Biomedycyna: Zagadnienia Zaliczeniowe z Analizy Chemicznej Biocząsteczek PDF

ANALIZA CHEMICZNA BIOCZĄSTECZEK – zagadnienia WYKŁADY Podstawowe zagadnienia z analizy związków chemicznych 1.​ Jakie badania obejmuje analiza chemiczna? Julia Słowińska Analiza chemiczna jest to zespół czynności, które należy wykonać, aby związki chemiczne lub ich mieszaninę rozło...

ANALIZA CHEMICZNA BIOCZĄSTECZEK – zagadnienia WYKŁADY Podstawowe zagadnienia z analizy związków chemicznych 1.​ Jakie badania obejmuje analiza chemiczna? Julia Słowińska Analiza chemiczna jest to zespół czynności, które należy wykonać, aby związki chemiczne lub ich mieszaninę rozłożyć na składniki, a następnie zidentyfikować je i oznaczyć ilościowo. Badanie składu chemicznego substancji złożonej można prowadzić w celu określenia składu jakościowego pierwiastków (C,H,N,S,P) lub w celu oznaczania składu ilościowego (stosunku między substancjami w niej zawartymi). 2.​ Podział metod analizy chemicznej Maciej Krukowski Podział ze względu na naturę:​ - analiza ilościowa​ - analiza jakościowa ​ Podział ze względu na rodzaj uzyskiwanej informacji:​ - chemiczna ilościowa - ilościowy skład substancji (np. udział procentowy / stężenie wybranego składnika)​ - chemiczna jakościowa - ustalenie składu próbki (czy dany związek tu występuje?) (analiza elementarna - pełny skład pierwiastkowy)​ - chemiczna strukturalna - ustalenie struktury związku ​ - oznaczanie stałych fizycznych (temperatura topnienia i wrzenia, rozpuszczalność) ​ Podział ze względu na ilość i sposób wykorzystywanej próbki:​ - MAKROanaliza - próbka powyżej 10mg​ - MIKROanaliza - próbka poniżej 10mg​ - UTRAMIKROanaliza - próbka poniżej 1mg Podział ze względu na rodzaj stosowanych technik:​ - metody spektroskopowe (IR, UV, NMR, MS)​ ​ - emisyjne - promieniowanie EMITOWANE przez próbkę​ ​ - absorpcyjne - promieniowanie PRZECHODZĄCE przez próbkę (analiza struktury związków organicznych)​ - metody chromatograficzne​ - metody instrumentalne Metody spektroskopowe 3.​ Rodzaje spektrometrii i parametry użytego w nich promieniowania elektromagnetycznego. Anna Dańska Podział spektroskopii ze względu na promieniowanie elektromagnetyczne:  -​ spektroskopia UV-VIS - promieniowanie ultrafioletowe oraz w zakresie światła widzialnego (UV 200-400nm, VIS 400-700nm) -​ spektroskopia plazmowa - promieniowanie ultrafioletowe oraz w zakresie światła widzialnego (UV 200-400nm, VIS 400-700nm) -​ spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) - promieniowanie ultrafioletowe oraz w zakresie światła widzialnego (najczęściej widzialne, 400-600nm) -​ spektroskopia Ramana - promieniowanie laserowe (często w zakresie widzialnym lub bliskiej podczerwieni) (VIS 400-700nm, bliska podczerwień 700-2500nm) -​ spektroskopia IR - promieniowanie podczerwone (750nm - 1mm) -​ spektroskopia fourierowska - promieniowanie podczerwone (4000cm-1 - 400cm-1) -​ spektroskopia oscylacyjna - promieniowanie podczerwone (4000cm-1 - 400cm-1) -​ dichroizm kołowy - promieniowanie ultrafioletowe, bliska podczerwień (najczęściej UV, 180-250nm) -​ spektroskopia rentgenowska - promieniowanie rentgenowskie (0,1nm-10nm) -​ spektroskopia gamma - promieniowanie gamma (poniżej 0,1nm) -​ spektroskopia NMR - fale radiowe (60-900 MHz) 4.