Untitled

Manipulation et Étude des Protéines

• Le processus commence par la purification des protéines, car elles sont présentes dans les cellules et doivent êtres séparées des autres protéines.
• La purification facilite la détermination de leur structure et fonction

Purification des Protéines

• Pour être purifiées, les protéines doivent être en solution.
• Les protéines extracellulaires sont en solution dans le plasma sanguin.
• Le processus de purification des protéines extracellulaires :
  • Centrifuger le plasma.
  • Récupérer les protéines dans le surnageant.
• Les protéines cellulaires nécessitent un processus différent car elles ne sont pas naturellement en solution.
• Le processus de purification des protéines cellulaires :
  • Prélever un fragment d'organe
  • Homogénéiser le prélèvement
  • Lyser les cellules en douceur
  • Centrifuger à la vitesse appropriée selon la localisation de la protéine
• La centrifugation est une étape initiale cruciale pour enrichir la préparation en protéine d'intérêt tout en éliminant les matériaux indésirables.
• Toutes les protéines cellulaires ne sont pas présentes dans tous les tissus ou organes, impliquant de prélever sélectivement en fonction de leur localisation.
• L'homogénéisation consiste à séparer les cellules les unes des autres dans le prélèvement.
• La lyse cellulaire est nécessaire pour accéder au matériel intracellulaire et donc aux protéines ciblées.
• La centrifugation est ajustée en fonction de la localisation de la protéine

Utilisation d'un Gradient de Concentration

• La vitesse de sédimentation dépend de la différence de densité entre la particule et le solvant.
• Si la densité de la particule est supérieure à celle du solvant, il y a sédimentation.
• Les différentes phases sont récupérées dans des tubes distincts pour isoler les composés.
• La centrifugation sur gradient permet de séparer les composés selon leurs densités variées.
• Pour séparer des éléments selon leur densité, des liquides de différentes densités sont utilisés.
• Les éléments plus denses que le liquide se déposent au fond du tube.
• Cette méthode est utilisée pour les protéines, qu’elles soient très denses ou peu denses.

Chromatographie

• La chromatographie sert à séparer un mélange de protéines.
• La technique repose sur deux phases : une phase immobile (par exemple, un gel poreux ou des billes) et une phase mobile (gaz ou liquide).
• L'échantillon est déposé au sommet de la colonne, puis la phase mobile est ajoutée pour entraîner les protéines à travers le système.
• La vitesse de migration des protéines est dépendante de leurs propriétés, ce qui permet leur séparation.

Chromatographie d'Échange d'Ions

• Cette méthode sépare les protéines selon leur charge.
• La phase immobile est un polymère chargé (billes), tandis que la phase mobile est une solution aqueuse tamponnée.
• Les molécules neutres ou portant la même charge que la phase immobile sont éluées.
• Les molécules de charge opposée à la phase immobile sont retenues dans la colonne.
• Les protéines retenues sont ensuite récupérées par compétition, en ajoutant un sel comme le NaCl.
• La charge d'une protéine varie en fonction du pH, permettant des séparations très fines en ajustant le pH.
• Des billes chargées négativement sont utilisées comme phase immobile.
• Un mélange de protéines est ajouté à cette phase.
• La vitesse à laquelle les protéines se déplacent dépend de leur charge nette au pH utilisé, les protéines avec une charge nette plus négative se déplaçant plus rapidement.
• Une résine échangeuse de cations retiendra préférentiellement les cations.

Chromatographie d'Exclusion

• La séparation des protéines se fait en fonction de leur taille.
• La phase immobile est constituée d’un polymère poreux (billes) dans la colonne.
• La phase mobile est une solution aqueuse tamponnée.
• Les petites molécules pénètrent dans les pores du polymère, ce qui ralentit leur progression.
• Les protéines plus volumineuses, ne pouvant pas entrer dans les pores, passent plus rapidement à travers les espaces entre les billes.
• Les grosses molécules atteignent le bas de la colonne en premier.
• Différentes fractions sont collectées dans des tubes distincts.
• Le temps entre le dépôt et la sortie de la colonne est désigné comme le temps de rétention.
• C’est l'inverse de l'électrophorèse
• Le temps de rétention d'une grosse molécule est inférieur à celui d'une petite molécule.
• Le temps de rétention est inversement proportionnel à la taille des protéines.
• Puisque la masse d'une protéine est liée à sa taille, cette méthode est utile pour estimer approximativement la masse moléculaire des protéines de chaque fraction.
• Une méthode pour séparer des protéines suivant leur taille par dialyse.

Chromatographie d'Affinité

• Cette technique capture les protéines par leur ligand spécifique.
• La phase immobile est le ligand de la protéine d’intérêt, fixé par liaison covalente à la colonne.
• La phase mobile est une solution aqueuse tamponnée.
• La phase immobile a à sa surface le ligand de la protéine voulue.
• Les protéines ayant une grande affinité pour le ligand vont s'y associer et rester dans la colonne.
• Il faut connaître le ligand de la protéine étudiée.
• La protéine qui nous intéresse reste dans la colonne.
• Pour décrocher la protéine, une compétition est utilisée en ajoutant une solution contenant le ligand.
• La compétition s'établit donc entre les ligands en solution et ceux associés aux billes.Les protéines retenues sont ensuite récupérées par compétition, en ajoutant un ligand soluble en grande quantité.
• Les protéines se dissocient du ligand fixé à la colonne pour s'associer au ligand soluble, et sont éluées sous forme de complexe protéine-ligand.

Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC)

• La phase immobile est constituée de billes incompressibles résistantes à la pression.
• Une haute pression est appliquée, augmentant la vitesse du flux et la résolution de la séparation.
• La méthode est plus rapide et précise.

L'Électrophorèse

• L'électrophorèse permet la migration de particules chargées dans un champ électrique.
• La distance de migration est dépendante de la vitesse de migration.

L’électrophorèse SDS-PAGE

• Le SDS est un agent dénaturant qui apporte des charges négatives aux protéines.
• Il se lie aux protéines et submerge leurs charges propres.
• Toutes les protéines sont accélérées avec la même force, indépendamment de leur charge de départ.
• En conséquence, les protéines sont séparées selon leur taille, les plus petites se déplaçant plus rapidement que les grosses.
• L'analyse de la distance de migration peut indiquer la taille d'une protéine.
• L'agent SDS est utilisé pour faciliter la migration des protéines (car elles ne sont plus compactes).
• Si la structure 3D d`une protéine est stabilisée par des ponts disulfures, il faudra compléter ce traitement par l'utilisation d'agents réducteurs pour rompre les ponts disulfures.

L'électrophorèse SDS-PAGE : Applications et Interprétation

• Le nombre de bandes sur une électrophorèse SDS-PAGE permet une évaluation qualitative d'une purification.
• L'épaisseur des bandes permet une évaluation quantitative de la quantité de protéine.
• On utilise toujours un marqueur (pourquoi ?). Plus la masse est importante, plus la vitesse de migration est faible'
• On obtient deux information : la qualité de la purification (si à la suite de la purification, on peut faire cette méthode pour savoir si ça a bien fonctionner ou pas = le nombre de bandes sur la colonne...)
• On peut aussi faire test quantitatif : plus la bande est intense, plus on a réussi à purifier de protéines.
• Il est important d'utiliser un révélateur (bleu de comassie) car la plupart des protéines sont transparentes)
• L’analyse d’une électrophorèse SDS-PAGE permet de comparer la présence de protéines dans des cellules soumises à des conditions différentes, par exemple exposées à des chocs thermiques ou des modifications de pH.
• On peut évaluer le poids moléculaire des protéines: ce n'est pas très précis, mais ça donne un ordre de grandeur.

Détermination du Poids Moléculaire d'une Protéine

• La distance de migration sur électrophorèse SDS-PAGE est directement liée à la taille des protéines et donc à leur masse.
• Utilisation de marqueurs de taille(protéines dont la taille est connue) pour déterminer le poids moléculaire d'une protéine.
• L'électrophorèse est une méthode de choix pour séparer des mélanges complexes de protéines et estimer le poids moléculaire des protéines inconnues.

Isoélectrofocalisation

• Sépare les protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI).
• La charge nette des protéines dépend du pH.
• Au point isoélectrique, une protéine soumise à un champ électrique ne migre pas.
• Un tube avec un gradient de pH stabli, où la charge de la protéine est neutre est le point isoélectrique. On les sépare donc en ayant un pH différent, si c'est bien fait il ne peut y en avoir deux qui ont le meme pH.
• 2 applications : Séparation des mélanges complexes de protéines, en fonction de leur Point Isoelectrique et Déterminer le Point Isoelectrique d'une protéine purifiée mais inconnue

Électrophorèse Bidimensionnelle

• Combinaison de plusieurs techniques : Isoélectrofocalisation (séparation des protéines en fonction de leur charge) avec électrophorèse SDS(séparation des protéines en fonction de leur taille).
• Isoélectrofocalisation → Migration des protéines jusqu'à leur Pl
• Les points différents dans deux conditions de culture cellulaire différentes, on peut en déduire les protéines qui sont impliqués dans l'apoptose et le cycle cellulaire.

Spectrophotométrie

• Cetains acides aminés aromatiques absorbent à une certaine longueur d'onde (280nm). Plus la valeur d'absorbante, plus l'échantillon contient de protéines en général (pas une en particulier)
• Limite: ne permet pas de déterminer la quantité d'une protéine d'intérêt contenue dans un mélange de protéines (protéine non purifiée)

Immunodétection: ELISA

• Quantification d'une protéine grâce à des anticorps.
• Type ELISA : Sandwich direct.
• Pour éviter la purification, est basé sur l'utilisation d'anticorps.

Immunodétection: Immunoblot

• Transfert des protéines depuis le gel vers une membrane(en appliquant un champ électrique).
• On dispose des Ac, et s'il s'agit du bon anticorps, il y aura une réaction avec les protéines.
• On peut donc visualiser la protéine d'intérêt.

Séquençage d’Edman

• Détermine la nature, de l'ordre, et du nombre des aa d'une protéine.
• Dans cette méthode, on fait réagir la protéine avec un gros composant pour former une association en présence de OH- (pH basique= couplage en milieu basique.
• La cycle peut recommencer une vingtaine de fois (Séquencage d'une vinhtaine d'aa)

Digestion par proteases

• Ex: trypsine clive les protéines après les résidus lysine et arginine.
• Commencer par utilise des proteases qui clive les protéines,
• Pour cela on a des tableaux avec les differentes propriétées.

Détermination de la conformation des protéines par diffraction aux rayons X

• Méthode complexe utilisée par des spécialistes.Ca n'est que pour la culture générale!!!