Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência PDF

Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos Experimentais = modelos animais + modelos alternativos Experimentação Animal - Qq procedimento que envolva animais, vertebrados ou invertebrados - modelos animais (a maioria da legislação que regula a proteção dos animais de experimentação...

Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos Experimentais = modelos animais + modelos alternativos Experimentação Animal - Qq procedimento que envolva animais, vertebrados ou invertebrados - modelos animais (a maioria da legislação que regula a proteção dos animais de experimentação restringe-se a vertebrados. Modelos animais não são usados exclusivamente para benefício do homem, p.e. testagem de um medicamento para outro animal). Aplicações da experimentação animal: Ciências agronómicas Biologia Campo das ciências médicas Veterinária Pesquisa médica e testes de segurança - Animal como modelo para o homem. Os modelos são muitas vezes parciais - não são iguais a quem se destina o fármaco/tratamento. Ainda não é possível replicar nenhum dos sistemas humanos por completo em modelos experimentais nem replicar a interação entre sistemas, e essa é uma das principais limitações destes modelos, pois não é possível estudar de que maneira o organismo reage como um todo àquilo que estamos a estudar. Espécies mais usadas em experimentação Os procedimentos mais agressivos em animais foram abolidos e foram introduzidos novos procedimentos menos invasivos. No entanto, o nº de animais utilizados por experiência não se alterou muito (provavelmente usam-se os mm animais para testar várias coisas, reduction). Questões éticas como “Qual o nosso direito de sacrificar/experimentar e causar sofrimento a outras espécies em prol dos humanos?” levaram à necessidade da criação de regras que controlassem a experimentação animal. Chegou-se assim a um compromisso, com algumas medidas para diminuir o sofrimento animal: Regra dos 3 Rs (Russel & Burch, anos 50) - Linhas gerais para um uso responsável dos animais de experimentação. Replacement Reduction (usar o mínimo possível para obter resultados estatisticamente significativos) Refinement (bem-estar animal) Nota: O 4º R - Reprodutibilidade Página 1 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Replacement - Utilização de modelos alternativos. Evitar ou substituir o uso de animais em áreas onde de outra forma seriam utilizados. Pode não haver substituição para os animais! Depende da experiência q queremos realizar e da nossa pergunta. Recolha de informação Evitar duplicar trabalhos Validar alternativas com dados “in vivo” pré-existentes Consulta “online” de bases de dados e literatura Utilização de sistemas computacionais Estudos em humanos – ter a certeza que é necessário utilizar outros animais na experimentação para além do humano … Dividimos a substituição em 2 categorias principais: 1. Substituição total - métodos que substituem a utilização de animais para fins de investigação e testes. Inclui a utilização de voluntários humanos, tecidos e células, modelos matemáticos e informáticos e linhas celulares estabelecidas (muitas vezes referidas como tecnologias/métodos não animais). 2. Substituição parcial - inclui a utilização de alguns animais que, com base no pensamento científico atual, não são considerados capazes de sofrer sofrimento. Isso inclui invertebrados como Drosophila, vermes nematóides e amebas, além de formas imaturas de vertebrados. Tb inclui a utilização de células (e tecidos) primários retirados de animais mortos exclusivamente para este fim (ie, que não tenham sido utilizados num procedimento científico que cause sofrimento). Reduction - Refere-se ao decréscimo do nº de animais necessários para uma dada experiência. Bom planeamento da experiência - estudar a variância: reduzir o nº de animais, mas ter o suficiente para obter resultados significativos (senão estamos a “desperdiçar” animais na mm, pq se forem muito poucos para obter resultados, tem-se de repetir a experiência com novos animais). Escolha de procedimentos experimentais apropriados o Definir com clareza a HIPÓTESE o Escolher o MODELO adequadamente o Definir estatística - Prever variância o Programar controlos efetivos - animais controlo Controlo dos fatores ambientais Estandardização da população animal Inclusão de estudos piloto “in vitro” Partilha de resultados entre laboratórios Página 2 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Refinement - Refere-se ao decréscimo da incidência ou do grau de severidade de dor ou stress nos procedimentos aplicados aos animais. o Os animais experimentais são muitas vezes eutanasiados no final da experiência, para serem posteriormente estudados. Isto deve ser feito da forma mais “humana” e indolor possível. o Se o animal tiver de passar por algum procedimento que lhe cause stress, é importante habituar o animal ao processo 1º, para que na experiência ele não esteja stressado qd for submetido a esse procedimento. Se não o habituarmos 1º, os resultados que vamos obter vão estar altamente alterados pela resposta fisiológica do animal ao stress. (p.e. colocar o animal numa gaiola de contenção). Ao diminuir significativamente os níveis de stress em que os animais vivem durante a experiência, melhoramos significativamente os resultados. o Podem ou não se fazer grupos aleatórios ao dividir-se os animais. A construção de grupos é um parâmetro que pode afetar os resultados. o Ajustar o ambiente às necessidades comportamentais e fisiológicas dos animais → Enriquecimento ambiental (os ratos gostam de sítios para brincar, se esconder, exercitar, comida fresca e serradura. Isto é tudo refinement - Ajuste do ambiente às necessidades e gostos dos animais). → Pessoal treinado o Considerar anestesia e analgesia (teste da cauda – tail flick test) o Ponderar a necessidade de utilizar dispositivos de recolha permanentes (ex. cateteres) o Recurso a métodos de eutanásia → Desvios à homeostasia levam a comportamento anormal e doença → O refinement não contribui só para o bem-estar animal, mas tb para a qualidade da experiência. End-Points "O ponto em que a dor e/ou o sofrimento de um animal experimental é terminado, minimizado ou reduzido, através de ações como sacrificar o animal de forma humanitária, terminar um procedimento doloroso, ou administrar um tratamento para aliviar a dor e/ou o sofrimento". "Os limites estabelecidos para a quantidade de dor e sofrimento que qq animal de laboratório será permitido experimentar no contexto dos objetivos científicos a serem alcançados". Se necessário, realizar um estudo piloto para definir os end-points. A informação que diz respeito ao grau de sofrimento infligido aos animais deverá ser adquirida, tanto qt possível, antes do decurso da experiência, definindo-se os endpoints, sendo o animal subsequentemente eutanaziado. Página 3 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Indicadores de dor Temos de “medir” a dor dos animais recorrendo a parâmetros fisiológicos (ex. temperatura, peso…). O experimentador tem de definir o grau máximo de sofrimento que está disposto a infligir ao animal. Muitas vezes, é necessário provocar a doença no animal, e tem de se ter cuidado para não se efetuar uma administração errada. Existem vários tipos de administração, deve-se usar o mais adequado ao animal e à experiência (oral, intra- peritoniana, intra-venosa…). Se o animal chegar ao end-point (estiver num determinado grau de dor/sofrimento considerado máximo pelo experimentador), deve ser eutanasiado, sob todas as condições necessárias, mm que isso diminua a nossa população estudo. Stress response: refere-se às reações fisiológicas e comportamentais que um organismo exibe qd enfrenta uma situação desafiadora, ameaçadora ou perturbadora. Distress (Angústia ou sofrimento): refere-se a um estado em que o stress se torna prejudicial para o bem-estar do animal. Página 4 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Alguns indicadores comportamentais, fisiológicos e bioquímicos de bem-estar Escala de avaliação numérica Tail flick test Teste utilizado em pesquisas que envolvem animais, especialmente em estudos de dor. Este teste é aplicado em roedores, para avaliar a sensibilidade à dor térmica. Expõem-se a extremidade da cauda do animal a um estímulo térmico, o que vai causar uma resposta natural de retirar ou balançar a cauda para escapar do estímulo doloroso. O tempo que leva para o animal reagir ao calor fornece uma indicação da sua sensibilidade à dor térmica. Este teste é frequentemente utilizado em pesquisas farmacológicas para avaliar o efeito de analgésicos ou outros medicamentos que visam aliviar a dor. Página 5 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Alguns modelos animais em patologias Os organismos modelo são definidos como "Um substituto cognitivo: em vez de investigar o fenómeno diretamente, estuda-se uma alternativa mais fácil de manipular." São escolhidos para investigação devido a: - Facilidade de obtenção e reprodução; - Facilidade de manutenção em laboratório; - Tempo