​ Widma spektroskopowe. Lio Widmo spektroskopowe to dwuwymiarowa zależność, najczęściej przedstawiana na płaszczyźnie jako wykres. Analizą widm i wyjaśnianiem mechanizmów ich powstawania zajmuje się spektroskopia. Ta metoda badawcza wykorzystywana jest w wielu dziedzinach nauk doświadczalnych, głównie fizyce, chemii, analizie instrumentalnej. KLASYFIKACJA WIDM Ze względu na sposób powstania: ​ widmo emisyjne– powstaje w wyniku emisji promieniowania przez ciało Widmo emisyjne powstaje, gdy obdarzone ładunkiem elektrycznym elektrony, atomy, cząstki lub fragmenty cząsteczek tworzących dane ciało, będąc wzbudzonymi, przechodzą ze stanu o wyższej energii do stanu o niższej energii. Przejściu temu towarzyszy emisja kwantu promieniowania elektromagnetycznego o energii równej różnicy energii poziomów, między którymi przeszła cząstka.  ​ widmo absorpcyjne – powstaje w wyniku oddziaływania (przejścia lub odbicia) fali o widmie zazwyczaj ciągłym z substancją. Występowanie widma absorpcyjnego jest spowodowane pochłanianiem przez substancję fotonów tylko o określonych długościach fal – takich, które mogą spowodować wzbudzenie atomu lub cząsteczki do stanu dopuszczalnego przez prawa mechaniki kwantowej. Zmiany stanu wzbudzenia dotyczą zarówno elektronów jak i oscylacji, rotacji całych cząstek. Analizy widmowe stanowią najdokładniejsze narzędzia do wykrywania i badania substancji. I Magnetyczny rezonans jądrowy NMR (1HNMR, 13C NMR) 5.​ Jakie jądra atomowe można obserwować w spektroskopii NMR? Hubert Kulik Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) pozwala na badanie jąder atomowych posiadających spin jądrowy różny od zera. Aby jądro było aktywne w NMR, musi mieć niezerowy moment magnetyczny, co wynika z jego liczby masowej i liczby protonów. Podstawowe kryterium obserwowalności w NMR ​ Jądra o spinie 0 (np. 12C^{12}C12C, 16O^ {16}O16O) nie są aktywne w NMR. ​ Jądra o spinie 1/2 (np. 1H^1H1H, 13C^13C13C, 15N^15N15N, 19F^19F19F, 31P^31P31P) są najczęściej badane, ponieważ dają proste widma. ​ Jądra o spinie większym niż 1/2 (np. 2H^2H2H, 14N^14N14N, 17O^17O17O, 35Cl^35Cl35Cl, 39K^39K39K) mają kwadrupolowy moment elektryczny, co może prowadzić do poszerzenia sygnałów w NMR. 6. Jakich informacji dostarcza widmo: Ola Oleszczyńska a. protonowego rezonansu magnetycznego (1H NMR) -​ Liczba sygnałów → Informuje o liczbie unikalnych środowisk protonów w cząsteczce. -​ Położenie sygnałów (przesunięcie chemiczne, δ) → Wskazuje, w jakim otoczeniu chemicznym znajdują się protony (np. w pobliżu grup karbonylowych, aromatycznych itp.). -​ Intensywność sygnałów (pole powierzchni pod pikami) → Odpowiada liczbie protonów danego typu. -​ Splitting (rozszczepienie sygnałów, sprzężenie spinowo-spinowe) → Informuje o liczbie sąsiadujących protonów (według reguły n+1). -​ Kształt i szerokość sygnałów → Może wskazywać na obecność wymiany protonów (np. w grupach -OH, -NH). b. węglowego rezonansu magnetycznego (13C NMR) -​ Liczba sygnałów → Informuje o liczbie unikalnych środowisk atomów węgla w cząsteczce. -​ Położenie sygnałów (przesunięcie chemiczne, δ) → Określa rodzaj węgla (np. alkilowy, karbonylowy, aromatyczny). -​ Brak integracji sygnałów → W przeciwieństwie do 1H NMR, nie można bezpośrednio określić liczby atomów węgla odpowiadających danemu sygnałowi. -​ Brak splittingu w standardowych widmach → Ze względu na niską naturalną zawartość 13C (ok. 1,1%) w widmach zwykle stosuje się dekuplowanie protonowe, co eliminuje sprzężenie ^13C-^1H i powoduje, że każdy sygnał jest pojedynczą linią. 