Handout Methoden der Biochemie II 2024 PDF

Methoden der Biochemie 2 25.10.2024 B. Beatrix (AG Beckmann)  2 Gershenson & Gierasch_Curr OpinStruct Biol_2011 Wiederholung: Proteinreinigung Gängige Chromatographie Techniken  Isoelektrischer Punkt Der isoelektrische Punkt (IEP...

Methoden der Biochemie 2 25.10.2024 B. Beatrix (AG Beckmann)  2 Gershenson & Gierasch_Curr OpinStruct Biol_2011 Wiederholung: Proteinreinigung Gängige Chromatographie Techniken  Isoelektrischer Punkt Der isoelektrische Punkt (IEP oder pI) ist der pH-Wert, an dem die Zahl der positive (welche AS ?) und negative Ladungen (welche AS ?) eines Proteins im statistischen Mittel genau gleich ist. Kation Austauscher Chromatographie Negative Ladung in der stationären Phase (Säulenmaterial, Matrix) Proteine mit positiver Nettoladung beim verwendeten pH Wert binden (beachte pI) Elution mit Salzgradient oder (seltener) pH Wechsel der mobilen Phase abhängig von der Stabilität des zu reinigenden Proteins Anionaustauscher Chromatographie folgt dem gleichen Prinzip Der “LOAD” sollte eine niedrige Salzkonzentration aufweisen Elutionsprofile https://www.cytivalifesciences.com/en /us/support/handbooks Reinigung anspruchsvoller Proteine Membranproteine 20% aller Gene des humanen Genoms (ca. 32.000 Gene) kodieren für Membranproteine Begrenztes Wissen: PDB (Protein Data Bank) – PDB: gestartet 1971 mit 7 (!) Kristallstrukturen – PDB: Okt. 2024 ca 226.262 Einträge (ca. 188.523 x-ray, 14.395 NMR, 22.987 Electron Microscopy) – Membranproteine: total 7952, α-helikale (4347), β-Barrel (1048), monotopische (1735) – 50% aller Drug-Targets sind Membranproteine (Transporter, Rezeptoren, “Anker”, Enzyme) 1960; PDB: 1mbn; aus Pottwal Muskel  Klassifizierung von Membranproteinen (Periphäre und Integrale) 3 1. Single α-helix membrane -spanning protein 2. Multiple α-helix membrane-spanning protein transmembrane proteins 3. Rolled up β-sheet (β barrel) 4. Membrane proteins with an amphiphilic helix integral membrane proteins 5. Lipid-linked membrane proteins 3 6. Oligosaccharide-Linker (GPI) membrane proteins 7. and 8. Membrane-associated proteins are attached to the membrane solely by noncovalent interactions with integral membrane proteins -peripheral proteins Purpurbakterien Anoxygene Photosynthese Klassifizierung von Membranproteinen (Trans-, integrale und periphäre) Transmembranproteine: 1, 2und 3 Integrale Membranproteine: 4, 5 und 6 Periphere Membranproteine: 7 und 8 (nur über Protein-protein-Wechselwirkung) Transmembranproteine α-Helices Right handed helix H-bond between every 4th peptide bond Complete turn every 3.6 amino acids Hydrophobe α Helices in Transmembranproteinen Die Membranhelix besteht aus hydrophoben (oder ungeladene) Aminosäuren. Hydrophobe Seitenketten > van der Waals Interaktionen mit den Fettsäure-Acylketten Polare carbonyl (C=O) und Imino (NH) Gruppen der Peptidbindungen sind in H-H- Brücken involviert. Flankierende positive Aminosäuren verankern die Helix in der Membran. Lodish et al. Molecular Cell Biology 4th ed. “Seven-spanning” Membran Proteine Bacteriorhodopsin Lodish et al. Molecular Cell Biology 4th ed. β-sheets häufiger seltener β-Barrel Proteine (Porins) In der äußeren Membran von E. coli In der äußeren Membran von Mitochondrien und Chloroplasten Vornehmlich polare Aminosäuren, keine langen hydrophoben Segmente (wie bei α helikalen MP) Oft Homotrimere Gerad-zahlige β sheets (8 bis 22) bilden Faß-ähnliche Struktur mit zentraler Pore Aliphatische Seitenketten und ein Band aus aromatischen Seitenketten positionieren das Porin in der Membran Porin innen hydrophil – aussen hydrophob erlauben passive Diffusion z.B. von Zuckermolekülen Lodish et al. Molecular Cell Biology 5th ed.  Detergenzien amphipatische Moleküle polarer “Kopf” und aliphatischer oder aromatischer “Schwanz” selbst wasserlöslich ermöglichen die Dispersion Wasser-unlöslicher, hydrophober Komponenten in wässrige Lösungen Niedrige Konzentrationen >> Monolayer an der Luft-Flüssigkeits-Interphase Hohe Konzentrationen > Detergenz-Monomere bilden “Micellen” Micellen sind thermodynamisch-stabile kolloidale Aggregate von Detergenz Monomeren – Unpolare Enden zeigen nach Innen  Detergenzien Kopfgruppe > Klassifizierung – Ionisch – nicht-ionisch – zwitterionisch (ampholytisch) Ionische Detergenzien gelten als biologisch grob oder scharf, weil sie häufig die Proteinstruktur modifizieren Nicht-ionische Detergenzien gelten als eher mild, da sie die native Proteinstruktur eher intakt halten. Zwitterionische Detergenzien sind weniger denaturierend und haben keine Nettoladung. Sie unterbrechen Protein-Protein Interaktionen und reduzieren Aggregation effizienter als nicht- ionische Detergenzien. Detergenzien: physikalische Eigenschaften CMC : “critical micelle concentration” = Konzentration, ab der Micellen ausgebildet werden (Salz abhängig!!!) Aggregationszahl = Ø Anzahl der Detergenzmoleküle pro Micelle CMT “critical micelle temperature” = Temp, bei der Micellen nahe oder oberhalb der CMC aggregieren und eine separate Phase bilden (Cloud point)  Unterscheidung periphere und integrale Membranproteine Alkalische Carbonat Extraktion (Na2CO3, pH11,5) – Durch alkalischen pH werden Membranen zerstört – Vesikel > offenen “membrane sheets” > können abzentrifugiert werden – Löslicher Inhalt von Vesikeln und peripher Membran-assoziierte Proteine bleiben im Überstand – Integrale und Transmembranproteine verbleiben im Pellet Trition X-114 Phasentrennung – Nicht-ionisches Detergenz > bildet homogene Lösung bei 0°C – Phasentrennung in wässrige Phase und Detergenz-Phase bei Temperaturen oberhalb von 23 °C (cloud point) – Löslicher Inhalt von Vesikeln und peripher Membran-assoziierte Proteine gehen in die wässrige Phase – Integrale und Transmembranproteine verbleiben in der Detergenzphase  CMC – “Daumenregeln” Detergenzien mit hohen CMC-Werten zeigen eine schwächere Bindung →sind daher leichter wieder zu entfernen Detergenzien mit niedrigen CMC-Werten bilden stabilere Micellen (nur langsamer Molekül-Austausch) CMC und Aggregationszahl werden durch Temperatur, pH, Ionenstärke und Reinheit beeinflusst (Analyse Methode)  Solubilisierung von Membranproteinen Below CMC Above CMC Zur Solubilisierung von Membranproteinen werden Detergenzien bei ihrer 1 bis 3-fachen CMC verwendet. Alle Puffer sollten das Detergenz oberhalb der CMC enthalten. Welchen Einfluss haben Detergenzien auf die Anfangs beschriebenen Chromatographie- Methoden ?  