de geração curto e desenvolvimento rápido; - Boa resposta a técnicas e manipulações experimentais. Culturas Celulares Consiste na remoção de células de um animal ou planta, e a sua subsequente manutenção num ambiente artificial favorável. As células podem ser removidas diretamente (citologia) ou após a desagregação enzimática e/ou mecânica do tecido, podendo ainda ser derivadas de uma linha celular já estabelecida. Culturas primárias São culturas estabelecidas a partir de células isoladas de tecidos. Estas podem proliferar sob condições apropriadas, até ocuparem a superfície no suporte de cultivo (atingir-se a confluência). Qd atingem a confluência, as células têm de ser passadas, retirando-as do recipiente em que estão, e transferindo-as, em menor nº, para um novo recipiente, com meio de cultura fresco, onde têm espaço para ir continuando a replicar-se. Página 6 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Linhas celulares Após a 1ª passagem, as culturas primárias tornam-se linhas celulares (subclones). As células derivadas das culturas primárias têm um nº de passagens limitado (culturas finitas) e, há medida que são passadas, as células com maior capacidade replicativa passam a predominar, resultando numa população com genótipo e fenótipo mais uniforme. Linhas celulares finitas vs contínuas Células normais têm um determinado nº de passagens possíveis, após as quais as células entram em senescência (mecanismo geneticamente determinado de morte celular) - podem constituir linhas finitas; Algumas linhas são imortalizadas (linhas transformadas), o que pode ocorrer de forma espontânea (tumores) ou induzida (transfetadas). Qd uma linha adquire a capacidade de se dividir indefinidamente, torna-se uma linha contínua. Condições de cultura para células animais Estas condições são variáveis para os diferentes tipos celulares, e podem ser identificados vários fatores que devem ser tidos em conta: ✓ Recipiente estéril apropriado; ✓ Meio de cultura com os nutrientes necessários à alimentação das células, sistema tampão e osmolaridade controlada (glúcidos, aminoácidos, vitaminas, minerais); ✓ Fatores de crescimento e hormonas (disponibilizados ao meio pela adição de soro animal e/ou adicionados ao meio separadamente); ✓ Gases (O2, CO2) - A utilização do sistema tampão bicarbonato implica que os meios estejam em contacto com 5% de CO2 na atmosfera envolvente das culturas; ✓ Regulação do ambiente físico-químico (pressão osmóticas, pH, temperatura); ✓ Dependendo do tipo celular, a manutenção e multiplicação destas deverá ocorrer num suporte sólido ou semi-sólido (culturas aderentes) ou em suspensão num meio líquido permanentemente agitado (culturas em suspensão). Aplicações das culturas de células animais Constituem excelentes modelos para: ✓ Estudar a fisiologia e bioquímica celular (estudos metabólicos, de envelhecimento); ✓ Avaliar o efeito de compostos tóxicos nas células (avaliações de risco toxicológico); ✓ Estudos de mutagénese e carcinogénese; ✓ Realizar o screening de fármacos; ✓ Desenvolver e produzir em larga escala de compostos de origem biológica (vacinas, hormonas, etc…), com grande consistência e reprodutibilidade. Página 7 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Prós da utilização de células de cultura 1. O ambiente físico-químico pode ser controlado (pH, temperatura, pressão de gases, osmolaridade,…); 2. As condições fisiológicas podem ser reguladas (concentração dos nutrientes, interações célula-célula, controlo hormonal, …) 3. Após 1 ou 2 passagens, as células em cultura tornam-se homogéneas, reduzindo a variabilidade na resposta biológica do sistema. As células diferenciadas recolhidas de amostras de tecido, mm que em cultura primária, são heterogéneas; 4. As células em cultura podem ser caracterizadas por estudos citológicos e imunológicos; 5. As células em cultura podem ser armazenadas em azoto líquido durante anos; 6.As condições de cultura celular permitem um contacto direto com as células, adequados a estudos bioquímicos. 7. A exposição das células em cultura a xenobióticos permitem usar menor quantidade de reagentes, qd comparadas com a exposição in vivo, pq não há perdas em distribuição e/ou excreção. Contras da utilização de células de cultura 1. Exigem conhecimento e aplicação de técnica asséptica e de técnica de cultura celular; 2. O custo é um fator limitante. É necessário equipamento específico (câmara de fluxo laminar, incubadora de CO2, microscópio invertido) e consumíveis como CO2, álcool, materiais estéreis, meios de cultura e fatores de crescimento; 3. Está estimado que o custo de produção de células é cerca de 10x superior ao uso de tecidos animais; 4. Controlo dos fatores ambientais e rotinas muito eficientes no laboratório (pH, temperatura, gases dissolvidos, esterilização de materiais, descarte de materiais contaminados, …); 5. As células nativas existem numa geometria tridimensional (3D), enquanto nos sistemas de cultura celular a propagação das células ocorre num substrato bidimensional (2D); 6. As linhas celulares podem ser representativas de 1 ou 2 tipos de células no tecido nativo, enquanto outros tipos celulares não estão representados – constitui assim um modelo, não um sistema equivalente ao nativo; 7. Muitas vezes nas células em cultura ocorre diferenciação celular, havendo perda de algumas características nativas que desempenhavam nos tecidos donde foram isoladas; isto deve-se à adaptação e processos de seleção que ocorram durante a cultura; 8. Pode-se instalar instabilidade genética nas linhas contínuas, o que gera heterogeneidade na linha e fenótipos diferentes do inicial, havendo um limite finito de passagens possíveis de realizar; 9. A componente homeostática da regulação in vivo (exercida pelo sistema nervoso, sistema endócrino, regulação metabólica inter-órgãos, …) perde-se. São adicionadas hormonas e fatores de crescimento, essenciais à sobrevivência celular, mas a regulação é artificial; 10. As linhas tumorais são muito úteis pois permitem um elevado nº de passagens, mas as células podem ter alterações relevantes relativamente às não tumorais, podendo perder- Página 8 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência se algumas características regulatórias – há que comprovar se são um modelo adequado para o fim a que se destinam! Células Culturais Primárias Fornecem dados biologicamente + relevantes do que os criados usando linhas celulares imortalizadas. As preocupações com a utilização de linhas celulares resultaram numa necessidade crescente de células primárias numa variedade de aplicações, desde a investigação básica até à descoberta de medicamentos. Frequentemente, as células primárias são combinadas com tecnologias mais recentes, como a cultura de células 3D. São células isoladas diretamente de tecido humano ou animal usando métodos enzimáticos ou mecânicos. Uma vez isoladas, são colocadas em ambiente artificial em recipientes de plástico ou vidro sustentados por meio especializado contendo nutrientes essenciais e fatores de crescimento para apoiar a proliferação. Podem ser de 2 tipos – aderentes ou em suspensão. As células aderentes requerem fixação para crescer e são consideradas células dependentes de ancoragem. São geralmente derivadas de tecidos de órgãos. As células em suspensão não requerem fixação para crescer e são consideradas células independentes de ancoragem. A sua maioria é isolada do sistema sanguíneo. Algumas células em suspensão derivadas de tecidos estão disponíveis, como hepatócitos ou células intestinais, que são adequadas para aplicações ADMET. Embora as células primárias geralmente tenham uma vida útil limitada, elas oferecem um grande nº de vantagens em comparação com as linhas celulares. Ao realizar a cultura celular primária, os investigadores têm a oportunidade de estudar os doadores e não apenas células. Página 9 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Vários fatores como idade, histórico médico, raça e género podem ser considerados na construção de um modelo experimental. Tal variabilidade e complexidade dos tecidos dos doadores só podem ser alcançadas com a utilização de células primárias, e são difíceis de replicar com linhas celulares, que são muito sistemáticas e uniformes na natureza e não capturam a verdadeira diversidade de um tecido vivo. Isolamento de ilhéus de langerhans - Procedeu-se ao isolamento dos ilhéus com base no método optimizado por Antunes, que tem por base o enchimento do pâncreas com uma solução enzimática que permite a digestão do tecido exócrino a partir do interior do pâncreas. A mistura enzimática, designada comercialmente como liberase RI, consiste num conjunto de enzimas digestivas, nomeadamente colagenase e tripsina, que permitem, qd determinadas as condições ótimas da reação, a degradação do tecido exócrino, mantendo intacto o tecido endócrino, que pode então ser isolado. - Após o sacrifício por deslocamento cervical, o animal foi pesado e lavado com água da torneira de modo a minimizar a contaminação do pâncreas com pelos, sendo seguidamente colocado sobre uma placa coberta