7. Intensywność sygnałów protonowego rezonansu magnetycznego – jakich informacji dostarcza. Amelia Odeyale -​ ilość protonów, która emituje dany sygnał (pole powierzchni pod pikami) -​ rozmieszczenie protonów w cząsteczce → struktura chemiczna -​ środowisko molekularne -​ zmiany w konformacji cząsteczek -​ względna zawartość poszczególnych składników w próbce -​ czystość próbki i ewentualny wpływ rozpuszczalnika na analizę 8. Co to jest i jakich informacji dostarcza o badanym związku wartości przesunięć chemicznych sygnałów w 1H NMR. Maja Bojarczuk wartość przesunięć sygnałów chemicznych - niewielkie różnice w położeniu obserwowanych na widmie sygnałów absorpcyjnych, wyrażana w Hz informuje o: -​ otoczeniu chemicznym badanego protonu -​ Im wyższe przesunięcie chemiczne (δ\deltaδ, większa wartość ppm), tym bardziej odsłonięty proton na działanie pola magnetycznego, co wskazuje na obecność elektroujemnych grup -​ Protony otoczone przez elektroujemne atomy (np. O, N, Cl, Br, F) są odsłonięte i wykazują większe przesunięcia chemiczne -​ Protony osłaniane przez chmurę elektronową (np. w obrębie wiązań π\piπ w układach aromatycznych) mają niższe wartości ppm -​ Rodzaju grup funkcyjnych (Alifatyczne protony: 0–3 ppm, Protony przy atomach elektroujemnych (-OH, -NH, -Cl, -Br): 3–5 ppm, Protony przy wiązaniach podwójnych (C=CH): 4–7 ppm, Protony aromatyczne (-C₆H₅): 6–9 ppm, Protony aromatyczne (-C₆H₅): 6–9 ppm, Protony karboksylowe (-COOH): 10–13 ppm) 9. Czym jest multipletowość sygnałów w widmie protonowego rezonansu magnetycznego? Martyna Jachacz Multipletowość - krotność linii/pików w sygnale: -​ Co jest powodem multipletowości (krotności linii)? = sprzężenie spinowo-spinowe protonów nierównocennych - rozszczepienie sygnału protonu przez obecność innych, nierównocennych mu protonów  -​ obowiązuje reguła n+1 gdzie n to ilość protonów (H+) przy sąsiednim atomie węgla -​ “czyste multiplety” występują w przypadku dalekiego rozmieszczenia od siebie sygnałów -​ wyróżniamy: -​ singlety - 1 sygnał (1 kreska); brak protonu w sąsiednich grupach -​ (singletem zawsze będzie sygnał od grupy: karboksylowej (-COOH), hydroksylowej (-OH), aminowej (-NH2), amidowej (NH-CO)) -​ dublety - 2 sygnały (2 kreski); 1 proton w sąsiednich grupach -​ triplety - 3 sygnały (3 kreski); 2 protony w sąsiednich grupach -​ kwartety - 4 sygnały (4 kreski); 3 protony w sąsiednich grupach 10. Stała sprzężenia w protonowym rezonansie magnetyczny. Natalia Borkowska ​ Jest to odległość pomiędzy określonymi pikami powstającymi w wyniku sprzężenia spinowo spinowego(rozszczepienia). ​ Jest wartością bardzo charakterystyczną dla pewnych ugrupowań pozwala to z dużą skutecznością je określić ​ Wyrażana w hercach (od 0 do 20)Hz ​ Wartości znaleźć można w odpowiednich tablicach ​ Obliczana jest poprzez różnicę w Hz odpowiednich pików ​ Wartość Hz dla określonych pików można obliczyć z ppm poprzez pomnożenie przez częstotliwość pola aparatu II Spektrometria masowa MS 11.