Methoden der Biochemie 2 - Vorlesung 25.10.2024

Methoden der Biochemie 2 25.10.2024 B. Beatrix (AG Beckmann)  2 Gershenson & Gierasch_Curr OpinStruct Biol_2011 Wiederholung: Proteinreinigung Gängige Chromatographie Techniken  Isoelektrischer Punkt Der isoelektrische Punkt (IEP...

Methoden der Biochemie 2 25.10.2024 B. Beatrix (AG Beckmann)  2 Gershenson & Gierasch_Curr OpinStruct Biol_2011 Wiederholung: Proteinreinigung Gängige Chromatographie Techniken  Isoelektrischer Punkt Der isoelektrische Punkt (IEP oder pI) ist der pH-Wert, an dem die Zahl der positive (welche AS ?) und negative Ladungen (welche AS ?) eines Proteins im statistischen Mittel genau gleich ist. Kation Austauscher Chromatographie Negative Ladung in der stationären Phase (Säulenmaterial, Matrix) Proteine mit positiver Nettoladung beim verwendeten pH Wert binden (beachte pI) Elution mit Salzgradient oder (seltener) pH Wechsel der mobilen Phase abhängig von der Stabilität des zu reinigenden Proteins Anionaustauscher Chromatographie folgt dem gleichen Prinzip Der “LOAD” sollte eine niedrige Salzkonzentration aufweisen Elutionsprofile https://www.cytivalifesciences.com/en /us/support/handbooks Reinigung anspruchsvoller Proteine Membranproteine 20% aller Gene des humanen Genoms (ca. 32.000 Gene) kodieren für Membranproteine Begrenztes Wissen: PDB (Protein Data Bank) – PDB: gestartet 1971 mit 7 (!) Kristallstrukturen – PDB: Okt. 2024 ca 226.262 Einträge (ca. 188.523 x-ray, 14.395 NMR, 22.987 Electron Microscopy) – Membranproteine: total 7952, α-helikale (4347), β-Barrel (1048), monotopische (1735) – 50% aller Drug-Targets sind Membranproteine (Transporter, Rezeptoren, “Anker”, Enzyme) 1960; PDB: 1mbn; aus Pottwal Muskel  Klassifizierung von Membranproteinen (Periphäre und Integrale) 1. Single α-helix membrane -spanning protein 2. Multiple α-helix membrane-spanning protein transmembrane proteins 3. Rolled up β-sheet (β barrel) 4. Membrane proteins with an amphiphilic helix integral membrane proteins 5. Lipid-linked membrane proteins 6. Oligosaccharide-Linker (GPI) membrane proteins 7. and 8. Membrane-associated proteins are attached to the membrane solely by noncovalent interactions with integral membrane proteins Purpurbakterien Anoxygene Photosynthese Klassifizierung von Membranproteinen (Trans-, integrale und periphäre) Transmembranproteine: 1, 2und 3 Integrale Membranproteine: 4, 5 und 6 Periphere Membranproteine: 7 und 8 (nur über Protein-protein-Wechselwirkung) Transmembranproteine α-Helices Right handed helix H-bond between every 4th peptide bond Complete turn every 3.6 amino acids Hydrophobe α Helices in Transmembranproteinen Die Membranhelix besteht aus hydrophoben (oder ungeladene) Aminosäuren. Hydrophobe Seitenketten > van der Waals Interaktionen mit den Fettsäure-Acylketten Polare carbonyl (C=O) und Imino (NH) Gruppen der Peptidbindungen sind in H-H- Brücken involviert. Flankierende positive Aminosäuren verankern die Helix in der Membran. Lodish et al. Molecular Cell Biology 4th ed. “Seven-spanning” Membran Proteine Bacteriorhodopsin Lodish et al. Molecular Cell Biology 4th ed. β-sheets häufiger seltener β-Barrel Proteine (Porins) In der äußeren Membran von E. coli In der äußeren Membran von Mitochondrien und Chloroplasten Vornehmlich polare Aminosäuren, keine langen hydrophoben Segmente (wie bei α helikalen MP) Oft Homotrimere Gerad-zahlige β sheets (8 bis 22) bilden Faß-ähnliche Struktur mit zentraler Pore Aliphatische Seitenketten und ein Band aus aromatischen Seitenketten positionieren das Porin in der Membran Porin innen hydrophil – aussen hydrophob erlauben passive Diffusion z.B. von Zuckermolekülen Lodish et al. Molecular Cell Biology 5th ed.  