com papel absorvente, em posição dorsal, de forma a deixar o ventre exposto. Todas as operações conducentes à extração do pâncreas foram executadas num curto período de tempo (10-15 min), de forma a evitar que as células entrassem em hipóxia. Durante todo o processo de isolamento, o abdómen do animal foi sendo humedecido regularmente com solução de isolamento, utilizando uma mistura de gelo e água, a fim de evitar a sua desidratação, permitindo o arrefecimento dos órgãos e mantendo a liberase inativa durante a injeção da solução no pâncreas. - A solução de liberase foi então injetada, lentamente, devendo esta operação dar-se por concluída logo que o pâncreas se encontre totalmente distendido, mm que não se tenha injetado todo o conteúdo da seringa. Procedeu-se então à dissecação do pâncreas separando-o dos órgãos vizinhos (estômago, intestino e baço) e limpando-o do tecido adiposo envolvente. Após a dissecação, o pâncreas foi lavado com a solução de isolamento, sendo colocado num tubo de Falcon, que se submergiu num banho termostatizado a 37ºC. A reação enzimática é assim termicamente favorecida. O tubo foi agitado suavemente na posição horizontal de forma a evitar a fragmentação mecânica do pâncreas. A digestão teve uma duração de 8-12 segundos, utilizando o critério visual para decidir qual o momento adequado para parar a reação. Este foi identificado pela presença de pequenos fragmentos que se desprendem do pâncreas e pela turbidez da solução que começou a aparecer fora do pâncreas devido à desintegração das membranas. Neste momento, retirou-se imediatamente o tubo do banho, colocou-se em gelo e encheu-se com solução de isolamento suplementada com BSA e arrefecida, tendo como objetivo baixar a temperatura do meio de reação e neutralizar, por diluição, o excesso de liberase, de forma a suprimir a atividade enzimática, para a qual contribui tb a ação inibitória do BSA sobre a atividade enzimática e evitar a digestão da cápsula de colagénio dos ilhéus, garantindo a integridade destes. … Página 10 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos em Cancro o É estimado que em 2040, o nº de novos pacientes diagnosticados com cancro atinga cerca 28.4 M por ano, um aumento de 47% qd comparado com 2020. o Novas estratégias terapêuticas como imunoterapia e terapias dirigidas têm melhorado significativamente as taxas de sobrevivência qd comparadas com terapias tradicionais; no entanto, coloca-se o problema de desenvolvimento de resistência às terapias. o Assim, é requerida investigação profunda dos mecanismos de ocorrência e desenvolvimento do cancro, e melhoria das estratégias de diagnóstico e tratamento. o Os modelos tumorais em animais são valiosos para análises experimentais devido às suas semelhanças com os tumores humanos. o Pode-se observar a ocorrência e desenvolvimento de tumores em animais, e estudar o efeito de genes no desenvolvimento de tumores, por exemplo com o knocking out ou knocking in de certos genes, fazer screening de fármacos e ensaios pré-clínicos. Modelos animais em Cancro - ratinho Cerca de 90% dos estudos feitos em cancro utilizam ratos como modelo experimental. As descobertas em ratos fornecem dados fundamentais que guiam ensaios clínicos, permitindo avaliar a segurança e eficácia de novas terapias. Comparado com outros modelos, os mamíferos têm um elevado grau de similaridade com os humanos, particularmente ratinhos e ratazanas, e o ciclo reprodutivo curto aumenta a eficiência das experiências. Cerca de 85% dos genes humanos têm ortólogos em ratos, com funções comparáveis entre as duas espécies. Baseado nas causas da formação de tumores, os modelos animais podem ser divididos em 4 categorias: 1. Espontâneo 2. Induzido Modelos de tumores primários 3. Transgénico 4. Transplantes Os modelos transplantáveis incluem transplantação alogénica – as células precursoras provêm de outro indivíduo da mm espécie – e transplantação xenogénica – as células provêm de humanos. Transplantação singénica envolve tecidos/células de indivíduos com o mm background genético. 1. Modelos espontâneos – envolvem animais que desenvolvem tumores naturalmente, frequentemente devido a mutações genéticas herdadas ou processos relacionados com o envelhecimento. Estes modelos podem replicar melhor o desenvolvimento de cancro em humanos, onde os tumores frequentemente surgem sem uma indução externa. Página 11 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Tipos de modelos espontâneos: Linhas endogâmicas – certas linhas de ratinhos desenvolvem naturalmente certos tipos de cancro devido a pré-disposição genética. Modelos transgénicos – alguns ratos geneticamente modificados são mais predispostos a desenvolver tumores espontaneamente. Um exemplo é o modelo TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma of Mouse Prostate) de cancro da próstata. Modelos de envelhecimento – animais mais velhos, de certas linhas em particular, podem desenvolver cancro com o aumento da idade. Vantagens deste modelo: Desenvolvimento e progressão natural dos tumores. Melhor compreensão da resposta imunitária – visto que os modelos envolvem ratos imunocompetentes. Úteis para estudar a evolução do tumor e metástases – visto que os tumores ocorrem no seu “ambiente” natural. 2. Modelos induzidos – envolve a introdução artificial de fatores causadores de tumores. O objetivo é criar um ambiente controlado onde o cancro se pode desenvolver de uma maneira previsível. Tipos de modelos induzidos: Modelos quimicamente induzidos – o cancro é induzido por exposição a carcinogénicos. Esta abordagem leva a mutações e alterações semelhantes às observadas em tumores humanos. É utilizada para estudar cancros em órgãos como fígado, pulmões e pele. Modelos geneticamente modificados – genes específicos podem ser modificados para induzir cancro. Os ratinhos podem ser modificados para ter mutações em oncogenes (ex. Myc, Ras) ou supressores de tumores (ex. p53, BRCA1). Vantagens deste modelo: Imita os tumores humanos com bastante fidelidade. Desenvolvimento rápido e consistente do tumor – maior rapidez em estudar os efeitos de tratamentos experimentais. Permitem um grande controlo sobre o timing, localização e tipo de tumor que se desenvolve. Flexibilidade em estudar diferentes tipos de cancros – diferentes modos de indução (química, viral, genética) em órgãos ou tecidos específicos. Progressão controlada – permite estudar estádios específicos. Métodos reproduzíveis e estandardizados – útil para testes de fármacos e estudos pré- clínicos. Modelos mais económicos e permitem escalabilidade – úteis em testes de fármacos em grande escala. Página 12 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência 3. Modelos transgénicos – São criados com a introdução de DNA exógeno no genoma, permitindo estudar o efeito de genes específicos na doença. Tipos de modelos transgénicos: Gene Knock-in – envolve a inserção de um gene ou um gene modificado no genoma do rato. Permitem investigar os efeitos da sobre-expressão, mutações, ou genes humanizados (ex. modelos para cancro da mama e ovário, onde a versão humana do gene BRCA1 ou BRCA2 é inserida). Gene Knockout – um gene específico é inativado para estudar o efeito de perda de função. Por exemplo knockout de p53 (inativar a proteína supressora de tumor) para estudar progressão de tumores. Linhas Reporter – um gene marcador fluorescente ou luminescente (ex. GFP ou luciferase) é inserido juntamente com o gene de interesse. Estes modelos ajudam a visualizar os padrões de expressão ou respostas celulares a estímulos. 4.1. Modelos de Transplantação singénicos - Envolvem a transplantação de células cancerígenas de outro animal com o mm background genético (linhas endogâmicas). Isto permite ao sistema imunitário do animal recetor reconhecer as células cancerígenas como suas, permitindo estudar o desenvolvimento do tumor e a resposta de um sistema imunitário completamente imunocompetente ao tumor. Características do modelo: Compatibilidade genética – como ambos dador e recetor têm o mm background genético, não existe rejeição do tumor. Ambiente imunocompetente - é particularmente útil para estudar a interação do sistema imunitário com o tumor, visto que o sistema imunitário funciona naturalmente sem a necessidade de imunossupressão. Tipos de modelos de tumor singénico: Modelos subcutâneos – as células cancerígenas são injetadas subcutaneamente para criar tumores facilmente rastreáveis. É comum para fazer o screening de fármacos anti-tumorais e observar o crescimento do tumor. Modelos ortotópicos – células tumorais são injetadas no órgão ou tecido de origem do tumor, para mimetizar o ambiente natural do tumor. Útil para estudar como os tumores crescem no seu ambiente nativo e metastizam. Modelos metastáticos – permitem estudar como células cancerígenas se espalham do tumor primário para outros locais do corpo. As células são injetadas em locais onde possam circular e formar metástases. Página 13 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Aplicações deste modelo: Imunoterapia – úteis para testar inibidores imunitários, células CAR-T (chimeric antigen receptor T cells, que se ligam a células cancerígenas específicas) e outras imunoterapias, pq o sistema imunitário mantém-se intacto. Estudos de microambientes tumorais – ajudam a entender como o microambiente do tumor interage com várias células imunitárias, citoquinas e outras moléculas sinalizadoras, crucial para desenvolver terapias dirigidas. Screening de fármacos. Limitações: Diferenças entre espécies – a resposta do tumor ao tratamento em ratinhos pode não indicar necessariamente a mm resposta em tumores humanos. Falta de diversidade genética – a utilização de linhas endogâmicas pode limitar a previsão de como a diversidade genética possa impactar a progressão do tumor e a resposta aos tratamentos. Diferenças imunitárias – embora os modelos singénicos sejam imunocompetentes, o sistema imunitário dos ratos não é idêntico ao humano, e pode não refletir completamente a resposta em humanos. Tipos comuns de modelos singénicos: Modelo de melanoma B16-F10 (estirpe de rato C57BL/6) – as células B16-F10 são agressivas e podem formar metástases, tornando-as adequadas para estudar o melanoma e tratamentos de imunoterapia. Modelo de cancro da mama 4T1 (estirpe de rato BALB/c) – estas células mimetizam de forma bastante próxima o cancro da mama humano no estádio. Modelo de cancro colorectal CT26 (estirpe de rato BALB/c) – válido para estudar a imunologia do tumor, pq as células CT26 são moderadamente imunogénicas e respondem a várias imunoterapias. 4.2. Modelos de Transplantação Xenogénicos (xenoenxortos) - Envolvem a transplantação de células ou tecidos cancerígenos de humanos para ratinhos imunodeficientes para estudar o desenvolvimento do tumor e possíveis terapias. Reproduzem a complexidade da doença em humanos. Tipos de ratinhos utilizados em modelos xenogénicos: Ratos nude – não têm timo (glândula linfoide primária onde os linfócitos T amadurecem), logo a resposta imunológica fica muito reduzida. Não aplicável a todos os tipos de cancro. SCID Mice (Severe Combined Immunodeficient) – não produzem linfócitos T nem B, levando a uma supressão mais completa da resposta imune. NSG Mice (NOD SCID Gamma) – além de não produzirem linfócitos T nem B, não produzem células NK. Apresentam maiores taxas de crescimento de tumor, tornando- os particularmente vantajosos. Página 14 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Utilização de modelos xenogénicos: Testar eficácia de fármacos – resposta do tumor, efeitos secundários, dosagem … Estudo da biologia e crescimento do tumor. Estudo dos mecanismos de resistência do tumor a quimioterapia e terapias dirigidas. Descoberta de biomarcadores que preveem a resposta do tumor às terapias, e que sinalizam estádios precoces de cancro, facilitando a deteção precoce e tratamento. Investigação em imunoterapia. Investigação em microambiente tumoral – vasos sanguíneos, células imunitárias, …, desempenham um papel significativo na progressão dos tumores e resposta às terapias. Exemplos de modelos xenogénicos: Patient-Derived Xenograft (PDX) Models – tecido tumoral é diretamente transplantado para ratos imunodeficientes. O tumor cresce e retém as características histológicas e genéticas do tumor do paciente. Cell Line-Derived Xenograft (CDX) Models – linhas celulares tumorais são injetadas em ratos imunodeficientes. Úteis para screening de fármacos. Humanized Immune System (HIS) Models – ratinhos injetados com células hematopoiéticas estaminais ou células mononucleares do sangue periférico para reconstruir parcialmente o sistema imunitário humano. Úteis para estudar interações imuno-oncológicas e testar imunoterapia. Organoid-Derived Xenograft Models – organoides derivados de células tumorais humanas são transplantados para ratos. Úteis para estudar a heterogeneidade do tumor e resistência a fármacos. Modelos animais em cancro – peixe-zebra Peixe-zebra (Danio rerio): pequeno peixe tropical de água doce, nativo do Sudeste Asiático. Porque é utilizado o peixe-zebra na investigação médica? o Semelhanças genéticas com humanos e fácil manipulação genética; o Pequenos, robustos, vida curta, reproduzem-se facilmente; o Embriões transparentes e permeáveis a fármacos - possibilita observar o desenvolvimento sem perturbar o embrião; o Capacidade de regenerar completamente partes do corpo depois de lesões. Página 15 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência O peixe-zebra tem-se revelado um modelo adequado para investigação em áreas como: Envelhecimento; Toxicidade; Screening de fármacos; Cancro; Regeneração de tecidos; … Os roedores têm muitas semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos. Contudo, a maior desvantagem é a dificuldade em estudar a disseminação precoce dos tumores e alterações no microambiente celular dos tumores. A transparência dos embriões e larvas de peixe-zebra permite visualizar o crescimento e dinâmica de tumores em fases precoces. Uma variedade de peixe-zebra que mantém grande parte da transparência durante a fase adulta foi tb desenvolvida – casper. A eficácia e fácil manipulação genética para produção de mutantes e transgénicos torna o peixe-zebra um animal versátil para modelação de doenças. A maior parte dos mecanismos moleculares relacionados com cancro têm os seus homólogos no genoma do peixe-zebra. Existem linhas transgénicas de peixe-zebra que emitem fluorescência em determinados tecidos, que podem dar novos dados sobre o crescimento e disseminação de tumores. Diversas técnicas permitem manipulação genética e introdução de genes no genoma do peixe-zebra. Forward genetics – identificar genes responsáveis por determinado fenótipo: ex. screening de mutagénese (fenótipo → genótipo). Reverse genetics – estudo da função de um gene específico (genótipo → fenótipo). Ex. knockdown de genes específicos e ver efeito no fenótipo. Os métodos mais utilizados para manipulação genética em peixe-zebra incluem: Antisense morpholino oligonucleotides (MOs) – pequenos oligonucleótidos sintéticos que bloqueiam a tradução de mRNA in vivo. CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – Sistema molecular adaptado da proteção de bactérias contra vírus. ❖ Um dos primeiros modelos de cancro em peixe-zebra foi encontrado por screening com etilnitrosourea (ENU), um potente agente mutagénico, onde se encontraram peixes com mutações no gene tumor supressor 53 (tp53M214K). ❖ TP53 é o gene supressor de tumores mais frequentemente mutado encontrado em tumores humanos. ❖ Tumorigénese de peixe-zebra mutante tp53M214K (B, D), com tumor ocular e abdominal. Página 16 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Antisense morpholino oligonucleotides (MOs) MO são injetados no embrião, e ligam-se especificamente ao seu target mRNA ou miRNA, podendo bloquear a tradução ou causar splicing alternativo que produz uma proteína defeituosa. CRISPR/Cas9 Sistema onde um guide RNA reconhece uma sequência específica de DNA por hibridação e guia uma endonuclease (Cas9) que induz uma quebra dupla na cadeia de DNA, o que pode resultar em indels e perda de um alelo funcional; Pode tb fazer-se a introdução de um fragmento de DNA, resultando em adultos mutantes. Página 17 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Peixes-zebras singénicos 1. Embriões haplóides são produzidos por fertilização com esperma irradiado com UV, o que destrói o DNA de modo a não contribuir geneticamente para o embrião, mas mantém a capacidade de ativar os ovos – qq mutação na fêmea será observada na descendência haplóide. 2. Os embriões são convertidos em diploides por aplicação de pressão ou choque térmico durante os 1ários estádios de desenvolvimento (previne a clivagem). 3. Os que sobrevivem são criados até adultos, e ovos provenientes das fêmeas diploides são sujeitos a 2ª ronda de fertilização com esperma inativado e choque térmico. Estes clones são então cruzados entre si, levando a indivíduos geneticamente iguais. Foram criadas 2 linhas de clones de peixe-zebra (CB1eCW1); Diversos tumores 1ários em CB1 foram induzidos com N-nitrosodiethylamine (DEN); Pequenos pedaços de tecidos ou suspensões celulares foram transplantados para a cavidade peritoneal de peixes singénicos em diferentes estádios de desenvolvimento; O aparecimento de tumores visíveis ocorreu de 2 semanas a 3 meses depois do transplante; 19 linhas tumorais foram criadas e mantidas durante várias passagens; Este modelo ofereceu uma nova ferramenta para o estudo da biologia e terapia de tumores. ✓ A implantação de tumores em peixe-zebra (xenografts - xenoenxertos) tem-se tornado um modelo emergente em estudos de cancro. ✓ As células implantadas incluem células derivadas de doentes humanos ou outras espécies (biópsias, excisões), e linhas celulares laboratoriais. ✓ Os xenoenxertos retêm em grande parte a heterogeneidade do tumor do paciente e a sua biologia, o que leva a que sejam bons indicadores da eficácia dos fármacos, baseado em comparações diretas entre a aplicação do fármaco no paciente e em modelos com os xenoenxertos correspondentes. ✓ As células implantadas em peixe-zebra podem derivar de diversos tipos de tumores – leucemia, linfoma, melanoma, sarcoma, neuroblastoma, fígado, cólon, pâncreas, próstata, pulmão, ovário e mama. ✓ O xenoenxerto em peixe-zebra é um método de baixo custo, high-throughput, q pode ser estabelecido rapidamente e q requer uma quantidade mínima de células. Página 18 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Ex: Desenvolvimento de um modelo com linhas celulares de tumor de fígado. ✓ Alterações na acetilcolinesterase (ACHE) têm sido associadas com carcinoma hepatocelular; ✓ Os peixe-zebra mutantes achesb55 têm uma perda de função de ACHE; mutantes homozigóticos são inicialmente móveis, mas ficam paralisados cerca de 72 hpf; mutantes heterozigóticos desenvolvem-se normalmente até adultos; ✓ Foram utilizados mutantes achesb55 e peixe-zebra linha AB → derivam de fêmeas resultantes do cruzamento de 2 populações (AxB), e que produziram embriões haploides saudáveis, que foram convertidos em diplóides, sendo que estes posteriormente foram cruzadas com machos AB não selecionados. 