Reinigung von Membranproteinen Chromatographie – Ionische Detergentien nicht mit Ionenaustauschern – Detergenzien können partiell Proteinladung maskieren > schwache Bindung an Ionenaustauscher – Größenausschlußchromatographie > Micelle vergrößert Mw – Absorption durch Detergenz (Detektionsprobleme) Detergenzwechsel kann sinnvoll sein Dialyse für Detergenz-Wechsel Biobeads für Detergenz-Wechsel (neutrale, makroporöse Polymer Beads)  Amphipole Amphipathische Polymere Stark hydrophiler “Backbone” mit verschiedenen hydrophoben Ketten Amphipols Detergenzmoleküle sind im konstanten GGW zwischen Monomer und Micelle, daher muss die Konzentration immer oberhalb der CMC sein >> Inaktivierung von Membranproteinen Biobeads Idee: Molekül entwerfen, das extrem hohe Affinität zur hydrophoben Proteinoberfläche hat Protein Translokation über die Membran des Endoplasmatischen Reticulums (ER) Eucaryotic cell RNC-Translokon Rekonstitution in Detergenz Der monomere Sec61 Komplex umgeben von einer gemischten Lipid/Detergenz Micelle Sec61 Phospholipid Detergenz naszierende Kette / Signalsequenz sind zum Teil in der Tunnelöffnung sichtbar Kaum konformationelle Unterschiede im Vergleich zum geschlossenen Translokon Ist das Translokon unter diesen Bedingungen überhaupt aktiv ???  Visualisierung des Sec Komplex in Becker et al., Science 2009 der nativen Lipidumgebung!  Rekonstitution in Membranvesikel Untersuchung des isolierten Membranproteins in “natürlicher” Membranumgebung  RNC-Translokon Rekonstitution in Nanodiscs a b Apolipoproteine = Proteinanteil der Lipoproteine, die wasserunlösliche Lipide im Blut transportieren.  Cryo-EM Struktur des SecYEG Komplexes aus E. coli eingebettet in eine Nanodisc a nur eine Kopie von SecYEG wurde in der Nanodisc identifiziert (>Monomer) Naszierende Kette ist sichtbar Molekulares Model für Nanodisc, Sec YEG und das 70S Ribosom konnten erstellt werden Frauenfeld et al., NSMB 2011 Makromolekulare Proteinkomplexe Wie kann man sie isolieren ? Wie kann man sie charakterisieren ? Makromolekulare Komplexe Tap-fusion: Tandem-Affinity Purification  Protein A Oberflächen Protein aus Staphylococcus aureus Bindet IgGs, heavy chain im Fc Teil  Calmodulin bindendes Peptid Calmodulin (CALcium-MODULated proteIN) ist ein intrazellulärer “Allzweck” Calcium Rezeptor Beteiligt an Calcium regulierten Prozessen Ca2+ Bindung >> Konformationsänderung Calmodulin hat selber keine enzymatische Aktivität, bindet aber in Abhängigkeit von Ca2+ an z.B. Kinasen  Makromolekulare Komplexe Tap-fusion: Tandem-Affinity Purification Entfernung von TEV Protease und weitere Kontaminationen Vorteile ? Vorteil: Nachteile ? Physiologische [Salz] Physiologischer pH Protein-Protein Interaktionen Two Hybrid Systeme Pull-down Assays Analytische Ultrazentrifugation Surface Plasmon Resonance (SPR) Thermophorese Isotherme Kalorimetrie (ITC) Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX)  Two Hybrid Systeme Wurde für Hefe Zellen entwickelt Benötigt werden – Sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor – DNA-bindende Domäne (BD) – Transkriptions-aktivierende Domäne (AB) – Müssen getrennt stabil sein – Reportergen, das Bindestelle für BD in seiner “Upstream activation site” (UAS) aufweist  Two-Hybrid Systeme Beute Köder Split YFP Read out über Fluoreszenz “Reportergen” Yeast-Two-Hybrid Systeme trp his leu ura ade  Pull-down Assays Fusion mit Glutathion-S-Transferse Kann unter den verschiedensten Bedingungen getestet werden: pH, Salz, +/- ATP, etc. Charakterisierung von Protein-Protein- Interaktionen wie stark ist die Interaktion ? wie schnell dissoziieren die Proteine voneinander ? wie werden diese Parameter durch – Proteinmodifikationen – kleine Moleküle – andere Proteine beeinflußt ?  Analytische Ultrazentrifugation In 1920er Jahren konstruiert Theodor Svedberg (Nobelpreis für Chemie 1926) max. rpm 70K > 350.000 fache Erdbeschleunigung Rotor dreht in Vakuumkammer gemessen wird Referenz gegen Proteinlösung Ortsaufgelöstes Konzentrationsprofil innerhalb der Messzelle wird kontinuierlich bestimmt (Absorptionsmessung)  Analytische Ultrazentrifugation Sedimentation Velocity Experiment Bestimmung des Sedimentations Koeffizienten Direkt abhängig von der Masse des Partikels  Surface Plasmon Resonance (SPR) Prisma Diodenarray Detektor Leuchtdiode kontinuierliches Flußsystem Biosensor-chip besteht aus Glasoberfläche mit dünnem Goldfilm Polarisiertes Licht wird von der Goldoberfläche reflektiert und erzeugt in der Goldschicht eine Oberflächen Plasmon Resonanz. Der Biosensor misst die Masseveränderung, die während der Interaktion des mobilen mit dem immobilisierten Bindungspartner auftritt Bindung von Molekülen verändert Refraktionsindex >> Änderung des Resonanzwinkels Surface Plasmon Resonance (SPR) Äquilibrium Anfangs viele Bindestellen  Microscale Thermophoresis Infrarot Laser Laser induziert definierten Temperatur-Gradienten Proteine zeigen charakteristische Wanderung im Temp-Gradienten Änderungen in der Hydrathülle verändern Wanderungsverhalten Beobachtung über einen Fluoreszenz-markierten Bindungspartner Vorteile: keine Immobilisierung notwendig wenig Material kleine Probenvolumina (10 µl)  Microscale Thermophoresis Infra red Laser Laser ON Laser OFF Fluorescence time Relative mobility = Fhot/Fcold Fluorescence detector 64 Thermophrese: Bindung von NAC an 80S Ribosomen 65  ITC-Isothermal Titration Calorimetry Jede Reaktion ist mit Enthalpie- Änderung (ΔH) verbunden Wärme wird an die Umgebung abgegeben (exotherm) oder von ihr aufgenommen (endotherme Reaktion) Universelle Eigenschaft, die unabhängig ist von der Größe der Moleküle Benötigt keine Immobilisierung oder Markierung ITC kann simultan alle Bindungsparameter direkt bestimmen (ΔG, ΔH, ΔS und Kd) ITC-Isothermal Titration Calorimetry Negative Heizleistung also exotherm Reaktionsenthalpie -12 kcal/mol Praefcke & Hermann, Biospektrum 1/2005 Im Überschuss  Kcal / mol injizierter Ligand Molares Verhältnis Protein/Ligand ΔG = -RTlnKa = ΔH-TΔS Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry https://mvsc.ku.edu HDX - ligand binding http://msr.dom.wustl.edu/  Zusammenfassung Membranproteine benötigen den Einsatz von Detergenzien für ihre Reinigung Detergenzien beeinflussen viele Reinigungsmethoden Viele Proteine (Enzyme) sind Bestandteil Makromolekularer Komplexe Makromolekulare Komplexe können unter physiologischen Bedingungen isoliert werden Identifikation von Interaktionspartnern – Yeast Two Hybrid Systeme – Pull-down assays Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen mittels: – Analytische Ultrazentrifugation – Surface Plasmon Resonanz (Biacore) – Thermophorese – Isotherme Titrations Kalorimetrie – Hydrogen – Deuterium Exchange mass spectrometry Spektroskopische Methoden T1ER: Methoden der Biochemie 2 (LSF: T1EQ-BN) 13:00 (c.t.) Wieland HS WS 2024/2025 Gregor Witte – Gene Center Munich (LMU) [email protected] Spektrum elektromagnetischer Wellen Aus: Skript BPC/ MH Hannover, U.Curth Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus (CD)  Dynamische Lichtstreuung (DLS)  Fluoreszenz  X-ray scattering / Diffraction  Was ist Fluoreszenz?  