​Do czego służy MS. Marcel -​ Technika analityczna umożliwiająca dokładny pomiar masy -​ Nie wykorzystuje się ani zjawiska absorpcji ani emisji -​ Pozwala na analizę ilościową, charakterystykę i identyfikację cząsteczki ze względu na stosunek jej masy do ładunku [m/z] -​ Użycie w praktyce: -​ Identyfikacja związków chemicznych i ich mieszanin -​ Ustalanie struktury zw. chemicznych -​ Ustalanie składu pierwiastkowego -​ Ustalanie składu izotopowego (pochodzenie cząsteczki) -​ Precyzyjne ustalanie składu złożonych mieszanin chemicznych związków o dużych masach molowych 12.​Określenie masy cząsteczek. Milena Wiech W kontekście spektrometrii mas (MS, mass spectrometry) określanie masy cząsteczkowej opiera się na analizie stosunku m/z (masa do ładunku) jonów powstałych w wyniku jonizacji próbki. ​ Przygotowanie próbki i jonizacja ○​ Próbka jest jonizowana, np. metodą ESI (Electrospray Ionization) lub MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). ○​ Powstają jony molekularne (odpowiadają masie cząsteczkowej badanej substancji) i fragmenty jonowe(powstają w wyniku rozpadu jonu  molekularnego, umożliwiają analizę struktury cząsteczki i identyfikację substancji) ​ Pomiar stosunku m/z ○​ Jony są separowane na podstawie ich m/z w analizatorze (np. TOF, quadrupol). ○​ Detektor rejestruje intensywność sygnału dla różnych wartości m/z. ​ Interpretacja widma MS ○​ Sygnał o najwyższym m/z odpowiada najczęściej jonowi molekularnemu [M+H]⁺, co pozwala określić masę cząsteczkową. ○​ Fragmenty dostarczają informacji o strukturze cząsteczki. ○​ Można także identyfikować izotopy, np. różnice w stosunkach intensywności dla izotopów węgla (¹²C vs. ¹³C) czy chloru (³⁵Cl vs. ³⁷Cl). 13.​Widmo masowe. Adam Szykier Widmo masowe To wykres pokazujący: ​ ​ Oś X: stosunek masy do ładunku (m/z). ​ ​ Oś Y: intensywność sygnałów, wskazująca ilość jonów o danym m/z. Widmo pozwala określić masę cząsteczkową i obecność różnych fragmentów związku. Przykłady jonów w widmie ​ ​ Jon molekularny (M⁺): odpowiada masie całkowitej cząsteczki. ​ ​ Jony fragmentacyjne: powstają w wyniku rozpadu cząsteczki, dostarczając informacji o strukturze. ​ ​ Piki izotopowe: wynikają z obecności izotopów, np. węgla-13. Zastosowania spektrometrii masowej ​ ​ Identyfikacja białek i związków organicznych. ​ ​ Badanie struktury chemicznej (np. sekwencjonowanie białek). ​ ​ Analiza czystości i zanieczyszczeń. ​ ​ Wykrywanie izotopów oraz badania proteomiczne i metabolomiczne  14.​Rodzaje jonów w widmie MS. Mikołaj Ciepieniak - jon molekularny – powstaje na skutek utraty jednego elektronu - jon pseudomolekularny - powstaje na skutek dołączenia do cząsteczki jonów H+, Na+ lub Cl- oraz po odłączeniu jonów H+ - jony fragmentacyjne – powstają na skutek przegrupowania (tworzenie nowych wiązań, przeniesienie atomu w obrębie cząsteczki) oraz rozpadu wiązań 15.​Czym jest MALDI w spektrometrii masowej? Natalia Łępa MALDI - desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą -​ jedna z technik jonizacji -​ służy do analizy białek, peptydów, oligosacharydów, oligonukleotydów, polimerów, a także niektórych polarnych związków organicznych ( substancje o masie do mln Da) -​ oparta jest na jonizacji promieniem lasera. Energia lasera przekazywana jest matrycy zmieszanej z badaną próbką i przenoszona na analizowaną substancję Budowa: 1.​ Układ wprowadzenia próbki 2.​ Źródło jonów (jonizator) – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik (w MALDI jonizacja za pomocą lasera), z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych, na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. 3.​ Analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku. 4.​ Detektor jonów – urządzenie „zliczające” jony napływające z analizatora. Jony analizowane są za pomocą detektora czasu przelotu (time-of-flight, TOF), w którym jony cięższe docierają wolniej do detektora niż jony lżejsze  5.​ Rejestrator ( w MALDI funkcje rejestratora pełni detektor) III Spektroskopia w podczerwieni IR 16.​Analiza widm. Ala Widma IR - wykres zależności przepuszczalności (transmitancji) lub absorbancji promieniowania od liczby falowej [cm-1]. ​ Określone grupy funkcyjne związków organicznych mają swój zakres absorpcji promieniowania podczerwonego. ​ Jednoznaczna identyfikacja - dwa związki chemiczne rzadko mają identyczne widma w całym zakresie. ​ Są bazy danych i tablice, które pozwalają zidentyfikować związek chemiczny (skład ilościowy) Poszczególne rodzaje wiązań mając podobną różnicę energii pomiędzy poziomami oscylacyjnymi, absorbują promieniowanie o charakterystycznej częstotliwości dając pasmo w tym samym zakresie niezależnie od innych szczegółów struktury cząsteczki. Oznacza to, że te same grupy funkcyjne (np. C=O, N-H, O-H ) w różnych związkach dają charakterystyczne pasma absorpcyjne, które znajdują się w porównywalnym zakresie liczb falowych. 1.​ 4000-2500 cm⁻¹ grupy N-H, C-H, O-H (drgania rozciągające) 2.​ 2500-2000 cm⁻¹ grupy zawierające wiązania potrójne np. alkiny C≡C, nitrile C≡N. 3.​ 2000-1500 cm⁻¹ drgania rozciągające wiązań podwójnych (C=O, C=C, C=N).  4.​ poniżej 1500 cm⁻¹ - „zakres daktyloskopowy” (fingerprint region), posiada układ pasm charakterystycznych dla danej cząsteczki. Są tutaj pasma drgań rozciągających wiązań pojedynczych + wiele pasm drgań deformacyjnych. Identyfikacja badanej substancji na podstawie porównania widma IR z widmem związku wzorcowego - identyczność zakresu „odcisku palca” stanowi potwierdzenie identyczności badanego związku z wzorcem. Aminy - 3200-3600 cm⁻¹, 1500-1650 cm⁻¹ oraz 1000-1360 cm⁻¹ (drgania wiązań N-H i C-N) 3200-3600 cm⁻¹ ​ Aminy I-rzędowe - drgania rozciągające asymetryczne i symetryczne N-H ​ Aminy II-rzędowe - tylko jedno pasmo ​ Aminy III-rzędowe - absorpcja w tym zakresie nie występuje intensywność: aminy aromatyczne > aminy alifatyczne 1500-1650 cm⁻¹ (drgania deformacyjne N-H) ​ Aminy I-rzędowe - duże natężenie ​ Aminy II-rzędowe - małe natężenie 660-910 cm⁻¹ (drgania wachlarzowe N-H) Aminy I- i II-rzędowe (ciekłe) - średnie lub silne, szerokie pasmo absorpcji (drgania rozciągające C-N): ➔​ 1020-1250 cm⁻¹ - aminy alifatyczne ➔​ 1260-1340 cm⁻¹ - aminy aromatyczne IV Spektroskopia UV – VIS 17.​Na czym polega technika UV VIS Aleksandra Maliszewska Spektroskopia UV-Vis to technika spektroskopii absorpcyjnej, która wykorzystuje promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie ultrafioletu (UV) i światła widzialnego (Vis). W tej metodzie, próbka jest oświetlana promieniami o różnych długościach fal, a następnie mierzone jest światło, które przeszło przez próbkę. Główne aspekty działania spektroskopii UV-Vis: Absorpcja promieniowania: Kiedy promieniowanie UV lub widzialne przechodzi przez próbkę, część światła jest absorbowana przez substancje w niej zawarte. Absorpcja ta jest zależna od struktury molekularnej i obecności chromoforów Przejścia elektronowe: Absorpcja promieniowania UV powoduje przejścia elektronów z niższych poziomów energetycznych na