1. Linhas celulares tumorais são selecionadas e caracterizadas para a expressão e atividade da ACHE; 2. Embriões de peixe-zebra são injetados com 300 células tumorais aos 2 dpf; 3. Após 6 horas de injeção, embriões com sinal positivo são selecionados (sinal fluorescente); 4. Aos 3 dpf (72 hpf) as larvas mutantes (-/-) são separadas das (+/?) por resposta ao toque; 5. As larvas são fixadas e o tamanho do tumor medido; 6. O DNA foi tb extraído para quantificação de ALU humano (DNA repetitivo); Foi descoberto que mutantes achesb55 homozigóticos contêm maior nº de células tumorais do que heterozigóticos ou AB. Metástases Células tumorais circulantes (CTCs) dão origem a populações de células tumorais em locais distantes do tumor original – metástases. As CTCs podem viajar como células individuais ou pequenos grupos (clusters) – muito eficientes em estabelecer metástases. Página 19 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Cancros pediátricos O cancro infantil e nos adolescentes é uma das principais causas de morte em crianças e adolescentes, e compreende leucemias, tumores do sistema nervoso e sarcomas. Aproximadamente 10% dos cancros pediátricos são causados por mutações silenciosas em genes com pré-disposição para cancro; A suscetibilidade para cancro aumenta com distúrbios como neurofibromastose, e diversas síndromes, incluindo síndrome de Down. Os tumores do cérebro e sistema nervoso central correspondem a cerca de 25% de todos os cancros pediátricos. 3 estratégias principais: Mutagénese Transgénese Transplantação A transplantação envolve a injeção de células de pacientes ou de tumores induzidos em peixe-zebra, em embriões, 2 dias após a fertilização ou em adultos, para estudar a formação de tumores e metástases. Modelos ortotópicos – células tumorais são transplantadas para um órgão semelhante à localização primária do tumor. Úteis na recapitulação da heterogeneidade do tumor e características moleculares, e em revelar os processos de sinalização envolvidos na patogénese do cancro. Modelos heretotópicos – implantação de células tumorais em outros locais que não a localização primária do tumor. São muito utilizados para monitorizar a sobrevivência, proliferação e metástase e testar a eficácia de fármacos. Patologias Metabólicas ✓ São doenças ou condições que perturbam o normal processo metabólico → reações químicas que convertem alimentos em energia, envolvidas na construção e reparação de tecidos, e regulação das funções corporais. ✓ Patologias metabólicas podem resultar de mutações genéticas, estilo de vida, ou uma combinação de ambos, levando a desequilíbrios que afetam diversos órgãos e sistemas no corpo. Página 20 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Doenças Metabólicas afetam o anabolismo e catabolismo Anabolismo – processos metabólicos que levam à síntese de moléculas maiores a partir de menores e requerem energia. Inclui: Síntese de proteínas – construção de músculos, enzimas ou outras a partir de aa. Síntese de glicogénio – armazenamento de glucose como glicogénio no fígado e músculos. Armazenamento de lípidos – conversão e armazenamento de excesso de hidratos de carbono e lípidos em tecido adiposo. Catabolismo – quebra de moléculas grandes em mais pequenas com libertação de energia. Inclui: Glicólise – quebra de glucose para energia imediata. Lipólise – quebra de triglicéridos em ácidos gordos para energia, particularmente durante exercício físico ou jejum. Proteólise – quebra de proteínas em aa, qd glucose ou lípidos não estão disponíveis para libertação de energia. Tipos de patologias metabólicas Diabetes Mellitus Obesidade e síndrome metabólica o Obesidade o Síndrome metabólica - conjunto de condições como tensão elevada, hiperglicemia, acumulação de gordura abdominal, níveis anormais de colesterol ou triglicéridos. Desordens lipídicas o Hiperlipidemia o Hipercolesterolemia familiar Esteatose hepática ou fígado gordo não-alcoólico Desordens metabólicas hereditárias o Fenilcetonuria – incapacidade de metabolizar o aa fenilalanina, causando danos cerebrais se não tratada. o Doenças de armazenamento de glicogénio – incapacidade para decompor glicogénio em glicose. o Doenças lisossomais de sobrecarga – acumulação de metabolitos dentro dos lisossomas devido à deficiência de uma enzima lisossomal (ex. Tay-Sachs, doença de Gaucher). Desordens da tiróide o Hipertiroidismo e Hipotiroidismo Desordens mitocondriais – afetam as mitocondrias, levando a deficiência de produção de energia. Genes ortólogos e parálogos são 2 tipos de genes homólogos, ie, genes que surgem de uma sequência ancestral de DNA comum. Genes ortólogos - divergiram após um evento de especiação. Genes parálogos - divergem entre si dentro de uma espécie. Página 21 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos animais para diabetes Peixe-zebra como modelo para diabetes 5 dias após a fertilização, a estrutura básica do pâncreas do peixe-zebra é muito semelhante à de mamíferos adultos. O pâncreas é sensível à insulina, e tecidos e órgãos envolvidos na regulação da glucose no sangue bem como mecanismos moleculares relacionados com a regulação do metabolismo da glucose são evolucionariamente semelhantes aos dos mamíferos. São omnívoros e a sua taxa de utilização de hidratos de carbono e metabolismo de glucose é + elevada do que em peixes carnívoros. Genes relacionados com o metabolismo da glucose são expressos em peixe-zebra. Muitos genes em peixe-zebra têm 2 parálogos e são funcionalmente expressos em diferentes tecidos. Métodos para construção de modelos para diabetes em peixe-zebra Diabetes tipo I Ressecção cirúrgica do pâncreas – 1º método para induzir diabetes em animais. Indução por injeção de estreptozotocina – composto tóxico para as células beta- pancreáticas. Indução por modificação genética – desenvolvimento de linhas transgénicas. Diabetes tipo II Imersão em solução de glucose. Alimentação rica em lípidos. CRISPR/Cas9knockout. Página 22 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Diabetes gestacional Exposição de embriões a glucose elevada durante 24h. Exposição de fêmeas a glucose elevada antes ou durante a postura. Knockout ou knockdown de genes relacionados com o metabolismo da glucose ou insulina. Aplicações à diabetes gestacional Efeitos de hiperglicemia materna no desenvolvimento embrionário. → Organogénese – desenvolvimento do coração, pâncreas e sistema nervoso é alterado. → Stresse oxidativo – induzido nos embriões, levando a anormalidades no desenvolvimento. Reprogramação metabólica da descendência → Fêmeas hiperglicémicas dão origem a descendência com alterações na tolerância à glucose, sensibilidade à insulina e metabolismo lipídico. Função da placenta (transferência materno-fetal de glucose) → Possuem uma camada sincicial sobre a gema que pode ser estudada para o transporte de glucose e sinalização de nutrientes. Testes de fármacos → Permitem o screening de compostos quer a nível materno quer a nível do embrião. Estudos epigenéticos → Hiperglicemia materna pode alterar a regulação epigenética da descendência. Aplicações a complicações da diabetes: Modelo para retinopatia diabética (hiperglicemia induz alterações no olho do embrião). Modelo para cardiomiopatia diabética (hiperglicemia induz aumento do coração e hipertrofia do miocárdio). Modelo para fígado gordo (dieta rica em glucose ou gordura induz fígado gordo, resistência à insulina e fibrose). Modelos para hiperlipidemia e hipercolesterolemia familiar Hiperlipidemia e hipercolesterolemia familiar (HF) são condições relacionadas que envolvem um metabolismo anormal dos lípidos, mas diferem na base genética, na apresentação clínica e na fisiopatologia. Página 23 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Ambas as condições partilham estratégias de tratamento, incluindo estilo de vida saudável (dieta pobre em lípidos, exercício, controlo do peso), e utilização de fármacos para redução de colesterol e triglicéridos. HF geralmente requer terapia + agressiva devido ao risco acrescido de doença cardiovascular. Pequenos animais: Ratinho ; Ratazana ; Hamster ; Coelho ; Porquinho da índia ; Peixe-Zebra Grandes animais: Porco ; Cão ; Primatas não humanos Hipercolesterolemia familiar está relacionada com 3 genes: LDL recetor (LDLR), apolipoprotein B (APOB), e proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9). Cerca de 90% dos casos são devido a mutações em LDLR. Ratazanas e ratinhos não são os modelos ideais de HF devido às diferenças no metabolismo das lipoproteínas com os humanos – são resistentes à hipercolesterolemia induzida pela dieta. Os coelhos são frequentemente utilizados como modelo animal de hiperlipidemia e aterosclerose devido às semelhanças no metabolismo das lipoproteínas com os humanos. São muito sensíveis ao colesterol na dieta, desenvolvendo hipercolesterolemia severa e aterosclerose. Coelhos Nova Zelândia brancos desenvolvem lesões na aorta qd alimentados com dieta rica em colesterol durante 4-8 meses. Certos coelhos desenvolvem naturalmente hipercolesterolemia devido a mutações genéticas, como os coelhos Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL), que apresentam mutação no gene LDLR, e desenvolvem espontaneamente aterosclerose em 100% dos animais com 5 meses ou +. Aplicações: Compreender o papel de LDLR no metabolismo do colesterol. Testar fármacos como estatina, ezetimibae inibidores de PCSK9. Estudos de aterosclerose e estabilidade da placa. Página 24 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Os macacos caranguejeiros (Macaca fascicularis) são frequentemente usados como modelos primatas não-humanos para o estudo do metabolismo lipídico, hiperlipidemia e aterosclerose. São muito semelhantes aos humanos a nível de perfil de lipoproteínas, atividade de CETP, suscetibilidade a dislipidemias por dieta ou genéticas. Considerações éticas e altos custos requerem um planeamento cuidadoso e justificação para a sua utilização. Aplicações: Estudo de hiperlipidemia induzida por dieta. Modelação genética de dislipidemias – são utilizados para estudo de HF, incluindo mutações em LDLR, ApoB e PCSK9. Estudos pré-clínicos para eficácia, segurança e farmacodinâmica de fármacos. Estudo de progressão e regressão de aterosclerose. Metabolismo lipídico e hormonal – envelhecimento e condições endócrinas. Modelos para hipertiroidismo e hipotiroidismo Hipertiroidismo e hipotiroidismo são 2 condições opostas envolvendo a glândula tiróide, que regula o metabolismo através da libertação de hormonas –T3 (triiodotironina) e T4 (tiroxina). A principal função da tiróide é controlar a taxa de metabolismo – como o corpo transforma alimentos em energia. A tiróide necessita de iodo para a produção de hormonas. Hipertiroidismo pode ser causado por: Doença de Graves – condição autoimune que sobre-estimula a tiróide. Bócio – 1 ou + nódulos produzem excesso de hormonas. Tiróidite – inflamação que causa libertação de hormonas. Excesso de iodo – estimulação da produção de hormonas. Página 25 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência O hipertiroidismo espontâneo é uma doença endócrina comum em gatos de meia- idade e idosos. Maioria das vezes é causado por um adenoma benigno (não cancerígeno), clinicamente e patologicamente semelhante a bócio. Aplicações na Investigação Estudos sobre a função tiroideia: Investigar os mecanismos de hiperplasia da glândula tiroide e da produção excessiva de hormonas. Explorar fatores genéticos ou ambientais que contribuem para o hipertiroidismo. Complicações Cardiovasculares: Compreender a cardiomiopatia hipertrófica induzida por hipertiroidismo em gatos como modelo para doenças cardíacas humanas. Desenvolvimento de Tratamentos: Testar novos medicamentos, como fármacos antitiroideus (ex, metimazol). Avaliar a eficácia e a segurança da terapia com iodo radioativo Explorar intervenções dietéticas, como dietas com restrição de iodo. Investigação Ambiental: Estudar fatores ambientais associados à disfunção tiroideia em gatos. A elevada sensibilidade dos gatos a químicos disruptores da tiroide torna-os uma excelente espécie sentinela para a investigação em saúde ambiental. O peixe-zebra tem sido utilizado como modelo para estudar patologias da tiróide e a eficácia de terapêuticas. Contrariamente aos roedores, macacos rhesus exibem grande semelhança com os humanos no desenvolvimento da doença de Graves. Estudos em adenomas ou bócio nestes animais fornecem dados sobre formas não auto-imunes de hipertiroidismo. Aplicações: 1. Estudos metabólicos e endócrinos; 2. Avaliação da eficácia e segurança de Fármacos antitireoidianos e Imunoterapias dirigidas a autoanticorpos na doença de Graves; 3. Desenvolvimento de fármacos e toxicologia 4. Estudos longitudinais – efeitos a longo prazo do hipertiroidismo e tratamento no envelhecimento, reprodução e cognição. Página 26 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Hipotiroidismo pode ter muitas causas, entre as quais: Doenças autoimunes – doença de Hashimoto Deficiência em iodo ou outros elementos Cirurgia da tiróide Radioterapia Hipotiroidismo congénito Infeções ou inflamação Envelhecimento, etc Cão é um bom modelo para hipotiroidismo devido a: Ocorrência natural – causas semelhantes a humanos (destruição autoimune e atrofiada tiróide). Elimina a necessidade de indução em alguns estudos. Semelhanças fisiológicas com humanos. Respostas comparáveis a terapia de substituição da tiróide. Natureza crónica, tende a desenvolver-se com o tempo. Níveis de T4, T3 e TSH são comparáveis aos humanos. Respondem a thyrotropin-releasing hormone (TRH) e TSH de forma semelhante a humanos. Aplicações: Tireoidite Autoimune: estudos sobre destruição autoimune da tiróide, particularmente os papéis da genética, do ambiente e das respostas imunológicas. Fatores Genéticos: Certas raças de cães predispostas ao hipotireoidismo (ex. Golden Retrievers, Boxers e Beagles) auxiliam a explorar componentes genéticos da doença. Testes Diagnósticos: Os cães contribuem para o aperfeiçoamento de ferramentas diagnósticas, como testes de TSH, T4 e autoanticorpos. Novas Terapias: Como os cães desenvolvem hipotireoidismo naturalmente, são úteis para avaliar a eficácia e a segurança de novos tratamentos. Página 27 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos para fenilcetonuria Desordem genética autossómica recessiva caracterizada pela incapacidade de metabolizar o aa fenilalanina em tirosina devido a uma deficiência da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH). Se não tratada pode causar: Retardamento intelectual Problemas neurológicos Distúrbios no comportamento Modelos animais são cruciais para desenvolver novos tratamentos, como dietas baixas em fenilalanina, terapias enzimáticas e edição de genoma. Modelos em ratinho: Modelo Pah-enu2 (modelo clássico) – criado por introdução de mutações no gene Pah (phenylalanine hydroxylase). Os animais apresentam elevados níveis de fenilalanina, hipopigmentação (produção reduzida de melanina) e distúrbios comportamentais. Edição de genes através de CRISPR permitem criar mutação específicas em Pah, mimetizando as mutações humanas mais rigorosamente. Permitem estudar terapia de genes. Permitem: Explorar o impacto de elevada fenilalanina no cérebro; Entender a relação entre mutações em Pah e o fenótipo; Testar terapias de substituição de enzimas (ex. pegvaliase); Avaliar a eficácia de CRISPR/Cas9 para corrigir mutações; etc Modelos para doenças lisossomais de sobrecarga Doenças metabólicas hereditárias causadas por defeitos em enzimas lisossomais, transportadores, ou proteínas estruturais, que levam a acumulação de substratos não degradados nos lisossomas: Retardamento intelectual Problemas neurológicos Distúrbios no comportamento Página 28 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos em ratinho: Doença de Gauche – ratinhos com mutação no gene GBA1 mimetizam deficiência em glucocerebrosidase. Doença de Fabry – ratinhos com deficiência em α-galactosidade replicam acumulação globotriaosilceramida nos rins, coração e sistema vascular. Doença de Pompe – deficiência em alfa-glicosidase ácida replica a acumulação de glicogénio nos tecidos. Patologias Neurodegenerativas ✓ Ocorrem qd células nervosas do cérebro ou sistema nervoso central perdem função ao longo do tempo e eventualmente morrem. ✓ Incluem um grande nº de doenças, incluindo condições de demência progressiva, como a doença de Alzheimer, distúrbios na coordenação motora, como a doença de Parkinson, e uma grande gama de outras desordens neurológicas. ✓ Embora certos tratamentos ajudem a aliviar sintomas físicos ou mentais associados com estas doenças, não existe cura. ✓ Doenças específicas são distinguíveis pela presença de sintomas característicos que dependem da localização onde a perda de neurónios ocorre. ✓ A probabilidade de desenvolver uma doença neurodegenerativa aumenta drasticamente com a idade, sendo o envelhecimento o principal fator de risco para a maioria das doenças neurodegenerativas. ✓ Os tecidos compostos maioritariamente por células pós-mitóticas (não têm mais capacidade de se dividir depois de diferenciadas) como o cérebro, são particularmente sensíveis ao efeito do envelhecimento. Nas últimas décadas, o nº de pessoas com demência tem aumentado exponencialmente, principalmente devido ao aumento da esperança de vida. Índice de massa corporal elevado, níveis elevados de glucose no sangue, e tabagismo estão tb já identificados como fatores de risco para demências. Patologias Neurodegenerativas - Doença de Alzheimer (DA) o Forma predominante de demência. o Doentes com DA exibem uma acumulação substancial de placas Aβ e emaranhados neurofibrilares de proteína Tau, acompanhada por uma cascata de processos patológicos como neuroinflamação, disfunção sináptica, perturbações mitocondriais e bioenergéticas e anormalidades vasculares. Estes processos levam à morte de neurónios. o Geneticamente a doença está dividida em casos familiares e casos esporádicos. A forma familiar é devida a mutações em 3 genes principais (amyloid precursor protein (APP), presenilin1 (PSEN1) e presenilin 2 (PSEN2). A forma esporádica deve-se a diversos fatores genéticos e ambientais. o Menos de 1% dos casos de DA são familiares com início antes dos 65 anos. Maioria são casos esporádicos com início após os 65 anos. Página 29 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Pathway para o declínio cognitivo no processo neurodegenerativo: 1. Monómeros de beta-amiloide (Aβ) (peptídeos) agregam-se para formar oligómeros. 