Neutron Scattering  Quench, Anisotropie  FRET  Differential-scanning fluorimetry Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus  Dynamische Lichtstreuung (DLS) (CD)  X-ray scattering /  Fluoreszenz Diffraction  Was ist Fluoreszenz?  Neutron Scattering  Quench, Anisotropie  FRET Licht und Übergangsdipolmoment Licht Dipolmoment  Elektromagnetische  Fähigkeit zu absorbieren/emitieren Welle  Absorption: Grundzustd. →angeregter Zustand  B- und E-Feld  Dipolmoment, vektorielle Größe, je größer desto mehr Absorption  |Diplomoment|² is proportional zur Übergangswahrscheinlichkeit  kann polarisiert werden (Filter) Absorption Energie Absorption: EM-Welle hebt z.B. Elektron auf höheres Niveau an: z.B. n→* Übergang (Zustand a nach b) S1 beide Zustände a und b können durch Wellenfunktion beschrieben werden Ψa und Ψb h S0 Übergangswahrscheinlichkeit B ab (µ ist Übergangsdipolmoment) 2 2 2 B ab 2 b µ a 2 a µ Kernabstand 3 3 Absorption (UV/Vis) Probe d Absorption, Lambert-Beer, Extinktionskoeffizient 𝐼 Transmission 𝑇= Soviel Licht kommt durch (in %) 𝐼0 𝐼 Absorption 𝐴 = − log 𝑇 = − log soviel Licht wird “absorbiert” 𝐼0 Extinktion (E) Lambert-Beer’sches Gesetz 𝑚𝑜𝑙 𝐸 𝐸 = 𝜀∙𝑐∙𝑑 𝑐[ ]= Konzentrationsbestimmung 𝑙 𝜀∙𝑑 𝐸 𝑚𝑜𝑙 =𝜀 Einheit  → [ M-1cm-1 ] 𝑐 ∙ 𝑑 𝑐𝑚 𝑙 Extinktionskoeffizient  (stoffspezifisch, wellenlängenabhängig) Lambert-Beer & Extinktionskoeffizient Messbereich: Genauigkeit???? Absorption (OD) Licht absorbiert Absorption (OD) Licht absorbiert in % in % 0 0 1.5 97 1 90 1.7 98 2 99 2.0 99 Absorption (%) 0% 25% 50% 90% 99% 100% Proteine, Farbstoffe, DNA….. Alles was absorbiert kann gemessen werden Konzentrationsbereich? Möglichst immer 0.1 – 1.2 Photometer  Spektral-Photometer – Monochromatorgerät 𝐼 𝐴 = − log 𝑇 = − log 𝐼0 Lampe: immer an, verschiedene Lampen für UV-Bereich und Vis-Bereich Vorteil: “echte” Referenzmessung weil Io mit gemessen wird, Monochromatoren → sehr genaue Wellenlänge Nachteil: relative hohes Probenvolumen, maximale Konzentration 1.2 Abs, langsames messen des Spektrums Spektral-Photometer – Diodenarray Xe-Blitz- Probe Prisma Lampe Diodenarray Vorteil: schnelle Messung (ein Blitz der Lampe=ein Spektrum) , wenig Probenbedarf,hohe Konzentrationen möglich Nachteil: im Vergleich zu einem Monochromatorgerät mit PMT nicht so genau & empfindlich, meist keine echte Messung Io “ein echtes (nano)Photometer” 𝐸 = 𝜀∙𝑐∙𝑑 0.5-2µl Probe Optische Weglänge D= 0.1 mm – 1mm Genauigkeit? Beispiel: Proteinlösung mit A(280nm)=0.3 (gemessen in 1cm Küvette) → im nano-Photometer bedeutet das: A(280nm)=0.03 – 0.003 Was absorbiert in einem Protein bei 280nm ? (Bild: Wikipedia) Absorptionsspektrum eines Proteins Peptidbindungen Aromatische Keine Absorption ! Aminosäuren Proteine mit Absorption im Vis-bereich  z.B. Eisen bindende Proteine (Fe-S cluster)  Fluorophore im Protein Was absorbiert in einem Protein bei 280nm? 280nm= nTrp * 5500 + nTyr*1490 + nCys-Cys*125 [M-1cm-1] (Pace et al., 1995) Im praktischen Leben….  Sequenz des Proteins bei ProtParam eingeben  Aufpassen wenn man mit verschiedenen Konstrukten arbeitet z.B. bei Mutationen am Protein weil man irgendetwas untersuchen will ….  Beispiel:  E.coli SSB (wildtyp) = 27960 M-1cm-1  E.coli SSB W55H (mutante) = 22640 M-1cm-1 Extinktionskeoffizienten Chromophor max [nm]  [M-1cm-1] Tryptophan 280 5600 Tyrosin 274 1400 Phenylalanin 260 200 Adenosin 260 14900 Guanosin 276 9000 Thymidin 267 9700 Uridin 261 10100 Cytidin 271 9100 NAD+ 260 17600 NADH 339 5100 258 13000 Mischungen aus Protein/DNA Absorbance spectral scans of purified dsDNA, protein or a mixture. Samples contained purified herring sperm dsDNA, BSA protein or a DNA/protein mixture at varying ratios (w/w). Measurements were taken at 1 nm intervals at wavelengths ranging from 220 to 300 nm. Data normalized to a 1 cm path length. (http://www.biotek.com/assets/tech_resources/A260A280_Spectral_Scanning_App_Note.pdf) Protein/DNA – Daumenregeln  dsDNA 1 OD (260nm) ~ 50µg/ml  ssDNA 1 OD (260nm) ~ 33µg/ml  Protein 1OD ~ 1mg/ml (ganz grob, und oft falsch!)  Verhältnis Abs(260/280nm) ist ein guter Indikator für DNA-Kontamination in Proteinaufreinigungen: %Protein % Nukleinsäure 260:280 100 0 0.57 95 5 1.06 90 10 1.32 70 30 1.73 Hyperchromizität (DNA)  Schmelzen von DNA Unterschiede e(ssDNA) und e(dsDNA), dsDNA: Resonanz d. Aromaten durch die H-Brücken limitiert  Die Absorption der Probe steigt bei dsDNA → ssDNA  DNA-Schmelzexperimente: Messen im Photometer bei konstanter langsamer Heizrate (z.B. 20K/h) Abs(260nm) vs. Temperatur DNA-Schmelzexperiment 75mM NaCl, 20mM Kpi pH7.4, Heizrate 20K/h, 38µM poly(dA-dT) , 1.26µM EcoSSB Poly(dAdT): ATATATATATATATATATATATATATAT… TATATATATATATATATATATATATATA… SSB Reaktionen verfolgen  Beispiele Beispiel: Absorption vs. Zeit Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus (CD)  Dynamische  Fluoreszenz Lichtstreuung (DLS)  X-ray scattering /  Was ist Fluoreszenz? Diffraction  Quench, Anisotropie  Neutron Scattering  FRET Circulardichroismus  Linear polarisiertes Licht: Lichtwellen, bei denen elektrische/magnetische Komponente nur in einer Ebene schwingt.  