wyższe. Te przejścia są charakterystyczne dla pewnych grup funkcyjnych, które posiadają elektrony o niskiej energii wzbudzenia. Chromofory: Chromofor to część cząsteczki odpowiedzialna za absorpcję światła i nadawanie barwy. Cząsteczki absorbują określone długości fal i przepuszczają lub odbijają pozostałe. Widmo UV-Vis: Mierzone światło, które przechodzi przez próbkę, jest rejestrowane przez detektor, tworząc unikalne widmo UV-Vis, znane również jako widmo absorpcyjne. Widmo to przedstawia zależność absorbancji lub przepuszczalności światła od długości fali. 18.​Chromofor Karol Nowacki​ Chromofor to grupa atomów w cząsteczce, odpowiedzialna za absorpcję światła w określonym zakresie długości fal. Jest to struktura chemiczna, która pochłania  promieniowanie elektromagnetyczne, prowadząc do przejścia elektronów na wyższy poziom energetyczny. Chromofory mają kluczowe znaczenie w różnych technikach spektroskopowych, szczególnie w: 1.​ Spektroskopii UV-Vis (ultrafioletowo-widzialnej) ○​ Wykorzystuje absorpcję promieniowania UV (200–400 nm) oraz widzialnego (400–700 nm) przez chromofory. ○​ Przykłady chromoforów: wiązania podwójne C=C, grupy karbonylowe (-C=O), układy sprzężone (np. pierścień benzenowy). ○​ Używana do analizy barwników, białek, leków, polimerów i innych związków organicznych. 2.​ Spektroskopii fluorescencyjnej ○​ Chromofory mogą działać jako fluorofory – pochłaniają światło, a następnie emitują je na innej długości fali. ○​ Stosowana w biologii i chemii analitycznej do oznaczania białek, DNA oraz substancji fluorescencyjnych. 19.​Przesunięcia batochromowe i hipsochromowe. Kinga Szewczyk Są to terminy używane w spektroskopii UV-Vis i fluorescencyjnej do opisywania zmian w długości fali absorpcji lub emisji światła przez związki chemiczne. Przesunięcie batochromowe – przesunięcie pasma absorpcyjnego w kierunku fal dłuższych („red shift”, przesunięcie w stronę czerwieni widma, obniżenie energii przejścia elektronowego, powoduje efekt batochromowy)​ (Wzrost liczby pierścieni w szeregu związków aromatycznych powoduje przesunięcie batochromowe wszystkich pasm absorpcyjnych, aż do zakresu widzialnego.) Przesunięcie hipsochromowe – przesunięcie pasma absorpcyjnego w kierunku fal krótszych („blue shift”, w stronę niebieską widma, zwiększenie energii przejścia elektronowego, powoduje efekt hipsochromowy) Przyczyny przesunięć w widmach UV-Vis ​ Zmiany w strukturze elektronowej cząsteczki -​ Dodanie grup auxochromowych (np. -OH, -NH₂) często powoduje przesunięcie batochromowe. -​ Dodanie grup chromoforowych (np. -C=O, -NO₂) może wpłynąć na przesunięcie absorpcji. ​ Zmiana polarności rozpuszczalnika -​ Rozpuszczalniki polarne mogą stabilizować stany wzbudzone cząsteczek, co często prowadzi do przesunięcia batochromowego. -​ W niektórych przypadkach efekt jest odwrotny – np. przesunięcie hipsochromowe w przypadku niektórych fluoroforów w rozpuszczalnikach polarnych. ​ Efekty pH  -​ Wpływają na jonizację grup funkcyjnych, co może zmieniać ich zdolność do sprzężenia π i prowadzić do przesunięć batochromowych lub hipsochromowych. -​ Na przykład fenole i aminy aromatyczne mogą wykazywać przesunięcie batochromowe w środowisku zasadowym. Efekt hiperchromowy – podwyższenie natężenia pasma absorpcji (zwiększenie intensywności absorpcji)​ Efekt hipochromowy - obniżenie natężenia pasma absorpcji (zmniejszenie intensywności absorpcji) 20.