Detergenzien amphipatische Moleküle polarer “Kopf” und aliphatischer oder aromatischer “Schwanz” selbst wasserlöslich ermöglichen die Dispersion Wasser-unlöslicher, hydrophober Komponenten in wässrige Lösungen Niedrige Konzentrationen >> Monolayer an der Luft-Flüssigkeits-Interphase Hohe Konzentrationen > Detergenz-Monomere bilden “Micellen” Micellen sind thermodynamisch-stabile kolloidale Aggregate von Detergenz Monomeren – Unpolare Enden zeigen nach Innen  Detergenzien Kopfgruppe > Klassifizierung – Ionisch – nicht-ionisch – zwitterionisch (ampholytisch) Ionische Detergenzien gelten als biologisch grob oder scharf, weil sie häufig die Proteinstruktur modifizieren Nicht-ionische Detergenzien gelten als eher mild, da sie die native Proteinstruktur eher intakt halten. Zwitterionische Detergenzien sind weniger denaturierend und haben keine Nettoladung. Sie unterbrechen Protein-Protein Interaktionen und reduzieren Aggregation effizienter als nicht- ionische Detergenzien. Detergenzien: physikalische Eigenschaften CMC : “critical micelle concentration” = Konzentration, ab der Micellen ausgebildet werden (Salz abhängig!!!) Aggregationszahl = Ø Anzahl der Detergenzmoleküle pro Micelle CMT “critical micelle temperature” = Temp, bei der Micellen nahe oder oberhalb der CMC aggregieren und eine separate Phase bilden (Cloud point)  Unterscheidung periphere und integrale Membranproteine Alkalische Carbonat Extraktion (Na2CO3, pH11,5) – Durch alkalischen pH werden Membranen zerstört – Vesikel > offenen “membrane sheets” > können abzentrifugiert werden – Löslicher Inhalt von Vesikeln und peripher Membran-assoziierte Proteine bleiben im Überstand – Integrale und Transmembranproteine verbleiben im Pellet Trition X-114 Phasentrennung – Nicht-ionisches Detergenz > bildet homogene Lösung bei 0°C – Phasentrennung in wässrige Phase und Detergenz-Phase bei Temperaturen oberhalb von 23 °C (cloud point) – Löslicher Inhalt von Vesikeln und peripher Membran-assoziierte Proteine gehen in die wässrige Phase – Integrale und Transmembranproteine verbleiben in der Detergenzphase  CMC – “Daumenregeln” Detergenzien mit hohen CMC-Werten zeigen eine schwächere Bindung →sind daher leichter wieder zu entfernen Detergenzien mit niedrigen CMC-Werten bilden stabilere Micellen (nur langsamer Molekül-Austausch) CMC und Aggregationszahl werden durch Temperatur, pH, Ionenstärke und Reinheit beeinflusst (Analyse Methode)  Solubilisierung von Membranproteinen Below CMC Above CMC Zur Solubilisierung von Membranproteinen werden Detergenzien bei ihrer 1 bis 3-fachen CMC verwendet. Alle Puffer sollten das Detergenz oberhalb der CMC enthalten. Welchen Einfluss haben Detergenzien auf die Anfangs beschriebenen Chromatographie- Methoden ?  