Circular polarisiertes Licht: Datei:Rising circular.gif Zirkular polarisiertes Licht erzeugen The transmission axis of the linear polarizer, represented with an orange line, is at a positive 45 ° angle. On the quarter-wave plate, also represented in orange, is the horizontal slow axis and the vertical fast axis. In this instance the unpolarized light entering the linear polarizer is displayed as a single wave whose linear polarization is suddenly changing its angle and magnitude. When one attempts to pass unpolarized light through the linear polarizer, only light that has its electric field at the positive 45° angle leaves the linear polarizer and enters the quarter-wave plate. To understand the effect the quarter-wave plate has on the linearly polarized light it is useful think of the light being divided into two components at right angles ( orthogonal ). Toward this end, the crossed orange lines are projections of the red line onto the vertical and horizontal planes respectively and represent the a mplitude of the wave on those two planes. In linearly-polarized light, the two components are in phase. Because the quarter-wave plate is made of a birefringent material, when in the wave plate, the light travels at different speeds depending on the direction of its electric field. This means that the horizontal compon ent which is along the slow axis of the wave plate will travel at a slightly slower speed than the component that is directed along the vertical fast axis. Initially the two components are in phase, but as the two components travel through the wave plate the horizontal component of the light drifts farther behind that of t he vertical. By adjusting the thickness of the wave plate one can control how much the horizontal component is delayed relative to vertical component befor e the light leaves the wave plate and they again begin to travel at the same speed. When the light leaves the quarter-wave plate the rightward horizontal component will be exactly one quarter of a wavelength behind the vertical component making the light left hand circularly polarized. (Quelle: wikipedia) CD-Theorie  Optisch aktive chromophore absorbieren rechts und links zirkular polarisiertes Licht unterschiedlich, was dazu führt dass zirkular polarisiertes Licht elliptisch polarisiert wird. Dieser Effekt heißt Circulardichroismus (CD), er wird als Elliptizität dargestellt (). =2.303(AL-AR)·180/4π molare Elliptizität [] =100· /C·d=3300 · mit = L- R CD – Sekundärstrukturanalyse  Carbonylgruppe der Amidbindung hat im bei 180- 230nm zwei Absorptionsübergange (n→π*, π→ π *).  Durch assymmetrische Substitution an der CO- gruppe und H-Brücken der sekundärstrukturelemente im Protein enstehen charakteristische CD-Spektren für jede Sekundärstruktur (-helix, -Faltblatt, loops). CD-Referenzspektren CD-Signal eines Proteins  Das CD-Spektrum eines Proteins setzt sich additiv aus den einzelnen sekundärstrukturelementen zusammen: 20.0 Myoglobin 15.0 alpha Helix: 74% bonded turns: 13% 10.0 loops: 11% delta epsilon rest: 2% 5.0 0.0 190 200 210 220 230 240 250 -5.0 -10.0 Wellenlänge CD-Spektroskopie  Anteile der Sekundärstrukturen  Information: Ist das Protein gefaltet?  Titrationen möglich, wenn Änderung der Struktur  Konformationsänderungen  CD-melting, CD-kinetik  … Spektroskopische Methoden (UV/Vis) Resonante Spektroskopie Nicht-resonante spektroskopie  Absorption (Abs)  Streuung  Proteine, DNA, Liganden  Statische Lichtstreung  Lambert-Beer (RALS, SECMALLS)  Circulardichroismus  Dynamische Lichtstreuung (DLS) (CD)  X-ray scattering /  Fluoreszenz Diffraction  Was ist Fluoreszenz?  Neutron Scattering  Quench, Anisotropie  FRET Fluoreszenz Fluoreszenz Energie Absorption: Licht ist EM-Welle - hebt z.B. Elektron auf höheres niveau an: S1 z.B. n→ Übergang (Zustand a nach b) h beide Zustände a und b können durch Wellenfunktion beschrieben werden Ψa und Ψb S0 Übergangswahrscheinlichkeit Bab (µ ist Übergangsdipolmoment) 2 2 2 Kernabstand B ab 2 b µ a 2 a µ 3 3 Spontane Emission  Wahrscheinlichkeit für stimulierte Absorption und Emission gleich groß 2 2 2 2 B ab 2 b µ a 2 a µ b B ba 3 3  Energie Franck-Condon-Prinzip: Anregung erfolgt bei konstantem Kernabstand Gleichgewichtskernabstand in höherem elektronischem Niveau größer → Anregung in höhere Schwingungs-niveaus S1 Teil der Anregungsenergie geht als Wärme verloren → Emissionsmaximum gegenüber h Absorptionsmaximum rotverschoben (Stokes Shift) h Fluoreszenz Anregung in höhere elektronische Niveaus (S2,S3...) → Emission trotzdem meistens aus S1, da Abstand der höheren Niveaus kleiner → S0 Interne Konversion Fluoreszenz ist unabhängig von der Anregungs- Wellenlänge Kernabstand Wichtige Fluorophore Gruppe Excitation (nm) Emission (nm) Phenylalanin 260 282 Tyrosin 275 303 Tryptophan 286 350 Catecholamine 285 325 Tryptamin 285 360 Riboflavin 370 455 (520) - Tocopherol 295 340 Folsäure 365 440 Adenin 265 380 (pH 1.0) ATP 272 390 (5 n H2SO4) Anilinonaphtalinsulfonsäure (ANS) 350 550 an Protein gebunden 280 460 Ethidiumbromid 480 550 Eosin 517 540 eGFP 488 516 Konkurrenzprozesse zur Fluoreszenz Interne Konversion Überlappung von Schwingungszuständen, Stoß mit Lösungsmittelmolekülen Geschwindigkeitskonstante kIC → Fluoreszenz stark temperaturabhängig Löschen/Quench Wechselwirkung mit anderen Mölekülen in der Lösung Stoßquench (Stern-Volmer-Löschung): Sauerstoff, Iodid, Acrylamid... Stoß führt zur Desaktivierung, bimolekulare Reaktion mit kQ·[Q] Reaktion meist diffusionskontrolliert (kQ=1010 M-1s-1 für O2-Quench von Tryptophan) Statisches Quenchen: Ausbildung eines nicht-fluoreszierenden Komplexes von Fluorophor und Quencher  Prinzip der Fluoreszenz Absorption S2 (angeregter Zustand) Interne Konversion Energie S1 (angeregter Zustand) Fluoreszenz Elektronen im Grundzustand Copyright© HORIBA Jobin Yvon Fluoreszenz und Phosphoreszenz Energie Singulett S1 Triplett S1 T1 h Fluores- h h Fluores- zenz h zenz h S0 Phosphoreszenz S0 Kernabstand Jablonski Diagramm Phosphoreszenz  Intersystem crossing  Quantenmechanisch verbotener Übergang Spinumkehr eines Elektrons → Triplett-Zustand (T1)  Geschwindigkeitskonstante kIS  Rückkehr nach S1 unter Aussendung eines Photons verboten → lange Lebensdauer des Triplett-Zustands (ms bis Minuten) → Phosphoreszenz  Phosphoreszenz weiter rotverschoben als Fluoreszenz, da Triplettzustand geringere Energie besitzt Fluo/Phospho-reszenz Lebensdauer S1 T1 Phosphoreszenz Fluoreszenz S0 aus: Principles of Physical Biochemistry, van Holde, 1998 Messung der Fluoreszenz Gitter Referenz-Photomultiplier Spalt Spalt Probenküvette Lampe Anregungs- Strahlteiler Monochromator Emissions- Monochromator Gitter I Spalt Ausgegebenes Signal: F I Ref Photomultiplier  Aber nicht immer linear !!!!!! Fluoreszenzintensität ist Konzentrationsabhängig 400 350 300 250 Fluoreszenz 200 150 100 50 0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 Extinktion  Inner-filter Effekt 300 250 200 Fluoreszenz 150 100 50 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Extinktion Inner-filter Effekt Konzentrationszunahme Fluoreszenzintensität und Fluorophor-Konzentration sind bei höheren Extinktionen nicht mehr proportional Messung unter Bedingungen bei denen Absorption when isolating : Number of genes for each RNA Transcriptional activity RNA abundance polymerase tRNA Pol II 13% I Pol II Ribo 13% Pol III Pol I 14% 60% e ribeson => Warner TIBS 1999 - Li…Willis MCB 2000 Nucleic acid quality control: RNA RNAre than 28 1185 much more resistant to degradation by has occared => when 2852X185 , then degradation gandas asstrong 2x -. Ribosomal RNA (rRNA) makes up more than 80% of total RNA samples. Total RNA preps should display two prominent bands after gel electrophoresis. Nucleic acid quality control: BioAnalyzer 28S 185 Nucleic acid visualization/detection: -Mutagenic I not used anymore Fluorescent dyes: EtBr, SYBR family, … Nucleic acid visualization/detection Northern/Southern blot => ↓ ↓ ↓ northern name => of for DNA for RNA ! developer ! papong) or Nylon · A buffer - bride - Transfer buffer flow of liquid! with sult I > - takes to filter ! washing removal of not-hybrided propes RNA/DNA for of nucleicacid: bake it (for Nitroclere) (Nylon => ↳ binding then nucleil acid stays there or very smaller-radiation Northern blot: RNA detection ↳ housekeeping genes ! Expression profiles in various tissues Southern blot: DNA detection Genotyping to verify successful gene targeting Fluorescent in situ hybridization: FISH Nucleic acid visualization/detection: Fluorescent in situ hybridization chromosome painting PCR The polymerase chain reaction, PCR, can produce many copies of a specific target segment of DNA A three-step cycle—denaturation, annealing, and elongation—brings about a chain reaction that produces an exponentially growing population of identical DNA molecules The key to PCR is a heat-stable DNA polymerase called Taq polymerase. Generating cDNA DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm Reverse mRNA transcriptase Poly(A) tail A A A A A A 3’ 3 T T T T T 5’ DNA Primer strand A A A A A A 3’ T T T T T 5’ 3  5’ DNA polymerase 3’ 5’ cDNA Quantitative / real-time PCR Quantitative / real-time PCR: SyBr Green Product can be further tested in a post-amplification Binds minor groove of double-stranded DNA. melting curve in which sequences have characteristic melting temperatures. Sanger sequencing https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing Next (second) generation sequencing: Solexa/Illumina sequencing alter denaturation = primer Second generation sequencing: Bridge amplification Second generation sequencing: Cluster generation Second generation sequencing: clonal single molecule array ↳ Massive parallel sequencing Second generation sequencing: sequencing by synthesis 2nd gen. sequencing is short read sequencing: efficiency of these chemical reactions is limited maximal size of fragments that can be fully sequenced is ~150 bp for highly complex libraries and ~300 for less complex libraries First step in library preparation is shearing of DNA/RNA fragments down to an optimal size. only INvelestide add at a time ! hinder tag Addition Second generation sequencing Second generation sequencing Fragment shearing + Third generation sequencing technologies: Nanopore sequencing = not by synthesis ! Instruments: => portattet PromethION GridION USB MinION => convenient Advantages of Nanopore sequencing: Very long reads: high processivity of unwinding enzyme / no limiting reagent. Much improved haplotype assembly (long stretches of chromosomal DNA). Characterisation of alternative mRNA splicing events. If DNA/RNA sample relatively abundant, no need of amplification (no amplification artefacts). Direct identification of modified bases 5mC & 6mA without chemical treatments (epigenomics & epitranscriptomics). Disadvantages of Nanopore sequencing: Quality and integrity of NA library are limiting factors (pore clogging). Relatively high error rates in calling of modified bases. (new algorithms and AI are improving modified base identification). ↳ blowing down for captering : Seelicate ratches DNA one atative DNA - protein interaction: Chromatin immuno-precipitation - ChIP Cell are crosslinked with formaldehyde Immunoprecipitation with antibody Purification of copurifying DNA DNA detection by PCR / sequencing DNA - protein interaction: Chromatin immunoprecipitation-Seq (Elektronen) - Mikroskopie Otto Berninghausen 1. Geschichte der Mikroskopie 2. Grundlagen der Lichtmikroskopie 3. Fluoreszenzmikroskopie § High-Res Mikroskopie 4. Elektronenmikroskopie § Konventionelle TEM § 3D EM Antony van Leeuwenhoek, (1632 – 1723). Member Royal Society 1680 – 1674 Infusoria – 1676 Bacteria – 1677 Sperm cells – 1682 Striated muscle 3  Early Microscopes Early 1600s Late 1600s Early 1800s Mid 1800s Late 1800s Early 1900s Morphologische Beobachtungen als Wissensgewinn Cell Theory Mikroskop Lichtquelle Kondensor Probenhalter Objektiv Okular Lichtmikroskopie  Mikroskop Objektive Numerische Apertur α α α Working distance α α α NA = n sin(α) NA: Numerical aperture n: medium refractive index α: one-half of the objective angular aperture Light Transmitting Through the Sample: Brightfield Transmitted Light Microscopy Adrenal gland Leaf section Fluoreszenz Mikroskopie Fluoreszenzfarbstoffe für sensitive und spezifische Markierungen  Fluorescence Jablonski diagram: 3 levels system Higher vibrational states First excited Singlet state Triplet state Ground Singlet state Absorption spectra Fluorescence spectra Stokes shift Fluoreszenzmikroskopie (Weitfeld) mit dichroitischen Filtern  Fluorescent Molecules Fluorescent Molecules DAPI GFP Immunohistochemistrie mit fluoreszierenden Antikörpern  Multi-labelling Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes DNA microtubules centromeres Live-Cell Fluorescence Microscopy  Lichtwellen-Interferenz Light waves travel by slightly different routes, so that they interfere with one another and cause optical diffraction effects. At high magnification, an edge appears as a series of lines, a point of light as a concentric pattern  Spatial resolution: Flourescence Numerical aperture α α α Working distance α α α NA = n sin(α) NA: Numerical aperture n: medium refractive index àBarely resolved àResolved α: one-half of the objective angular aperture Rayleigh criterion: Two adjacent object points are defined as being resolved when the central diffraction spot (Airy disk) of one point Radius Airy disk coincides with the first diffraction minimum of the other point in the image plane λ rAiry = 0.61 NA For example: for NA= 1.3; λ= 546 nm Lateral resolution= 0.61λ/NA= 260 nm.  