Βιοτεχνολογική Παραγωγή Αμινοξέων PDF

Τμήμα Βιοτεχνολογίας 2020  Βιοτεχνολογική Παραγωγή Αμινοξέων Τα τελευταία 50 χρόνια οι βιοτεχνολογικές μέθοδοι αποτελούν την κυριότερη τεχνολογία παραγωγής αμινοξέων σε βιομηχανική κλίμακα. 9 από το 20 βασικά αμινοξέα έχουν ιδιαίτερη διατροφική αξία, καθ...

Τμήμα Βιοτεχνολογίας 2020  Βιοτεχνολογική Παραγωγή Αμινοξέων Τα τελευταία 50 χρόνια οι βιοτεχνολογικές μέθοδοι αποτελούν την κυριότερη τεχνολογία παραγωγής αμινοξέων σε βιομηχανική κλίμακα. 9 από το 20 βασικά αμινοξέα έχουν ιδιαίτερη διατροφική αξία, καθώς δεν βιοσυντίθονται από τους ζωικούς οργανισμούς n L-Βαλίνη n L-Λευκίνη n L-Ισολευκίνη n L-Λυσίνη n L-Θρεονίνη n L-Μεθειονίνη n L-Ιστιδίνη n L-Φαινυλαλανίνη n L-Τρυπτοφάνη Βιοτεχνολογική Παραγωγή Αμινοξέων Ετήσια κατανάλωση αμινοξέων (2004): n 2εκ. μετρικοί τόνοι n 4,5 δις US$ n 56% συμπληρώματα ζωοτροφών L-Lys, DL-Met, L-Thr, L-Trp n 32% Διατροφικά αμινοξέα L-Glu (MGS), L-Asp, L-Phe n 12% Λοιπά αμινοξέα Ανάπτυξη της σχετικής αγοράς με ρυθμούς που ξεπερνούν το 7% ετησίως n Σημαντικότερα αμινοξέα: n L-Γλουταμινικό (>1,5 εκατ. μετρικούς τόνους ετησίως) n L-Λυσίνη (>0.5 εκατ. μετρικούς τόνους ετησίως) n L-Θρεονίνη (>30 χιλ. μετρικούς τόνους ετησίως)  Βιομηχανική Παραγωγή Αμινοξέων Τεχνολογίες που έχουν χρησιμοποιηθεί στην βιομηχανική παραγωγή αμινοξέων: – Χημική Σύνθεση – Εκχύλιση από υδρολυμένα υποστρώματα – Ενζυμική Κατάλυση – Μικροβιακές ζυμώσεις Ανακάλυψη στα μέσα της δεκαετίας του 1950 του εδαφικού βακτηρίου Corynebacterium glutamicum: Παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων L- γλουταμινικού όταν αναπτύσσεται σε υπόστρωμα υδατανθράκων  Βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή αμινοξέων Πίνακας 1: Βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιούνται για την βιομηχανική παραγωγή αμινοξέων. Αμινοξύ Στέλεχος/μετάλλαγμα Παραγωγή (g/l) Απόδοση (g/100 g σακχαρόζης) L-Λυσίνη-HCL C. glumaticum B-6 100 40-50 L-Θρεονίνη E. coli KY 10935 100 40-50 L-Τρυπτοφάνη C. glumaticum KY9218/pIK9960 58 20-25 L-Τρυπτοφάνη E. coli 45 20-25 L-Φαινυλαλανίνη E. coli MWPWJ304/pMW16 51 20-25 L-Αργινίνη Brevibacterium flavum AJ12429 36 30-40 L-Ιστιδίνη C. glumaticum F81/pCH99 23 15-20 L-Ισολευκίνη E. coli Η-8461 30 20-30 L-Σερίνη Methylobacterium sp. MN43 65 30-35 L-Βαλίνη C. glumaticum VR 3 99 30-40 L-Μεθειονίνη????  