Reinigung von Membranproteinen Chromatographie – Ionische Detergentien nicht mit Ionenaustauschern – Detergenzien können partiell Proteinladung maskieren > schwache Bindung an Ionenaustauscher – Größenausschlußchromatographie > Micelle vergrößert Mw – Absorption durch Detergenz (Detektionsprobleme) Detergenzwechsel kann sinnvoll sein Dialyse für Detergenz-Wechsel Biobeads für Detergenz-Wechsel (neutrale, makroporöse Polymer Beads)  Amphipole Amphipathische Polymere Stark hydrophiler “Backbone” mit verschiedenen hydrophoben Ketten Amphipols Detergenzmoleküle sind im konstanten GGW zwischen Monomer und Micelle, daher muss die Konzentration immer oberhalb der CMC sein >> Inaktivierung von Membranproteinen Biobeads Idee: Molekül entwerfen, das extrem hohe Affinität zur hydrophoben Proteinoberfläche hat Protein Translokation über die Membran des Endoplasmatischen Reticulums (ER) Eucaryotic cell RNC-Translokon Rekonstitution in Detergenz Der monomere Sec61 Komplex umgeben von einer gemischten Lipid/Detergenz Micelle Sec61 Phospholipid Detergenz naszierende Kette / Signalsequenz sind zum Teil in der Tunnelöffnung sichtbar Kaum konformationelle Unterschiede im Vergleich zum geschlossenen Translokon Ist das Translokon unter diesen Bedingungen überhaupt aktiv ???  Visualisierung des Sec Komplex in Becker et al., Science 2009 der nativen Lipidumgebung!  Rekonstitution in Membranvesikel Untersuchung des isolierten Membranproteins in “natürlicher” Membranumgebung  RNC-Translokon Rekonstitution in Nanodiscs a b Apolipoproteine = Proteinanteil der Lipoproteine, die wasserunlösliche Lipide im Blut transportieren.  Cryo-EM Struktur des SecYEG Komplexes aus E. coli eingebettet in eine Nanodisc a nur eine Kopie von SecYEG wurde in der Nanodisc identifiziert (>Monomer) Naszierende Kette ist sichtbar Molekulares Model für Nanodisc, Sec YEG und das 70S Ribosom konnten erstellt werden Frauenfeld et al., NSMB 2011 Makromolekulare Proteinkomplexe Wie kann man sie isolieren ? Wie kann man sie charakterisieren ? Makromolekulare Komplexe Tap-fusion: Tandem-Affinity Purification  Protein A Oberflächen Protein aus Staphylococcus aureus Bindet IgGs, heavy chain im Fc Teil  Calmodulin bindendes Peptid Calmodulin (CALcium-MODULated proteIN) ist ein intrazellulärer “Allzweck” Calcium Rezeptor Beteiligt an Calcium regulierten Prozessen Ca2+ Bindung >> Konformationsänderung Calmodulin hat selber keine enzymatische Aktivität, bindet aber in Abhängigkeit von Ca2+ an z.B. Kinasen  Makromolekulare Komplexe Tap-fusion: Tandem-Affinity Purification Entfernung von TEV Protease und weitere Kontaminationen Vorteile ? Vorteil: Nachteile ? Physiologische [Salz] Physiologischer pH Protein-Protein Interaktionen Two Hybrid Systeme Pull-down Assays Analytische Ultrazentrifugation Surface Plasmon Resonance (SPR) Thermophorese Isotherme Kalorimetrie (ITC) Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX)  Two Hybrid Systeme Wurde für Hefe Zellen entwickelt Benötigt werden – Sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor – DNA-bindende Domäne (BD) – Transkriptions-aktivierende Domäne (AB) – Müssen getrennt stabil sein – Reportergen, das Bindestelle für BD in seiner “Upstream activation site” (UAS) aufweist  Two-Hybrid Systeme Beute Köder Split YFP Read out über Fluoreszenz “Reportergen” Yeast-Two-Hybrid Systeme trp his leu ura ade  Pull-down Assays Fusion mit Glutathion-S-Transferse Kann unter den verschiedensten Bedingungen getestet werden: pH, Salz, +/- ATP, etc. Charakterisierung von Protein-Protein- Interaktionen wie stark ist die Interaktion ? wie schnell dissoziieren die Proteine voneinander ? wie werden diese Parameter durch – Proteinmodifikationen – kleine Moleküle – andere Proteine beeinflußt ?  