Auflösung Abbe’sche Auflösungs Formel: nx,y = λ/2NA D = 0.2 µm Numerical Aperture NA = n sin(θ) n - refractive index of the imaging medium ( air, oil) θ - aperture angle  Point-spread-function n Messung der PSF mittels eines 175nm-beads  Verbesserung der Point-Spread Funktion (PSF) Basis: Eine höhere numerische Apertur, eine kürzere Wellenlänge, ein höherer Brechungsindex Bessere PSF in Z- Ebene (axial): Konfokale und Light-Sheet Mikroskopie Fluorescence microscopy – confocal  Konfokales Mikroskop das „pinhole”... die konfokale Lochblende WF CF Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Laser Scanning Confocal Microscope Fluorescence microscopy – confocal focal planes Scanning results in 3D stack of individual 2D sections (z-stack) Confocal microscopy – 3D rendering, reconstruction and analysis developing fly eye photorecoptors glia Christophe Jung, BioSys M Light-Sheet Fluorescence Microscopy Light-Sheet Fluorescence Microscopy Photo-Damage Comparison  Light-Sheet Fluorescence Microscopy Vertical resolution +++ +++ Speed - +++ Photo damage - +++  High-Resolution Fluoreszenzmikroskopie Überwinden der Abbe’schen Auflösungsgrenze STED / PALM / STORM STimulated Emission Depletion PhotoActivatable Localization Microscopy Stochastic Optical Reconstruction Microscopy  Resolution Abbe diffraction limit Abbe Resolutionx,y = λ/2NA D = 0.2 µm Numerical Aperture NA = n sin(θ) n - refractive index of the imaging medium ( air, oil) θ - aperture angle (1,4 in the best case)  Super Resolution Microscopy / STED Stimulated Emission Depletion (STED) The nobel price in Chemistry 2014: E. Betzig (PALM), S. Hell (STED) and W. Moerner (PALM)  Photoactivated Localization Microscopy (PALM) / Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)  Super Resolution Microscopy / PALM Photoactivated Localization Microscopy (PALM) / Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) Confocal PALM Resolution: ~30nm  PALM Photo-activated localization microscopy Auflösunglimit von 200nm auf what could happen  Transkriptom => what might be happening  Proteom => what is happening  Warum Proteomik? Komplexität: nicht abhängig von der Anzahl der Gene Saccharomyces cerevisiae 6,294 Arabidopsis thaliana 25,498 Caenorhabditis elegans 19,099 Drosophila melanogaster 13,061 Homo sapiens < 21,000 Ein Gen => Mehrere “Proteoformen” Bludau I, Aebersold R. Nature Rev Mol Cell Biol 21:327–340 (2020) Humangenom: Transkriptom: ~ 100.000 RNA Proteom => >1.000.000 Proteine  Warum Proteomik? Korrelation zwischen mRNA und Protein Abundanz Nusinow et al., 2020, Cell 180, 387–402  Genomik vs. Proteomik  alle möglichen “features” bekannt feature = RNA  alle möglichen “features” messbar  PCR Amplifizierung möglich  kein Signal => nicht präsent  Analyse von grosser Probenzahl möglich feature = Protein  nicht alle möglichen “features” bekannt  nicht alle möglichen “features” messbar  keine Amplifizierung möglich  kein Signal => nicht präsent/nicht detektiert  meist Analyse von kleiner Probenzahl  Protein Identifizierung Proben Vorbereitung  Spaltung der Disulfidbrücken  Spaltung des Proteins in Peptidfragmente (enzymatisch oder chemisch)  Sequenzierung kurzer Sequenzabschnitte  Datenbankanalyse. Protein Disulfidbrücken Intrachenar und Interchenar  Proben Vorbereitung Spaltung der Disulfidbrücken Oxidation Reduktion Cystin Cystein  Proben Vorbereitung Alkylierung der Cystein Thiolgruppe  Protein Disulfidbrücken Diagonal SDS Gelelektrophorese nicht reduzierender Puffer - + - reduzierender Puffer (DTT) +  Protein Identifizierung Bottom-Up vs. Top-Down Proteomik Analyse von “Surrogat Peptiden” vs. “Intakte Proteine” Protein Fragmente = Peptide Intaktes Protein  Proben Vorbereitung Enzymatische Spaltung des Proteins in Peptidfragmente C-terminale Spaltung nach Lysin und Arginin mit Trypsin  Enzymatische Spaltung des Proteins in Peptidfragmente Trypsin  Hohe Spezifität – spaltet Lys und Arg Reste C-terminal  Sehr robust (aktiv in Harnstoff Lösungen, etc.)  Ausnahme: Pro Rest folgt Lys oder Arg => keine Spaltung  C-terminaler Lys/Arg Rest hat basischen Charakter => gut für Fragmentierung im Massenspektrometer  Mehrzahl der Peptidfragmente haben 7-20 Aminosäuren  Protein Identifizierung  Sanger Methode  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie  Protein Identifizierung Sanger Methode zur Bestimmung der Aminosäuresequenz  Derivatisierung der N-terminalen Aminosäure mit 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol  Generierung von Peptidfragmenten mittels total und partieller Hydrolyse Frederick Sanger – Wikipedia  Protein Identifikation  Sanger Methode  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie  Edman Abbau … Phenylthiohydantoin-derivatisierte Aminosäure 1 Phenylthiohydantoin-derivatisierte Aminosäure Standards Sequenzierung mit Hilfe des Edman Abbaus Unvollständige Abspatung der N-terminalen Aminosäure  Protein Identifikation  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie Massenspektrometrie Bestimmung der Molekülmasse freier gasförmiger Ionen im Hochvakuum  Massen Spektrometrie Trennung nach Masse / Ladung (m / z) Probe + _ Ionenquelle Massenanalysator Detektor Erzeugung gasförmiger Ionen Autrennung nach Masse (m) und Ladung (z) Erzeugung von Sekundärelektronenstrom Überführung in geladenen Zustand im magnetischen/elektrischen Feld mit Photomultiplier Massenspektrometrie Bestimmung der Molekülmasse freier gasförmiger Ionen im Hochvakuum Wie können Protein und Peptid Moleküle in die Gasphase überführt werden? => Schonende Ionisierung! Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)  Matrixsubstanz absorbiert Laserenergie  Teilweise Übertragung von Energie auf Proteine führt zur Desorption  Matrixsubstanz wirkt als Brönstedtsäure, was zur Protonierung der Proteine führt  Electrospray Ionization (ESI) Dispersion von Flüssigkeit in viele kleine geladene Tröpfchen mit Hilfe eines elektrostatischen Feldes  Time Of Flight (TOF) Massen Analysator  Beschleunigung der Ionen durch elektrostatisches Feld  Ionen mit unterschiedlichen m/z haben gleiche Ekin => unterschiedliche v  Messung der Zeit (μs) von Start bis Eintreffen am Detektor Time Of Flight (TOF) Massen Analysator m 2Vt2 = z L2 m = Ionenmasse z = Ionenladung V = Spannung L = Flugrohrlänge t = Flugzeit  Quadrupole Massen Analysator  Massenfilter, der aus 4 Metallelektroden besteht  Kombination von Wechsel- und Gleichspannung  Ionen wandern auf oszillierender Bahn und können passieren  Scannen über den gesamten Massenbereich durch Erhöhung der Gleichspannung und Amplitude des Wechselfeldes m2 m1 m4 m3 m2 m1 m4 m3 Scanning  Peptid Massen Spektren sind Komplex!!! Unterschiedliche Ladung der Peptidionen Komplexe Peptid Massenspektren Trennung nach Masse / Ladung (m/z) ADFKTNMRPLYK 1700 H2N-ADFKTNMRPLYK + H+ + H3N-ADFKTNMRPLYK 1700 + 1 / 1 = 1701 Peptid Ladungszustand + 1700 + 2 / 2 = 851 H3N-ADFKTNMRPLYK H3N +  Peptid Ladungszustand 1700 + 3 / 3 = 567.66 H3N-ADFKTNMRPLYK + H3N H3N + +  Multiple Ladungszustände Berechnung von Protein Ladung und Masse z[i] = Ladung Peak i p[i] = m/z Wert Peak i p[i+1] = m/z Wert Peak i+1 M = Masse p[i+1] 1 z[i] = p[i+1]-p[i] 2 M = p[i] x z[i] - z[i] Komplexe Peptid Massenspektren Isotopie: Atome mit gleicher Anzahl von Protonen und unterschiedlicher Anzahl von Neutronen 12C 13C Komplexe Peptid Massenspektren Isotopie Monoisotopische Masse: Atommassen der am häufigst vorkommenden Isotope (=> leichteste Isotope) Durchschnitts Masse: Atommassen aller Isotope in ihrer natürlichen Häufigkeit (nicht überall identisch)  Aminosäure Massen Monoisotopische Masse 1H, 12C, 14N, 16O, 32S Durchschnitts Masse 1H/2H, 12C/13C, 14N/15N, 16O/17O/18O, 32S/33S/34S/35S/36S Glycine 57.02147 57.0520 Aspartic acid 115.02695 115.0886 Alanine 71.03712 71.0788 Glutamine 128.05858 128.1308 Serine 87.03203 87.0782 Lysine 128.09497 128.1742 Proline 97.05277 97.1167 Glutamic acid 129.04264 129.1155 Valine 99.06842 99.1326 Methionine 131.04049 131.1986 Threonine 101.04768 101.1051 Histidine 137.05891 137.1412 Cysteine 103.00919 103.1448 Phenylalanine 147.06842 147.1766 Isoleucine 113.08407 113.1595 Arginine 156.10112 156.1876 Leucine 113.08407 113.1595 Tyrosine 163.06333 163.1760 Asparagine 114.04293 114.1039 Tryptophan 186.07932 186.2133 Monoisotopische und Durchschnitts Masse Isotopie 12C 13C 1H 14N 16O 64 2 95 19 26 Bestimmung der Peptid Ladung Basierend auf Isotopologen Muster [MH]+ [MH2]2+  Protein Identifizierung mit Hilfe der Massenspektrometrie Mittels Analyse intakter Proteine ist schwierig!!! Spaltung in Peptide mittels enzymatischem Verdau Bottom-Up vs. Top-Down Massenspektrometrie Messung “Surrogater Peptide” Messung “Intakter Proteine”  Bottom-Up vs. Top-Down Messung “Surrogater Peptide” vs. “Intakter Proteine”  Vorteile  Gute chromatographische Trennung  Einfache Daten Akquisition  Fragmentierungs Mechanismus bekannt  Gute Software  Nachteile  Protein-Peptid Verhältnis Information geht verloren  Hohe Proben Komplexität  Nachteile  Löslichkeit  Multiple Ladungszustände  Komplexe Fragmentierung  Massenheterogenität wegen PTM  Geringe Empfindlichkeit  Schwierige chromatographische Trennung  Protein Identification Bottom-Up Approach  Peptide Mass Fingerprinting  Tandem Mass Spectrometry  Peptide Mass Fingerprinting Massen der Peptide aus Protein Verdau sind ausreichend um Protein zu identifizieren  Peptide Mass Fingerprinting Peptidmassen des Proteins nach Verdau sind ausreichend unique um Protein zu identifizieren MKAVVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDDPQSS WDRVKDFATV YVEAIKDSGR DYVAQFEASA LGKQLNLKLL DNWDTLASTL SKVREQLGPV TQEFWDNLEK ETASLRQEMH KDLEEVKQKV QPYLDEFQKK WHEEVEIYRQ KVAPLGEEFR EGARQKVQEL QDKLSPLAQE LRDRARAHVE TLRQQLAPYS DDLRQRLTAR LEALKEGGGS LAEYHAKASE QLKALGEKAK PVLEDLRQGL LPVLESLKVS ILAAIDEASK KLNAQ  Massenspektrum eines Protein Verdaus  Vergleich gemessener Massen mit Datenbank Massen  Anzahl der Matches  Peptide Mass Fingerprint Datenbank  Protein Sequenz Datenbank  Enzymatische Spaltungsstellen (K,R)  Alle möglichen Peptidsequenzen aller Proteine  Masse (M+H) aller Peptide bestimmen  Verbindung Peptidmassen mit Protein  Notwendige Information Peptide Mass Fingerprinting Liste der gemessenen Massen Protease Datenbank Organismus (optional) Geschätzte Masse und pI des Proteins (optional) Cystein Modifikation (alkyliert) Massen Toleranz (100 ppm = 1000.0 ± 0.1 Da) PMF search engine Peptide Mass Fingerprinting  PMF Datenbank Suche Protein Prospector Mascot Massenspektrometrie Peptide Mass Fingerprinting.  Protein Prospector Peptide Mass Fingerprint Datenbanksuche http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msfitstandard Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung  Tandem Massenspektrometrie Peptidionen Einzelenes Peptid Tochter Mischung Peptidion Ionen Ion MS1 MS2 source  Fragment Ionen liefern Struktur Information  Zwei Massenanalysatoren getrennt durch mit Gas gefüllter Kollisionszelle (N2, Ar, Xe)  Ausgewählte Ionen werden in Kollisionszelle fragmentiert Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung y-Ionen b-Ionen http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/ms.html  Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung Glycin: H2N-CH2-COOH 75 Da Glycin in Protein: -HN-CH2-CO- 75-18 Da = 57 Da Aminosäure Massen minus 18 (H2O) Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung  Tandem Massenspektrometrie Fragmentionen Serie ist nicht immer vollständig YADSGEGDFLAEGGGVR fehlende Fragmentionen 100 80 L A Relative Abundance F D G 60 E A E G 40 S D 20 0 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z Tandem MS Massenspektrometrie Tandem MS Data.  Massenspektrometrie Tandem MS Data. Peptid Masse Fragment Massen  Tandem Massenspektrometrie Sequenzierung  tryptische Peptide:  kleinste Fragmentmasse im Spektrum ist Lys oder Arg  y1 Masse R  147.113 Lys + |  175.119 Arg H3N ˗ CH ˗ COOH  y1 Ion wird berechnet mittels Addition von 19.018 Da (Aminosäure + H2O + H+)  Suche nach prominentem Peak rechts von y1 Ion, der y1 + einer Aminosäure Masse entspricht => y2 Ion  Schritte nach rechts wiederholen, …  yn Serie ergibt “reverse” Sequenz (von C-Terminus nach N-Terminus) R  Tandem Massenspektrometrie  Spezifischer als Peptide Mass Fingerprinting  intakte Peptid Masse + Fragment Massen Information  alle Fragment Massen stammen von Precursor Peptid  Informativer als Peptide Mass Fingerprinting  de novo Sequenz Analyse möglich  Identifizierung von Proteinen in komplexen Mischungen  Charakterisierung von post-translationalen Modifikationen  Massenspektrometrie Zur Bestimmung von Post-Translationalen Modifikationen.  