Τα βασικά αμινοξέα βιοσυντίθονται από ενδιάμεσους μεταβολίτες του κεντρικού μεταβολισμού των υδατανθράκων Πυροσταφυλικό οξύ Γλυκόλυση και L-αλανίνη µεταβολική οδός L-βαλίνη Enter-Doudoroff L-λευκίνη Οξαλοξικό οξύ Κύκλος κιτρικού L-ασπαρτικό οξέος L-ασπαραγίνη Κύκλος γλυοξυλικού L-µεθειονίνη L-λυσίνη L-θρεονίνη L-ισολευκίνη 2-κετογλουταρικό Κύκλος κιτρικού L-γλουταµινικό οξύ οξέος L-γλουταµίνη L-αργινίνη L-προλινη 3-PGA Γλυκόλυση και L-σερίνη µεταβολική οδός γλυκίνη Enter-Doudoroff L-κυστεΐνη PEP Γλυκόλυση, Enter- L-φαινυλαλανίνη και Doudoroff, L-τυροσίνη 4-φωσφορική γλυκονεογέννεση L-τρυπτοφάνη ερυθρόζη Κύκλος φωσφοροπεντοζών Φωσφορική ριβόζη Κύκλος L-ιστιδίνη φωσφοροπεντοζών Βιοχημικές διεργασίες βιοσύνθεσης των 20 βασικών αμινοξέων Κατηγορίες αμινοξέων με βάση την ύπαρξη κοινών βιοσυνθετικών διεργασιών ενζύμων και ενδιάμεσων μεταβολιτών – Αμινοξέα που βιοσυντίθονται από απλές αντιδράσεις – Αμινοξέα με διακλαδιζόμενες πλευρικές αλυσίδες – Αρωματικά αμινοξέα – Θρεονίνη/Λυσίνη – Σερίνη/Γλυκίνη – Αμινοξέα που βιοσυντίθονται από διακριτές μεταβολικές διεργασίες  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Αφομοίωση της αμμωνίας- Βιοσύνθεση γλουταμινικού – Αφυδρογονάση του γλουταμινικού (GDH-Glutamate Dehydrogenase) – GS-GOGAT Συνθετάση της Γλουταμίνης (GS) Συνθάση του Γλουταμινικού (GOGAT) – Αφομοίωση της ΝΗ3 σε ΑΤΠ εξαρτώμενη αντίδραση: Σταθερά ισορροπίας της τάξης 103 προς την σύνθεση γλουταμίνης – Κm για την ΝΗ3 : 10-4Μ – (Κm GDH: 10-3 M)  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Τα βασικά αμινοξέα βιοσυντίθονται μέσω αντιδράσεων μεταφοράς της αμινομάδας (τρανσαμινώσεις) από γλουταμινικό ή γλουταμίνη σε κεντρικούς μεταβολίτες Βιοσύνθεση του Ασπαρτικού Βιοσύνθεση της Αλανίνης Βιοσύνθεση της Ασπαραγίνης  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Βιοσύνθεση Θρεονίνης και Λυσίνης – Μετατροπή του οξαλοξικού οξέος σε ασπαρτικό – Μετατροπή του ασπαρτικού σε δύο στάδια σε ασπαρτική ημιαλδεϋδη (Κεντρικός μεταβολίτης στη βιοσύνθεση L- μεθειονίνης, L- θρεονίνης, L-ισολευκίνης και L-λυσίνης) – Η βιοσύνθεση της L-λυσίνης διαφέρει μεταξύ των βακτηριακών ειδών.  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Βιοσύνθεση σερίνης και γλυκίνης – Η βιοσύνθεση σερίνης και γλυκίνης αποτελεί κύρια μεταβολική διεργασία με βασικό ρόλο στη βιοσύνθεση αμινοξέων, νουκλεϊνικών οξέων και λιπιδίων. – Στο E. coli 15% του αφομοιώσιμου C περνάει από την διεργασία όταν αναπτύσσεται σε υπόστρωμα γλυκόζης. H βιοσύνθεση της σερίνης ξεκινά με την οξείδωση του 3- φωσφογλυκερινικού οξέος προς 3- φωσφο-υδοξυπυροσταφυλικό Μεταφορά της αμινομάδας από γλουταμινικό: σχηματισμός 3- φωσφοσερίνης Αποφωσφορυλίωση της 3- φωσφοσερίνης προς σερίνη – Σχηματισμός γλυκίνης σε ένα στάδιο με απομάκρυνση της μεθυλομάδας.  