​V Metoda SPR – powierzchniowy rezonans plazmonowy (Surface Plasmon Resonance – SPR) Lucas W Definicja: SPR (Surface Plasmon Resonance) to technika analityczna służąca do badania interakcji między cząstkami na powierzchni cienkowarstwowej. Zasada działania: Mierzy zmiany w kącie rezonansu plazmonowego przy odbiciu światła od powierzchni, na której adsorbowane są cząsteczki (np. białka). Pomiar: W trakcie interakcji (np. liganda z receptorem) zmienia się refrakcja światła, co jest wykrywane przez czujnik SPR. Bez znakowania: SPR pozwala na analizowanie interakcji bez potrzeby stosowania dodatkowych znaczników. Zastosowania: Używana w biotechnologii, farmacji, diagnostyce medycznej oraz w badaniach naukowych, w tym do analizy kinetyki interakcji molekularnych. Zalety: Pomiar w czasie rzeczywistym. Wysoka czułość. Niska ilość próbki wymagana do analizy. ​ Na szkiełku pokrytym cienką warstwą złota umieszczamy jedną z cząsteczek. ​ Świecimy na złoto laserem pod różnym kątem. ​ Jeśli druga cząsteczka przyłączy się do pierwszej, zmienia się sposób odbicia światła. ​ Mierzymy te zmiany i widzimy, jak szybko i jak mocno cząsteczki się łączą. VI Dichroizm kołowy (CD) 21.​Czym jest dichroizm kołowy? Jakie związki wykazują dichroizm kołowy (CD) Oliwia Goldsztejn Dichronizm kołowy to metoda spektroskopii absorpcyjnej, polega na różnej absorpcji przez światło spolaryzowane prawo i lewoskrętnie.Mierząc tę różnicę pochłaniania (dichroizm), można dowiedzieć się o strukturze cząsteczki. Skutkiem jest zmiana polaryzacji światła liniowego na eliptyczne! Dichrozm wykazują substancje optycznie czynne=chiralne. Może występować nw podczerwieni, nadfiolecie i obszarze widmowym widzialnym. VII Metody rentgenograficzne. 22.​Rentgenografia strukturalna. Norbert Tłusty To technika analityczna stosowana w krystalografii (ustalanie wymiarów i geometrii komórki elementarnej tworzącej daną sieć) i chemii (ustalenie struktury związku tworzącego kryształy). Metoda opiera się na rejestrowaniu obrazów dyfrakcji (ugięcia fali) promieniowania rentgenowskiego. Dyfrakcja powstaje na skutek interakcji promieni z chmurami elektronowymi atomów tworzących kryształ. Strukturę 3D wyznacza się na podstawie rejestracji obrazów pod różnymi kątami przechodzenia promieni X przez kryształ. Dalsza analiza matematyczna umożliwia: wyznaczenie pozycji i odległości cząsteczek względem siebie w sieci krystalicznej, wyznaczenie położenia poszczególnych atomów względem siebie, ustalenie kątów i długości wiązań między atomami, ustalenie rozkładu gęstości chmur elektronowych wokół poszczególnych atomów, co umożliwia obliczenie momentu dipolowego wiązań i całych cząsteczek oraz precyzyjne ustalenie natury poszczególnych wiązań, ustalenie konfiguracji absolutnej cząsteczek Promieniowanie X to fale o długości od 1*10^-3 nm do 100 nm. Cechuje się dużą przenikliwością. Do wykonania analizy potrzebny jest monokryształ danego związku chemicznego o możliwie jak najbardziej regularnym kształcie i posiadający jak najmniej defektów. Kryształ ten umieszcza się w dyfraktometrze i niekiedy schładza przy pomocy oparów ciekłego azotu, aby zmniejszyć niedokładności wynikające z termicznych drgań atomów. Kryształ naświetla się silną, monochromatyczną wiązką promieni X, zmieniając stopniowo kąt jej padania na kryształ (poprzez jego obrót) i rejestrując zmiany w obrazie dyfrakcyjnym po przejściu promieni przez kryształ. Zalety rentgenografii: próbka nie ulega zniszczeniu po badaniu bardzo wysoka dokładność w ustalaniu struktury chemicznej związków chemicznych żadna inna metoda analityczna nie pozwala jednoznacznie określić bezwzględnej konfiguracji cząsteczek chiralnych Wady rentgenografii: konieczność uzyskania monokryształu analizowanego związku niektóre kryształy mogą ulegać rozkładowi pod wpływem promieni X wysokie koszty i czasochłonność Do najbardziej znanych tego rodzaju baz zalicza się: Protein Databank PDB (makrocząsteczki), Cambridge Structure Database (związki organiczne i metaloorganiczne), oraz otwarta Crystallography Open Database (związki organiczne, nieorganiczne, metaloorganiczne i minerały, z wyłączeniem biopolimerów). Metody CHROMATOGRAFICZNE. 23.​Analiza chromatograficzna: technika TLC, chromatografia cieczowa: LC, HPLC, jonowymienna. Ola Krawczyk Chromatografia - technika rozdzielania lub badania składników mieszaniny, poprzez przepuszczenie roztworu mieszaniny przez przygotowaną fazę rozdzielczą/stacjonarną. Chromatografia TLC (cienkowarstwowa chromatografia cieczowa) - fazę stacjonarną stanowi płytka aluminiowa/szklana/z tworzywa sztucznego pokryta odpowiednim absorbentem, czyli substancją o bardzo dużej powierzchni, na której  zachodzą wiązania różnych substancji z mieszaniny, rozdzielane substancje nanosi się punktowo na płytkę, a następnie zanurza w eluencie. Zależnie od swoich właściwości fizykochemicznych składniki mieszaniny docierają w tym samym czasie na różną wysokość płytki, możliwe jest to dzięki zjawisku kapilarnemu. Gdy eluent dotrze do końca płytki można zaobserwować rozdział substancji, a gdy nie są one barwne, ich obecność przykładowo można stwierdzić używając światła UV, roztworów wywołujących lub innymi metodami. Parametrem, który określa położenie substancji jest współczynnik opóźnienia Rf lub RF który jest stosunkiem drogi migracji substancji (a) od drogi przebytej przez fazę ruchomą (b). RF = a/b LC (Liquid Chromatography) – chromatografia cieczowa​ Podstawowa metoda chromatografii cieczowej, w której próbka jest rozpuszczana w cieczy i przepuszczana przez kolumnę.​ Rozdział składników następuje w zależności od ich powinowactwa do fazy stacjonarnej i ruchomej.​ Może działać w trybie: ​ Podziałowym (normalna i odwrócona faza) ​ Jonowymiennym ​ Żelowym (sita molekularne HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) – wysokosprawna chromatografia cieczowa​ Udoskonalona wersja LC – stosuje wysokie ciśnienie, aby szybciej i dokładniej rozdzielać składniki.​ Lepsza rozdzielczość i większa czułość niż klasyczna LC.​ Kolumny mają mniejsze cząstki fazy stacjonarnej, co zwiększa efektywność separacji.​ Typy HPLC: ​ RP-HPLC (odwrotna faza) – najczęściej stosowana (np. do leków, białek). ​ NP-HPLC (normalna faza) – do związków polarnych. Chromatografia jonowymienna (IC – Ion Exchange Chromatography) Służy do rozdzielania jonów i związków naładowanych (np. aminokwasy, peptydy, białka).​ Kolumna zawiera jonowymienne żywice, które mają ładunek: ​ Kationowymienna – zatrzymuje kationy (np. Na⁺, K⁺, Ca²⁺). 🔹 ​ Anionowymienna – zatrzymuje aniony (np. Cl⁻, NO₃⁻).​ Jony w próbce wymieniają się z jonami na żywicy, co powoduje ich selektywne zatrzymanie i elucję.