantification d’une protéine grâce à DES ANTICORPS (Ac) Substrat Substrat Ac IIaire Enzyme Ac Iaire conjugué Ac Iaire Protéine d’intérêt ELISA ELISA direct indirect  On a séparé les éléments en fonction de la masse, mais maintenant, on cherche à identifier la protéine. Pour cela, on utilise l utilisation d anti-corps (un ac est spécifique à une protéine). Si l ac réagit avec la protéine qu on suspecte (par exemple caspase 3), alors il s agit de la protéine en question. Dans un premier temps, il faut faire sortir les protéines du gel. Révélation des protéines par utilisation du BLEU DE COMASSIE ’ ’ ’ ’ ’  Immunodétection : Immunoblot On transfère les protéines du gel sur une membrane en appliquant un champ électrique : les prots sortent donc du gel, et se dépose à la SURFACE de la membrane. On Transfert des protéines dispose des Ac, et s il s agit du bon ac, il y aura une Echantillon depuis le gel jusqu’à une réaction avec les prots, puis on révèle les résultats. membrane (champ électrique) Electrophorèse (SDS-PAGE) Anticorps Marquage grâce aux anticorps Révélation des résultats ’ ’  Immunodétection : Immunoblot Si l ac s est associé à quelque chose, on observera des bande. On peut donc visualiser la protéine d intérêt dans avoir besoin de la purifier. Visualisation d’une protéine grâce à des ANTICORPS 1)Electrophorèse SDS-PAGE 2)Transfert des protéines sur une membrane (par application d’un champ électrique) 3)Saturation de la membrane (ajout par ex de lait) 4)Ajout de l’anticorps primaire qui reconnaît spécifiquement la protéine d’intérêt 5)Lavage 6)Ajout de l’anticorps secondaire qui reconnaît l’anticorps primaire (étape d’amplification du signal) et qui est détectable facilement. → Visualisation précise de la protéine d’intérêt sans nécessité de purifier l’échantillon ’ ’ ’ Manipulation et étude des protéines Purification Quantification Séquençage Détermination de la structure Détermination de la masse  Séquençage d’Edman Détermination de la nature, de l ordre, et du nombre (dégradation d’Edman) des aa d une protéine. Dans cette méthode, on fait réagir la protéine avec le Séparations successives des aa d’une protéine gros machin : association du gros machin avec le premier aa de la protéine en présence d oh- (pH 3 étapes : basique) = couplage en milieu basique. 1) Couplage en milieu basique : Le clivage se fait en milieu acide (avec la présence de H+). Il y a une rupture de la liaison peptidique entre Le réactif réagit avec l’amine du résidu amino- le premier et le deuxième aa. terminal 2) Clivage en milieu acide : Ensuite, on convertit d instable en stable. Et enfin, on Réaction entre le soufre et le groupement carbonyl détermine par chromatographie quel est le premier de la 1ère liaison peptidique et rupture de la liaison aa de cette chaîne polypeptidique. Puis on réalise peptidique cette méthode avec tous les autres aa de la chaîne → la chaine polypeptidique est raccourcie d’un résidu polypeptidique. 3) Conversion L’aa-ATZ est converti en aa-PTH (stable) Cette méthode est limitée parce que ce cycle peut pas se faire indéfiniment (que une vingtaine de fois, ce qui est faible par rapport à la taille de la protéine) Identification de l’aa-PTH par chromatographie (comparaison des temps de rétention). Le 1er cycle permet donc l’identification de l’aa N-terminal d’une protéine. Le cycle peut recommencer une vingtaine de fois → Séquençage d’une vingtaine d’aa ’ ’ ’ ’  Digestion par protéases On commence par utilise des proteases qui clive les protéines, mais a des sites spécifiques (certains aa) Les protéases clivent les protéines au niveau de site de clivages déterminés - Ex : trypsine clive les protéines après les résidus lysine et arginine Arginine Lysine Lysine Extrémité Extrémité amine carboxyle  D abord, on doit hydrolyser la protéines pour séparer les différents aa qui sont présents dans la protéine. On identifie chaque aa et combien de fois on le rencontre. Dans cette exemple, on a trois points de coupures et quatre fragments si on utilise la trypsin. Et si on utilise le bromure Séquençage de cyanogene, on obtient trois fragments. des Seul l’aa N-terminal est modifié Il est important de savoir quelle est le premier aa en protéines utilisant le FDNB. Il va réagir avec le premier aa et le modifier. Ensuite, on hydrolyse la protéine ? Ici, le premier aa est le glutamate (E). On fait perdre la structure tridimensionnelle et un morceau de la prot est soumis à la trypsine et un soumis au bromure cyanogene. Les fragments obtenus de la trypsine, on cherche le E, c est à dire au premier fragment de la protéine. On fait pareil avec le bromure de cyanogene. Donc T2 et C1 sont les premiers fragments Grâce aux deux proteases, on va pouvoir ré déterminer la séquence de la protéine ’ ’ Manipulation et étude des protéines Purification Quantification Séquençage Détermination de la structure Détermination de la masse  Détermination de la conformation des protéines par Cette méthode peut être utilisée que par des spécialistes. Ça n est que pour la culture générale. diffraction aux rayons X Etapes de la détermination de la conformation Cristallisation des protéines par rayons X : 1) Cristallisation de la protéine : après purification de la protéine en solution aqueuse, on ajoute un agent précipitant. 2) Enregistrement de la figure de diffraction obtenue lorsque les cristaux de protéines sont soumis aux rayons X. La figure de diffraction ne donne pas d’informations directes sur le positionnement des atomes de la protéine mais Figure de Carte de la densité donne des indications sur la densité électronique. diffraction électronique 3) Un traitement mathématique des informations sur la densité électronique permet d’obtenir une carte de la densité électronique de la molécule 4) La carte, associée à la connaissance de la séquence de la protéine, permet de proposer des modèles de la protéine 5) La structure au sein d’un cristal reflète la forme de la protéine en milieu aqueux, ce qui permet de proposer ensuite une conformation possible de la protéine en milieu naturel. modèle de la Proposition de protéine conformation ’ Manipulación y estudio de proteínas Purification Quantification Séquençage Détermination de la structure Détermination de la masse  Spectrométrie de masse Cette méthode est pour connaître le poids exact de la protéine, car le temps diffère même au sein d une Détermine la masse des même protéine (avec groupement phosphate par exemple). Ça repose sur l application d un champ protéines avec précision d électrique sur des protéines. Cela permet de projeter les protéines sur un détecteur. Le temps qui s écoule Accélération des particules et entre le départ et l arrivée du détecteur dépend de sa détermination du temps de vol masse. Quand on étudie une protéine inconnue, on peut Applications : découper la protéines en fragment et la projeter. On compare ensuite cette vitesse avec des protéines -Protéine connue : connues, pour déterminer notre protéine. Déterminer s’il y a des modifications post- traductionnelles (glycosylation..) -Protéine inconnue : 1) Fragmentation de la protéine par clivages spécifiques (protéases) 2) Comparaison des résultats de spéctro obtenus sur ces fragments avec ceux de fragments connus → identification de la protéine ’ ’ ’ ’ ’ ’