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Βιοσύνθεση διακλαδιζόμενων αμινοξέων – Βιοσύνθεση Ισολευκίνης, Βαλίνης Η βιοσύνθεση της ισολευκίνης ξεκινά από την θρεονίνη Η βιοσύνθεση της βαλίνης ξεκινά από το πυροσταφυλικό οξύ. Μεγάλη ομοιότητα μεταξύ των ενδιάμεσων μεταβολιτών των δύο μεταβολικών οδών – Αντικατάσταση μιας αιθυλομάδας από μεθυλομάδα στο α-άτομο C των ενδιάμεσων μεταβολιτών. – Κοινά ένζυμα καταλύουν τέσσερα στάδια των διεργασιών – Κατανάλωση ενός NADPH ανά παραγόμενο αμινοξύ. – Η βιοσύνθεση της λευκίνης ξεκινά από την τελευταία πρόδρομη ένωση στη βιοσύνθεση της βαλίνης  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Βιοσύνθεση αρωματικών αμινοξέων – Η Βιοσύνθεση των αρωματικών αμινοξέων ξεκινά με την βιοσύνθεση του χορισμικού από φωσφοενολπυροσταφυλικό και 4- φωσφορική ερυθρόζη Φωσφοενολπυροσταφυλικό (PEP) – Παράγωγο της γλυκόλυσης, Enter- Doudoroff, γλυκονεογέννεση 4-φωσφορική ερυθρόζη – Ενδιάμεσος μεταβολίτης του κύκλου των φωσφοροπεντοζών – Το χορισμικό αποτελεί σημαντική πρόδρομη ένωση για τη βιοσύνθεση πολλών μεταβολιτών  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Βιοσύνθεση αρωματικών αμινοξέων Βιοσύνθεση φαινυλαλανίνης Βιοσύνθεση τυροσίνης Βιοσύνθεση τρυπτοφάνης  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Διακριτές μεταβολικές οδοί βιοσύνθεσης αμινοξέων Βιοσύνθεση κυστεΐνης – Το πρώτο αμινοξύ που βιοσυντίθεται κατά την διαδικασία αφομοίωσης του θείου Σχηματισμός ο-ακετυλοσερίνης από σερίνη και ακετυλο-CoA Προσθήκη S-2 από την διαδικασία αναγωγής των θειικών. Βιοσύνθεση μεθειονίνης Βιοσύνθεση αργινίνης  Βιοσύνθεση των βασικών αμινοξέων Διακριτές μεταβολικές οδοί βιοσύνθεσης αμινοξέων Βιοσύνθεση ιστιδίνης n Κοινή μεταβολική οδός σε όλους του οργανισμούς που είναι σε θέση να βιοσυνθέσουν ιστιδίνη n Η διαδικασία ξεκινά από τον δακτύλιο της ριβόζης που φέρεται από το 5- φωσφοριβοσυλ-1- πυροφωσφορικό οξύ (PRPP) Βιοσύνθεση προλίνης Βιοτεχνολογική Παραγωγή Αμινοξέων από το Corynebacterium Corynebacterium glutamicum – Αερόβιο, Gram-θετικό εδαφικό βακτήριο (γονιδίωμα: 3082 kb) – Το wt στέλεχος έχει την ικανότητα να παράγει και να εκκρίνει μεγάλες ποσότητες L-γλουταμινικού οξέος (50 g/l L-glutamic ανά 100 g/l glucose) – Αντίθετα δεν παράγονται μεγάλες ποσότητες άλλων αμινοξέων – Η παραγωγή αυξημένων ποσοτήτων