Analytische Ultrazentrifugation In 1920er Jahren konstruiert Theodor Svedberg (Nobelpreis für Chemie 1926) max. rpm 70K > 350.000 fache Erdbeschleunigung Rotor dreht in Vakuumkammer gemessen wird Referenz gegen Proteinlösung Ortsaufgelöstes Konzentrationsprofil innerhalb der Messzelle wird kontinuierlich bestimmt (Absorptionsmessung)  Analytische Ultrazentrifugation Sedimentation Velocity Experiment Bestimmung des Sedimentations Koeffizienten Direkt abhängig von der Masse des Partikels  Surface Plasmon Resonance (SPR) Prisma Diodenarray Detektor Leuchtdiode kontinuierliches Flußsystem Biosensor-chip besteht aus Glasoberfläche mit dünnem Goldfilm Polarisiertes Licht wird von der Goldoberfläche reflektiert und erzeugt in der Goldschicht eine Oberflächen Plasmon Resonanz. Der Biosensor misst die Masseveränderung, die während der Interaktion des mobilen mit dem immobilisierten Bindungspartner auftritt Bindung von Molekülen verändert Refraktionsindex >> Änderung des Resonanzwinkels Surface Plasmon Resonance (SPR) Äquilibrium Anfangs viele Bindestellen  Microscale Thermophoresis Infrarot Laser Laser induziert definierten Temperatur-Gradienten Proteine zeigen charakteristische Wanderung im Temp-Gradienten Änderungen in der Hydrathülle verändern Wanderungsverhalten Beobachtung über einen Fluoreszenz-markierten Bindungspartner Vorteile: keine Immobilisierung notwendig wenig Material kleine Probenvolumina (10 µl)  Microscale Thermophoresis Infra red Laser Laser ON Laser OFF Fluorescence time Relative mobility = Fhot/Fcold Fluorescence detector 64 Thermophrese: Bindung von NAC an 80S Ribosomen 65  ITC-Isothermal Titration Calorimetry Jede Reaktion ist mit Enthalpie- Änderung (ΔH) verbunden Wärme wird an die Umgebung abgegeben (exotherm) oder von ihr aufgenommen (endotherme Reaktion) Universelle Eigenschaft, die unabhängig ist von der Größe der Moleküle Benötigt keine Immobilisierung oder Markierung ITC kann simultan alle Bindungsparameter direkt bestimmen (ΔG, ΔH, ΔS und Kd) ITC-Isothermal Titration Calorimetry Negative Heizleistung also exotherm Reaktionsenthalpie -12 kcal/mol Praefcke & Hermann, Biospektrum 1/2005 Im Überschuss  Kcal / mol injizierter Ligand Molares Verhältnis Protein/Ligand ΔG = -RTlnKa = ΔH-TΔS Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry https://mvsc.ku.edu HDX - ligand binding http://msr.dom.wustl.edu/  Zusammenfassung Membranproteine benötigen den Einsatz von Detergenzien für ihre Reinigung Detergenzien beeinflussen viele Reinigungsmethoden Viele Proteine (Enzyme) sind Bestandteil Makromolekularer Komplexe Makromolekulare Komplexe können unter physiologischen Bedingungen isoliert werden Identifikation von Interaktionspartnern – Yeast Two Hybrid Systeme – Pull-down assays Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen mittels: – Analytische Ultrazentrifugation – Surface Plasmon Resonanz (Biacore) – Thermophorese – Isotherme Titrations Kalorimetrie – Hydrogen – Deuterium Exchange mass spectrometry