Phosphorylierung +80  Acetylierung +42  Methylierung +14  Disulfidbrücke - 2  Deamidierung + 1  Protein Identifikation  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie Immunochemische Methoden Antikörper – Antigen Interaktionen Einsatz von Antikörpern als analytische Reagenzien  Antikörper Antigen Bindung  Glycoproteine  Abwehr von Mikroorganismen und Viren  Unterscheidung von körpereigenen/nicht-eigenen Substanzen  Binden mit hoher Affinität und Spezifität  Grosse Vielfalt durch Variation der Bindungsstelle Paratop Epitop Immunoglobulin Struktur  Antikörper Epitop = antigene Determinante: Molekülabschnitt eines Antigens, gegen den das Immunsystem Antikörper bildet Diskontinuierliches Epitop: aus verschiedenen im Raum nah bei einander liegenden Aminosäureresten bestehend, die im Protein voneinander entfernt sind => nur im nativen Zustand des Proteins vorhanden Kontinuierliches Epitop: aus Aminosäueresten bestehend, die in der Sequenz aufeinander folgen => auch nach Protein Denaturierung vorhanden  Antikörper  Antiserum: Immunisierung von Labortieren (meist Kaninchen) mit Antigen führt zu der Generierung von „polyclonalen Antikörpern“, die gegen mehrere Epitope des Antigens gerichtet sind.  Monoklonaler Antikörper: Immunisierung von Labortieren (Mäusen) mit Antigen führt zu der Generierung von „polyclonalen Antikörpern“; „monoclonaler Antikörper“ entsteht durch somatische Hybridisierung von einer B Zelle mit Tumorzelle; Selektion und Propagation in Zellkultur; gegen monospezifisches Epitop gerichtet.  Antikörper Polyklonal Monoklonal  Monoklonale Antikörper  Von einer B Zelle stammend  Hybridisierung B Zelle mit Tumor Zelle  Selektion und Propagation in Zellkultur  Monospezifisches Epitop  Unbegrenzte Menge  Antikörper  Peptid-Antikörper: Immunisierung von Labortieren mit synthetischem Peptid, das auf Proteinsequenz basiert  => limitierte Anzahl von Epitopen. MKAVVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDDPQSS DRVKDFATV YVEAIKDSGR DYVAQFEASA LGKQLNLKLL DNWDTLASTL SKVREQLGPV TQEFWDNLEK ETASLRQEMH KDLEEVKQKV QPYLDEFQKK WHEEVEIYRQ KVAPLGEEFR EGARQKVQEL QDKLSPLAQE LRDRARAHVE TLRQQLAPYS DDLRQRLTAR LEALKEGGGS LAEYHAKASE QLKALGEKAK PVLEDLRQGL LPVLESLKVS ILAAIDEASK KLNAQ  Western Blot Gelelektrophorese mit anschliessendem Proteinblotting und Immundetektion Western Blot  Immunfluoreszenz Protein Detektion auf Zell- oder Gewebeoberflächen Direkt Indirekt Immun-histochemie, -cytochemie Protein Detektion in Geweben oder Zellen  Quantitative Protein Bestimmungen Qualitative Identifizierung von Proteinen reicht nicht aus um biologisches System zu beschreiben. Analyse von Protein Veränderungen notwendig  räumlich  zeitlich  krank - gesund  nach Behandlung mit Medikament Protein Quantifizierung Plasma Proteine  Quantitative Protein Bestimmungen  Immunochemie  Gelelektrophorese/Western Blot  Massenspektrometrie RadioImmuno Assay (RIA) Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Enzyme Enzyme  Quantitative Protein Bestimmungen  Immunochemie  Western Blot/Gelelektrophorese  Massenspektrometrie Western Blot Quantifizierung Banden Färbeintensität  Quantitative Protein Bestimmungen  Immunochemie  Gelelektrophorese/Western Blot  Massenspektrometrie  Quantifizierung mittels Massen Spektrometrie  Absolute Quantifizierung  Tatsächliche Menge  Relative Quantifizierung  Mengen Unterschied zwischen Proben  Quantifizierung mittels Massenspektrometrie Signal Intensität eines Peptidions ist abhängig von  Konzentration  Effizienz des Enzymatischen Verdaus in Peptide  Ausbeute Probenvorbereitung  Ionisierung  Matrix Effekte Unter der Annahme von komplettem enzymatischem Verdau in Peptide Differenzielle Peptid Ionisierung Signal Intensität eines Peptidions korreliert nicht direkt mit Proteinmenge Präzise Quantifizierung nicht möglich  Massen Spektrometrie Ionisierungseffizienz der Peptidionen ist abhängig von Matrix I1 + I1 < I2 I2 +  Quantifizierung mittels Massen Spektrometrie =15N  Quantifizierung mit Hilfe von mit stabilen Isotopen markierten Peptiden als Referenz.  Unmarkiertes und markiertes Referenz Peptid mit identischer Sequenz haben dieselbe Ionisierungseffizienz.  Markiertes Referenz Peptid und unmarkiertes Peptid haben verschiedene Masse und können im Massenspektrometer getrennt werden.  Verhältnis der Signale von unmarkiertem und markiertem Referenz Peptid erlaubt relative Quantifizierung.  Massen Spektrometrie Unterschiedliche Ionisierungseffizienz R 1 = I1 / I1 I1 + Markiertes Referenzpeptid I1 + R1 = R 2 I2 + Markiertes Referenzpeptid I2 + R 2 = I2 / I2 Absolute Quantifizierung mit Stabilen Isotopen markiertes Peptid als interne Referenz Zell/Gewebe Extrakt Proteine Peptide Markiertes Referenzpeptid mit bekannter Menge Massen spectrometrie Absolute Quantifizierung mit Stabilen Isotopen markiertes Peptid als interne Referenz 4 x 15N 3 x 13C Absolute Quantifizierung mit Stabilen Isotopen markiertes Peptid als interne Referenz zu quantifizierendes Peptid + Markiertes Peptid mit identischer Sequenz und bekannter Menge I m/z Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung Ziel: relative Quantifizierung zweier Zustände Zell-/Gewebe-Extrakt Reinigung Proteine Verdau Peptide Massen Spektrometrie Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren 12C -Lys: 12C H N O 6 6 12 2 Δm = 6 Da 13C -Lys: 13C H N O 6 6 12 2 12C -Lysine 13C -Lysine 6 6 Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren 12C 13C Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren Ziel: relative Quantifizierung zweier Zustände 12C -Lys 13C -Lys 6 6 1:1 Mischung Protein Extrakt Trypsin Verdau Peptide  Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren Ziel: relative Quantifizierung zweier Zustände -HN-CH-COOH Δm = 6 Da NH2- I -HN-CH-COOH CH2 I NH2- I CH2 CH2 I I CH2 MS CH2 I I CH2 CH2 I I CH2 NH2 I NH2 Kommentare, Kritik, Vorschläge [email protected]