άλλων αμινοξέων έχει γίνει εφικτή μόνο με τη χρησιμοποίηση μεταλλαγμένων στελεχών στα οποία οι μηχανισμοί αναδραστικής αναστολής ή καταστολής της γονιδιακής έκφρασης έχουν απενεργοποιηθεί – Παραγωγή L-λυσίνης, L-θρεονίνης, L-ισολευκίνης, L-τυροσίνης, L- φαινυλαλανίνης μέσω: Επαγωγής τυχαίων μεταλλάξεων και επιλογής επιθημιτών φαινοτύπων – Χημικής μεταλλαξιγέννεσης – UV ακτινοβόληση Γενετικής μηχανικής – Υπερέκφραση γονιδίων – Γενετική τροποποίηση ενζύμων Βιοτεχνολογική Παραγωγή Αμινοξέων από το Corynebacterium Ανάπτυξη τεχνικών και εργαλείων για το γενετικό μετασχηματισμό του Corynebacterium glutamicum που περιλαμβάνουν: – Διαθεσιμότητα κατάλληλων φορέων για το γενετικό μετασχηματισμό Πλασμιδιακοί φορείς που βασίζονται σε πλασμίδια των κορυνέμορφων βακτηρίων: – pBL1 – pHM1519 Οι νέοι πλασμιδιακοί φορείς (shuttle vectors) που αναπτύχθηκαν χαρακτηρίζονται από την ικανότητα κινητικότητας μεταξύ βακτηρίων (πχ: Ε. coli – C. glutamicum) – Ανάπτυξη μεθοδολογίας για την αποτελεσματική μεταφορά DNA Χημικός μετασχηματιμός – Μετασχηματισμός πρωτοπλαστών ή σφαιροβλαστών με PEG Electroporation Σύζευξη (μεταφορά πλασμιδίων από το E. coli)  Μεταβολική Μηχανική στην παραγωγή L-γλουταμινικού Μηχανισμός παραγωγής και έκκρισης L-γλουταμινικού από τα κορυνεμορφα βακτήρια – Τα κορυνέμορφα βακτήρια απαιτούν βιοτίνη για την ανάπτυξη τους – Η παραγωγή και έκκριση του γλουταμινικού επάγεται σε συνθήκες έλλειψης βιοτίνης – Η παραγωγή L-γλουταμινικού επάγεται από: Απορυπαντικά (Tween40, Tween60) Αντιβιοτικά (b-lactam: πενικιλίνη) Σε στελέχη αυξοτροφικά για τη γλυκερόλη ή λιπαρά οξέα – Μοντέλο τροποποίησης της περατότητας της κυτταροπλασματικής μεμβράνης Όλοι οι παράγοντες που επάγουν την έκκριση L-γλουταμινικού επιδρούν στην κυτταρική μεμβράνη ή τα κυτταρικά τοιχώματα Η βιοτίνη αποτελεί συμπαράγοντα της καρβοξυλάσης του ακέτυλο-CoA – Μοντέλο τροποποίησης των μεταβολικών ροών Η δραστικότητα της αφυδρογονάσης του 2-κετογλουταρικού μειώνεται με την επαγωγή της παραγωγής γλουταμινικού σε συνθήκες έλλειψης βιοτίνης Γενετικές μελέτες έχουν δείξει επαγωγή αλλαγών στις μεταβολικές ροές σε συνθήκες υπερπαραγωγής γλουταμινικού  Κλωνοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή L- γλουταμινικού Η τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA και γενετικής ανάλυσης έχουν επιτρέψει την απομόνωση πολλών γονιδίων που επιδρούν στην αποδοτική παραγωγή L- γλουταμινικού στα κορυνέμορφα βακτήρια – Το γονίδιο DtsR1 έχει συμαντικό