2. Subsequentemente, os oligómeros agregam-se para formar fibras Aβ, que por sua vez formam placas Aβ. 3. A formação de placas induz uma resposta inflamatória que inclui a formação de agregados de proteína Tau (proteínas que estabilizam os microtúbulos dos axónios dos neurónios), levando à conversão de neurónios saudáveis para neurónios doentes. 4. A presença de + neurónios doentes despoleta outra resposta inflamatória levando a + perda de neurónios e subsequente perda de função cerebral e declínio cognitivo. o Modelos animais para doença de Alzheimer são essenciais para estudar os mecanismos moleculares da doença e testar potenciais terapias. o Têm como objetivo replicar marcas patológicas chaves da doença, como a formação das placas β-amiloide, os emaranhados neurofibrilares de proteína Tau, neuroinflamação e perda sináptica, e défice cognitivo. o A maior limitação em roedores é que modelam DA familiar e não DA esporádica. Modelos onde DA ocorra naturalmente podem demonstrar de forma + precisa as alterações que ocorrem em Alzheimer esporádico. Modelos transgénicos em ratinhos: APP/PS1 – exibem mutações no gene APP (amyloid precursor protein) e PSEN1 (presenilin), levando à formação precoce de placa Aβ → apresentam níveis muito elevados de produção de β-amiloide associada com certas características anormais de comportamento. 3xTg-AD – transgénicos triplos, por mutações nos genes APP, PSEN1 e MAPTP (microtubule associated protein tau) → desenvolvem placas amiloides e emaranhados tau, associados com défice cognitivo. 5xFAD – sobre-expressam 5 mutações em DA familiar (3 em APP, 2 em PSEN1) → desenvolvem elevada deposição de placa amiloide entre 2-4 meses de idade, despoletando inflamação, e perda sináptica e de neurónios. Página 30 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos animais para Alzheimer: Modelos de ratinho baseados em patologia de tau o Correlacionam-se melhor com o declínio cognitivo do que as mutações em APP. Mutações do gene MAPT (microtubule associated protein tau) não estão identificadas em DA familiar. o Existem 2 tipos: modelos geneticamente modificados e modelos por injeção de tau. Estes são diversos relativamente ao método de engenharia genética (transgénico ou knock-in), isoformas expressas de tau, nível de expressão e regiões do cérebro onde a tau introduzida é expressa. o São criados por injeção de lisados de cérebro de pacientes com DA ou modelos em ratinho, ou por injeção de tau recombinante, em cérebros de ratinhos. o Nestes modelos, o alastramento de tau patológico ocorre via conexões sinápticas. Estes modelos identificaram vários elementos importantes que afetam a patologia de tau, incluindo o envelhecimento, Aβ ou a isoforma de tau. Modelos de primatas não-humanos o Os primatas não-humanos são úteis para o estudo das alterações associadas ao envelhecimento no cérebro e no comportamento, num modelo biologicamente próximo ao humano. o As proteínas Aβ e tau são altamente homólogas entre os primatas. o Com a idade, todos os primatas não-humanos analisados até à data desenvolvem placas Aβ. Em contraste, a tauopatia significativa é incomum nos símios, e apenas os humanos manifestam a tauopatia profunda, a degeneração neuronal e o comprometimento cognitivo que caracterizam a doença de Alzheimer. o Os primatas são modelos algo paradoxais de patologias semelhantes à DA; por um lado, são excelentes modelos de envelhecimento normal e de lesões Aβ que ocorrem naturalmente, podendo ser úteis para testar agentes diagnósticos e terapêuticos direcionados a formas agregadas de Aβ. o Por outro lado, a resistência dos macacos e símios à tauopatia e à neurodegeneração associada à DA, mm na presença de uma deposição cerebral substancial de Aβ, sugere que uma análise comparativa entre humanos e primatas não humanos poderia fornecer pistas informativas sobre a predisposição exclusivamente humana para a doença de Alzheimer. o Máxima longevidade conhecida e idades aproximadas onde a deposição Aβ está presente. Página 31 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos de injeção da doença de Alzheimer em primatas não-humanos oferecem várias vantagens: 1.Indução de Patologias: Permitem induzir patologias específicas relacionadas com a DA, como a deposição de Aβ e a hiperfosforilação de tau, numa idade mais jovem. Possibilita o estudo dos mecanismos da doença e da sua progressão sem a necessidade de esperar pelo processo natural de envelhecimento. 2.Experimentação Controlada: É possível controlar a dosagem, o momento e a localização das injeções, permitindo uma abordagem mais padronizada para o estudo dos efeitos da Aβ e de outros fatores relacionados com a DA. 3.Redução do Tempo Experimental: É possível encurtar significativamente o tempo necessário para observar sintomas e progressão da doença. Benéfico para estudos pré- clínicos, pois reduz os custos gerais e o tempo associado a estudos de longo prazo. 4.Avaliação de Intervenções Terapêuticas: Avaliar a eficácia de potenciais intervenções terapêuticas, como vacinas ou anticorpos monoclonais, num ambiente controlado. Isto permite a análise dos efeitos dos tratamentos na função cognitiva e nas alterações patológicas de forma oportuna. 5.Imitação da Doença Humana: Estes modelos podem reproduzir de forma próxima as características patológicas da DA humana, aumentando o potencial de tradução para contextos clínicos humanos. Este estudo observou várias alterações patológicas específicas nestes primatas, indicativas da fase inicial da doença de Alzheimer: 1. Placas Amiloides: Placas de Aβ foram identificadas ao longo do córtex em todos os animais idosos e de meia-idade. As placas desenvolveram-se espontaneamente com o avanço da idade, assemelhando-se às observadas na DA humana. 2. Alterações Neurofibrilares: Embora a imunorreatividade de tau tenha sido observada em todos os animais, raramente se apresentava como os emaranhados neurofibrilares clássicos, indicando um padrão diferente de envolvimento de tau em comparação com a DA humana típica. 3. Imunorreatividade Vascularde Aβ: Outras alterações semelhantes às da DA incluíram imunorreatividade vascular focal de Aβ, sugerindo alterações na saúde vascular associadas à deposição de placa amiloide. Página 32 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Patologias neurodegenerativas - Doença de Parkinson o Os sinais e sintomas + evidentes da doença de Parkinson ocorrem qd as células nervosas nos gânglios basais, uma área do cérebro que controla os movimentos, ficam comprometidas e/ou morrem. o Normalmente, estes neurónios produzem dopamina. Qd os neurónios morrem ou ficam comprometidos, produzem menos dopamina, o que provoca os problemas de movimento associados à doença. o A causa de morte dos neurónios ainda não está bem determinada. o A maioria dos casos de Parkinson não têm uma causa conhecida – serão provavelmente uma combinação de exposição ambiental a toxinas ou pesticidas e o background genético da pessoa. o Idade – o maior risco para o desenvolvimento o de Parkinson é a idade. A média de aparecimento da doença são 60 anos. o Homens são + prováveis de desenvolver Parkinson do que mulheres. o Exposição a alguns vírus está associada a um risco aumentado de DP – influenza, herpes simplex, hepatite B e hepatite C. o Trauma na cabeça – traumas repetidos na cabeça parecem aumentar a probabilidade de desenvolver Parkinson. Cerca de 15% das pessoas com esta doença têm um historial familiar da condição, e casos ligados à família podem ser o resultado de mutações num grupo de genes (LRRK2, PARK2, PARK7, PINK1 ou SNCA). SNCA: Este gene produz a proteína alfa-sinucleína. Nas células cerebrais de indivíduos com Parkinson, esta proteína acumula-se em aglomerados chamados corpos de Lewy. As mutações no gene SNCA ocorrem