ρόλο στην υπερπαραγωγή L-γλουταμινικού σε συνθήκες έλλειψης βιοτίνης – Τα προϊόντα των γονιδίων DtsR1 και ΑccBC σχηματίζουν σύμπλοκα με βιοτίνη – Το σύμπλοκο DtsR1-AccBC παίζει συμαντικό ρόλο στην βιοσύνθεση λιπαρών οξέων  Ανάλυση βιοσυνθετικών οδών στα κορυνέμορφα βακτήρια Μεταβολισμός υδατανθράκων – Η είσοδος των υδατανθράκων στο C. glutamicum πραγματοποιείται μέσω του συστήματος PTS (phosphoenolpyruvate sugar transport system) – Σημαντικός ρόλος των μεταβολικών οδών: Γλυκόλυση (EMP): Παραγωγή πρόδρομων Οδός των φωσφορικών πεντοζών (OPP) : Παραγωγή NADPH – Η ρύθμιση του λόγου ροής μεταξύ των δύο οδών έχει σημαντική ρόλο κατά την παραγωγή αμινοξέων Μείωση της ροής μέσω OPP κατά την υπερπαραγωγή γλουταμινικού σε συνθήκες έλλειψης βιοτίνης  Ανάλυση βιοσυνθετικών οδών στα κορυνέμορφα βακτήρια Αναπληρωτικές αντιδράσεις – Η ροή μεταβολιτών μέσα από τις αναπληρωτικές αντιδράσεις του κύκλου του κιτρικού οξέως αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για τη βιοσύνθεση αμινοξέων – Το σύστημα αναπληρωτικών αντιδράσεων είναι ιδιαίτερα πολύπλοκο στα κορυνέμορφα βακτήρια – Στην παραγωγή οξαλοξικού συνεισφέρουν Καρβοξυλάση του PEP (PEPC) Καρβοξυλάση του πυροσταφυλικού (PC) – Κατά την παραγωγή L-γλουταμινικού σημαντικό ρόλο έχει η PC PEPC: ασπαρτικό (-), ΝΗ4-γουταμινικό (-) ακέτυλο-CoA (+), 1,6-Dp-φρουκτόζη (+) Κόμβος PEP-Πυροσταφυλικού-Οξαλοξικού στο C. glutamicum PC: ασπαρτικό (-), ακέτυλο-CoA (-) AceEF: E1, E2 pyruvate dehydrogenase subunits Και τα δύο ένζυμα εντοπίζονται κατά την παραγωγή Lpd: E3pyruvate dehydrogenase subunit αμινοξέων με πηγή άνθρακα γλυκόζη MalE: malic enzyme Mdh: malate dehydrogenase Ο επίτευξη μέγιστου ρυθμού ανάπτυξης και παραγωγής Mqo: malate:quinone oxidoreductase αμινοξέων απαιτεί τη δράση της PC ODx: axaloacetate decarboxylase – 90% ΟΑΑ παράγεται από την PC Pck: PEP carboxykinase – 10% OAA παράγεται από την PEPC PtsIHG: phosphotransferase system Pqo: pyruvate:quinone oxidoreductase Pyc: pyruvate carboxylase Pyk: pyruvate kinase  Επεμβάσεις μεταβολικής μηχανικής στις αντιδράσεις αναπλήρωσης Η αύξηση της διαθεσιμότητας οξαλοξικού και άλλων ενδιάμεσων του κύκλου του κιτρικού οξέος, έχει αποτέλεσμα την αύξηση των παραγομένων αμινοξέων – Προσθήκη φουμαρικού στο υλικό καλλιέργειας Όλα τα ένζυμα του κόμβου PEP-Πυροσταφυλικού- Οξαλοξικού έχουν χρησιμοποιηθεί στις προσπάθειες γενετικής βελτίωσης του C. glutamicum Η PEPC αποτελεί παραδοσιακό στόχο στις προσπάθειες βελτίωσης – Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει την μικρή συνεισφορά του ενζύμου στην υπερπαραγωγή αμινοξέων Η υπερέκφραση της PC οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων γλουταμινικού, λυσίνης, θρεονίνης Η απενεργοποίηση της PC οδηγεί σε μείωση των επιπέδων αντίστοιχων αμινοξέων Σημαντικό ρόλο στην υπερπαραγωγή έχει η PEPCk (Pck) – Απενεργοποίηση της PEPCk οδήγησε σε 440% αύξηση στα επίπεδα του L-γλουταμινικού – Επερέκφραση της PEPCk οδήγησε σε 40% μείωση στα επίπεδα του L-γλουταμινικού  Βιοσύνθεση L-γλουταμινικού στα κορυνέμορφα βακτήρια Ο κύκλος κιτρικού οξέος (TCA cycle) – Συνθάση του κιτρικού (CS) Κωδικοποιείται από το γονίδιο gtlA Η δραστικότητα της CS δεν ρυθμίζεται από το NADH, και την συγκέντρωση του 2-κετογλουταρικού Υπερέκφραση του gltA δεν επηρέασε τα επίπεδα L- γλουταμινικού Απενεργοποίηση του gtlA οδηγεί σε αυξοτροφία ως προς το γλουταμινικό – Αφυδρογονάση του ισοκιτρικού (ICDH) Σε αντίθεση με το E. coli απαιτεί NADP+ Αναστέλλεται από ΟΑΑ και γλυοξιλικό Υπερέκφραση του icd δεν επηρέασε τα επίπεδα L- γλουταμινικού Απενεργοποίηση του icd οδηγεί σε αυξοτροφία ως προς το γλουταμινικό – Αφυδρογονάση του 2-κετογλουταρικού (ODHC) H δραστικότητα της ODHC αποτελεί το σημαντικότερο παράγοντα στην παραγωγή L-γλουταμινικού Η δραστικότητα της ΟDHC μειώνεται σε συνθήκες υπερπαραγωγής L-γλουταμινικού  Βιοσύνθεση L-γλουταμινικού στα κορυνέμορφα βακτήρια Αφομοίωση της αμμωνίας – Αφυδρογονάση του γλουταμινικού (GDH) Απαντάται σε όλα τους μικροοργασνισμούς Σημαντικός ρόλος στην βιοσύνθεση γλουταμινικού σε υψηλές συγκεντρώσεις αμμωνίας (>1 mmol/l) – Ενζυμικό σύστημα GS/GOGAT Σημαντικός ρόλος στην βιοσύνθεση γλουταμινικού σε χαμηλές συγκεντρώσεις αμμωνίας ( Tyr301 Gly345 -> Asp345 – H παραπάνω μεταλλάξεις δεν απαιτείται να φέρονται και από την LysCα υπομονάδα. – Η άρση του μηχανισμού αναδραστικής αναστολής εντοπίζεται μέσω της ικανότητας ανάπτυξης παρουσία του αναλόγου L- λυσίνης AEC (amino-ethyl-cysteine) Μεταβολική μηχανική στη βιοσύνθεση της λυσίνης στο C. glutamicum Συνθετάση του διυδροδιπικολινικού (DapA) – Τρίτο στάδιο στη βιοσύνθεση L-λυσίνης από ασπαρτικό – Αποτελεί το σημείο διακλάδωσης της βιοσυνθετικής διεργασίας προς L-λυσίνη ή L-θρεονίνη – Καταλύει τη συμπύκνωση ενός μορίου L-ασπαρτικής ημιαλδεΰδης με ένα μόριο πυροσταφυλικού. – Η υπερέκφραση του DapA στο στέλεχος w.t. ΑΤCC13032 αυξάνει τα επίπεδα λυσίνης σε βαθμό εξαρτώμενο από τη γονιδιακή δόση n Εναλλακτική αύξηση των επιπέδων DapA μέσω τροποποιήσεων στον προαγωγέα του ενδογενούς γονιδίου Ο προαγωγέας w.t. Παρουσιάζει σχετικά χαμηλά επίπεδα έκφρασης Σημειακές μεταλλάξεις στην περιοχή - 10 αυξάνουν τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου Μεταβολική μηχανική στη βιοσύνθεση της λυσίνης στο C. glutamicum Η επίδραση της διαθεσιμότητας οξαλοξικού – Η αναπλήρωση του οξαλοξικού κατά την υπερπαραγωγή λυσίνης γίνεται κυρίως μέσα από τη δράση της PC – Αντίθετα, η PEPC δεν αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για την ανάπτυξη και την παραγωγή λυσίνης – Υπερέκφραση της PC (Pyc) στο στέλεχος C. glutamicum MH20-22B οδηγεί σε 50% αύξηση στα επίπεδα λυσίνης – Η διαθεσιμότητα του οξαλοξικού ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από την ισορροπία μεταξύ C3-καρβοξυλίωσης και C4-αποκαρβοξυλίωσης Η υπερπαραγωγή λυσίνης προϋποθέτει την μείωση της αποκαρβοξυλίωσης των C4-οργανικών οξέων Αύξηση των επιπέδων λυσίνης μέσω απενεργοποίησης της PEP καρβοξυκινάσης Α: Παραγωγή λυσίνης 0.29g /gr glucose B: Παραγωγή λυσίνης 0.18g /gr glucose C: Ανάπτυξη D: Παραγωγή γλουταμινικού C: Ανάπτυξη μεταλλάγματος ισοκιτρικής αφυδρογονάσης Μεταβολική μηχανική στη βιοσύνθεση της λυσίνης στο C. glutamicum Η επίδραση της διαθεσιμότητας NADPH – NADPH παράγεται από τη οδό των φωσφορικών πεντοζών και την ισοκιτρική αφυδρογονάση Μεταβολική μηχανική στη βιοσύνθεση της λυσίνης στο C. glutamicum Ο μηχανισμός έκκρισης λυσίνης – Η μελέτη του μοριακού μηχανισμού μεταφοράς της λυσίνης έγινε εφικτή με το χαρακτηρισμό μεταλλαγμένων στελεχών που υπερσυσσωρεύουν λυσίνη στο κυτταρόπλασμα – Μεταφορέας Λυσίνης LysE 236 aa 25.4 kDa 5 διαμεμβρανικές έλικες 1 υδρόφοβη περιοχή To ΔlysE στέλεχος δεν εκκρίνει λυσίνη – Η μεταφορά λυσίνης οδηγείται από το ΔΨ και ρυθμίζεται από την διαβάθμιση pH Λυσίνης Μεταξύ εσωτερικού και εξωτερικού του κυττάρου – Υπερέκφραση του lysE αυξάνει το ρυθμό έκρισης λυσίνης 5 φορές (3.76 nmol min-1) σε σύγκριση με το w.t. στέλεχος Μεταβολική μηχανική στη βιοσύνθεση της λυσίνης στο C. glutamicum Προσθετική επίδραση επεμβάσεων στην παραγωγή λυσίνης Στέλεχος AJ11082 LysCFBR: Ρυθμιστική υπομινάδα κινάσης ασπαρτικού dapB: Αναγωγάση του διυδροδιπικολινικού dapA: Συνθάση του διυδροδιπικολινικού Στέλεχος ΜΗ20-22Β Αυξoτροφικότητα στη λευκίνη Ανθεκτικότητα στο AEC Pyc: καρβοξυλάση του πυροσταφυλικού LysCFBR: Ρυθμιστική υπομινάδα κινάσης ασπαρτικού dapB: Αναγωγάση του διυδροδιπικολινικού dapA: Συνθάση του διυδροδιπικολινικού LysE: περμεάση της λυσίνης