na doença de Parkinson de início precoce. PARK2: O gene PARK2 produz a proteína parquina (parkin), que normalmente ajuda as células a decompor e reciclar proteínas. PARK7: As mutações neste gene causam uma forma rara de Parkinson de início precoce. O gene produz a proteína DJ-1, que protege contra o stresse mitocondrial. PINK1: A proteína produzida pelo gene PINK1 é uma proteína cinase que protege as mitocôndrias do stress. As mutações no gene PINK1 ocorrem na doença de Parkinson de início precoce. LRRK2: A proteína produzida pelo gene LRRK2 é também uma proteína cinase. As mutações no gene LRRK2 estão associadas à doença de Parkinson de início tardio. Página 33 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Modelos animais para a doença de Parkinson: Estes modelos têm como objetivo a replicação de características como a degeneração dos neurónios que libertam dopamina, a presença de corpos de Lewy e o défice motor. Modelos de indução da doença de Parkinson: A indução da DP em modelos experimentais pode ser feita por intervenção farmacológica, manipulação genética ou uma combinação de ambas. Indução da DP em Modelos Animais por Intervenção Farmacológica → Os modelos farmacológicos (baseados em toxinas) mimetizam a DP esporádica através de uma perda rápida e acentuada de dopamina na via nigroestriatal. → Podem ser desenvolvidos através da exposição a neurotoxinas, ou pela administração de fibrilas pré formadas de α-sinucleína. → Uma limitação é a ausência da formação de corpos de Lewy, uma das características principais da DP. Indução da DP em Modelos Animais por Manipulação Genética → Formas + de DP associadas a perturbações genéticas e mutações nos genes que codificam para a α-sinucleína, Parkin, Pink1 e LRRK2 têm sido identificadas, podendo vir a ser potenciais alvos terapêuticos. → Os modelos genéticos de DP são desenvolvidos através da sobre-expressão de genes autossómicos dominantes (α-sinucleína e LRRK2) ou de genes autossómicos recessivos (knockout ou knockdown de genes que codificam para Parkin, Pink1 e DJ-1). MPTP(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) → Utilizado em primatas, ratos e por vezes, peixes-zebra. → O MPTP atravessa a barreira hematoencefálica e metaboliza-se em MPP+, que é tóxico para os neurónios dopaminérgicos. → Imita muitos dos sintomas da doença de Parkinson, incluindo défices motores. Rotenona → Um pesticida que induz a morte de neurónios dopaminérgicos ao inibir o complexo mitocondrial. → Usado em roedores, este modelo imita tt as características motoras como algumas não motoras da doença de Parkinson. Paraquat e Maneb → Herbicidas que induzem stresse oxidativo e neurodegeneração dopaminérgica. → Tipicamente utilizados em ratos. Página 34 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Drosophila melanogaster Por que usar a Drosophila em modelos de DP? 1.Conservação genética → Muitos genes associados à DP em humanos, como α-sinucleína, Parkin, PINK1, LRRK2 e DJ-1, têm homólogos funcionais em Drosophila. 2. Fácil manipulação genética → A Drosophila permite manipulações genéticas precisas, como sobre-expressão de genes, knockdown, ou mutações específicas. 3. Sistema nervoso funcional → Embora simplificado, o sistema nervoso da Drosophila compartilha neurotransmissores como dopamina, permitindo o estudo da degeneração de neurónios dopaminérgicos, característica da DP. 4.Rapidez e custo → O curto ciclo de vida e o custo reduzido tornam a Drosophila ideal para estudos em larga escala, incluindo triagem de medicamentos. Avaliação de fenótipos em Drosophila: Déficits motores: Usando testes como escalada negativa gravitacional (negative geotaxis). Degeneração neuronal: Avaliada por imunohistoquímica ou microscopia. Disfunção mitocondrial: Estudada em músculos e tecidos neurais. Respostas a terapias: Triagem de fármacos e estudos genéticos. Limitações do modelo: A simplicidade do sistema nervoso da Drosophila não reflete a complexidade do cérebro humano. Faltam corpos de Lewy, uma característica patológica central da DP humana. Diferenças metabólicas e fisiológicas podem afetar a translação de terapias para humanos. 1. Sobre-expressão de α-sinucleína humana A sobre-expressão de α-sinucleína em Drosophila causa a degeneração de neurónios dopaminérgicos e déficits motores, mimetizando a patologia da DP. Modelos de α-sinucleína são usados para estudar a formação de agregados proteicos e identificar moduladores genéticos ou farmacológicos. Página 35 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência 2. Mutação de genes relacionados à DP Parkin e PINK1: As mutações ou deleções nos genes homólogos de Parkin e PINK1em Drosophila levam a defeitos mitocondriais, morte neuronal e disfunção locomotora. DJ-1: Knockout do gene DJ-1 resulta em maior sensibilidade ao stresse oxidativo e degeneração neuronal. LRRK2: A superexpressão de variantes mutantes de LRRK2 em Drosophila causa neurodegeneração e déficits motores. 3. Indução de stress oxidativo Modelos expostos a toxinas como paraquat ou rotenona imitam o stresse oxidativo e a degeneração dopaminérgica observados na DP. Caenorhabditis elegans o Caenorhabditis elegans é um nemátode de vida livre, não parasítico, que habita o solo e alimenta-se de bactérias. o Os adultos podem ser facilmente cultivados em laboratório. o C. elegans é principalmente uma espécie hermafrodita, o que permite a geração de populações geneticamente idênticas e a preservação de linhagens. o Tb existem machos com uma frequência inferior a 0,2%, possibilitando a realização de cruzamentos genéticos. o Cada indivíduo hermafrodita possui 959 células somáticas e pode produzir cerca de 300 descendentes por autofecundação ou até 1000 descendentes ao acasalar com machos (que possuem 1031 células somáticas). o Este animal é transparente em todas as fases do seu ciclo de vida, oferecendo uma capacidade única para visualização, observação e monitorização fáceis de processos fisiológicos e celulares. o C.elegans apresenta um ciclo reprodutivo muito curto, concluído em 2.5 dias a 25°C e em 3.4 dias a 20°C, com uma esperança de vida de cerca de 2–3 semanas. o O genoma está completamente sequenciado e anotado, apresentando um elevado grau de conservação com genes humanos. o Estas características tornam este nematode um organismo modelo versátil para o estudo de diversos fenómenos biológicos e doenças humanas. Página 36 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Por que usar a C. elegans em modelos de DP? Os neurónios de C. elegans partilham muitas características funcionais com os de eucariotas superiores, incluindo neurotransmissores, recetores e neuromoduladores. Apesar do sistema nervoso simples, apresenta uma ampla variedade de respostas que vão desde uma simples aversão a estímulos mecânicos até comportamentos relativamente complexos, como defecação, termotolerância, aprendizagem associativa e memória. Notavelmente, o declínio funcional neuronal associado à idade é conservado de forma evolutiva em organismos tão diversos qt este nemátodo e os humanos, indicando semelhanças nos mecanismos moleculares subjacentes. Marcadores associados à DP foram identificados em C.elegans, com linhagens que replicam as causas genéticas + frequentes da doença, como LRRK2, PARK2 e DJ-1,além de modelos que expressam a proteína α-sinucleína. → C. elegans oferece uma oportunidade única para estudar a função neuronal, a formação de circuitos neuronais e a neurodegeneração, pois todo o conectoma dos seus 302 neurónios foi reconstruído e está bem definido. → C. elegans permite a combinação de diversas abordagens, como imagiologia fluorescente in vivo, manipulação da atividade neuronal e rastreamento genético sistemático. As principais descobertas da investigação sobre os oligómeros de α-sinucleína incluem: Identificação do Fenótipo Motor: O estudo identificou um fenótipo motor anteriormente não descrito em C. elegans transgénicos que expressam α-sinucleína. Resulta da disfunção de neurónios dopaminérgicos e ocorre antes de qq perda neuronal, indicando alterações neurodegenerativas iniciais associadas à patologia da α-sinucleína. Correlação com os Níveis de α-Sinucleína: A gravidade da disfunção motora em C. elegans foi positivamente correlacionada com os níveis de α-sinucleína. Página 37 de 38  Modelos Experimentais em Biomedicina - Frequência Descoberta e Reutilização de Fármacos: Abordagem inovadora que combinou métodos de rastreio in silico, in vitro e in vivo para identificar compostos que inibem a agregação e citotoxicidade da α-sinucleína. Identificaram-se 5 compostos que reduziram a disfunção motora em C. elegans, sendo que 3 destes compostos tb diminuíram os oligómeros de α-sinucleína em neurónios de mamíferos. Implicações para Intervenções Terapêuticas: Os resultados sugerem que intervenções que reduzem o comportamento de enrolamento em C. elegans podem identificar mutações genéticas ou pequenas moléculas que inibem a citotoxicidade da α-sinucleína in vivo, fornecendo um caminho promissor para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a doença de Parkinson. Página 38 de 38