RNA Trascrizione PDF

Dal DNA al RNA: la trascrizione. RNA e origine della vita. Esperimenti di Beadle e Tatum sulla muffa Neurospora crassa (1940s): UN GENE -> UN ENZIMA L. Pauling, Nobel per la Chimica (1954): una mutazione puntiforme che altera una proteina è la causa di u...

Dal DNA al RNA: la trascrizione. RNA e origine della vita. Esperimenti di Beadle e Tatum sulla muffa Neurospora crassa (1940s): UN GENE -> UN ENZIMA L. Pauling, Nobel per la Chimica (1954): una mutazione puntiforme che altera una proteina è la causa di una malattia genetica emoglobina 2 catene alfa (141 aa) 2 catene beta (146 aa)  IL DNA COME MATERIALE EREDITARIO - trasformazione dello pneumococco (Avery et al., 1943) - esperimenti con fago T2 (Hershey & Chase, 1952) EQUIMOLARITA’ DELLE BASI A-T, G-C (Chargaff, 1950) DIFFRAZIONE DEL DNA CON RAGGI X (Franklin & Wilkins, 1951) MODELLO DELLA DOPPIA ELICA (Watson & Crick, 1953) LA REPLICAZIONE DEL DNA E’ SEMICONSERVATIVA (Meselson & Stahl, 1958) UN GENE - UN ENZIMA - mutanti nutrizionali di Neurospora (Beadle & Tatum, 1941) UNA MUTAZIONE PROVOCA UNA VARIAZIONE DELLA SEQUENZA AMINOACIDICA - emoglobina e anemia falciforme (Pauling, 1949) La sequenza lineare dei nucleotidi in un segmento di DNA determina la sequenza lineare (struttura primaria) degli aminoacidi nella proteina corrispondente  Il DNA si può suddividere in unità funzionali, i geni Un gene è una sequenza di nucleotidi che agisce da unità funzionale per la produzione di una proteina (oggi sappiamo che ci sono geni che codificano RNA che non viene tradotto in proteina) Un cromosoma è formato da una singola molecola di DNA enormemente lunga che contiene una schiera lineare di molti geni Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Il dogma centrale della biologia Replicazione del DNA molecolare Riparazione del DNA Ricombinazione genetica (Crick, 1958) L’informazione per costruire un organismo vivo, da un batterio al uomo, risiede nel DNA, dal quale c’e un flusso di informazione Sintesi del RNA prima a RNA e poi a proteine, Trascrizione che sono i costituenti strutturali e funzionali principali di cellule e organismi. Crick pensava che l’informazione Sintesi delle proteine non potesse fluire all’indietro Traduzione (dalle proteine), ma in realtà può in alcuni casi fluire indietro dall’RNA (virus). Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. L’informazione al interno della doppia elica di DNA è organizzata in tratti definiti, unità funzionali che codificano ognuna per una proteina: i geni. Geni diversi vengono letti con diversa frequenza, e così proteine diverse sono prodotte in quantità differenti. Amplificazione Trascrizione Trascrizione Espressione genica Controllo Amplificazione Controllo Traduzione Traduzione LA TRASCRIZIONE - E’ il processo di sintesi di RNA usando come stampo il DNA. - La doppia elica di DNA si apre e uno dei due filamenti fa di stampo per la sintesi del RNA, grazie all'appaiamento delle basi. - La sequenza di RNA risultante è complementare a quella che fa da stampo, e identica (tranne U in vece di T) a quella che non fa da stampo. - Il processo è molto simile alla replicazione del DNA: i nucleotidi trifosfato (A, U, C, G) portano legami ad alta energia, che viene usata per la formazione del nuovo legame fosfodiestere. - Diversamente dalla replicazione, la catena di RNA si stacca presto dal DNA stampo. - Le catene di RNA, i trascritti, sono molto più corti che le catene di DNA. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Differenze: -Lo zucchero è ribosio in vece di deossiribosio. - In vece di timina, ci sta l’uracile, che forma coppia con l’adenina, dunque il principio della complementarità delle basi si mantiene per l’RNA, permettendo la trasmissione d’informazione. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Come nella coppia timina - adenina, in quella uracile - adenina ci sono due legami a idrogeno. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Il legame fra nucleotidi è lo stesso nell’RNA e nel DNA: legame covalente fosfodiestere. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Pero l’RNA, anche se molto simile al DNA chimicamente, si organizza in forma molto diversa: non fa una doppia elica, il filamento unico si ripiega; gli RNA possono adottare tantissime conformazioni diverse, grazie ai legami tra le sue basi. Questo permette all’RNA di svolgere ruoli molto diversi: trasmissione della informazione genetica (stampo per fare proteine), ruoli strutturali e persino ruoli catalitici. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. RNA_structure  Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Ci sono diversi tipi di RNA, con diverse funzioni: Tipo di RNA Funzione RNA messaggero – codifica le proteine RNA ribosomico – forma il nucleo dei ribosomi, catalizza la sintesi di proteine micro RNA – regolano l’espressione genica negli eucarioti RNA transfer – adattatori che mediano il legame dei nucleotidi al mRNA Altri piccoli RNA Attivi nello splicing, la sintesi dei telomeri (allungamento delle estremità dei cromosomi), e molte altre funzioni Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. La trascrizione avviene grazie all’enzima RNA polimerasi, e ci sono tappe fondamentali: 1. INIZIO: posizionamento dell’RNA polimerasi 2. ALLUNGAMENTO: efficiente ma con più errori della replicazione del DNA 3. TERMINAZIONE: distacco dell’enzima Il processo generale è simile tra procarioti ed eucarioti, ma ci sono anche delle differenze. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Tutti e due filamenti di DNA possono fare da stampo per la trascrizione, ma per ogni gene esiste solo un promotore (punto d’inizio della trascrizione), in una delle due catene: solo uno dei due filamenti funziona come stampo per mRNA per ogni gene. A seconda del filamento che fa da stampo, il promotore è orientato in modo che lo stampo va in direzione 3’ → 5’ e il trascritto si polimerizza in direzione 5’ → 3’ Trascrizione nei procarioti: inizio: C’è un sito iniziatore all’estremità 3’ del gene: il promotore Il promotore non viene trascritto L’RNA-polimerasi si attacca fortemente al promotore e con un preciso orientamento: sintesi in direzione 5’ → 3’ (stampo 3’ → 5’) Legame RNA-polimerasi: regione di ~ 60 nucleotidi PROMOTORE Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Nel caso dell’RNA polimerasi batterica, l’inizio della trascrizione avviene al promotore grazie alla subunità sigma, che media il legame al promotore e si stacca dopo ˜10 nucleotidi. Trascrizione nei procarioti: allungamento: Nei batteri c'è soltanto un tipo di RNA polimerasi, simile alla DNA polimerasi. Apre solo una ‘finestra’ di doppia elica DNA per usare un filamento come stampo, e avanza spostando la finestra lungo il DNA, sintetizzando RNA in direzione 5’→ 3’. Solo un tratto breve di RNA rimane legato al DNA (˜9-12 nucleotidi), la RNA polimerasi fa staccare il trascritto in sintesi e chiude il DNA già ricopiato. L’RNA-polimerasi batterica ha 4 subunità, PM ~ 500.000 Da Ganasce in configurazione RNA polimerasi chiusa Direzione della trascrizione Ribonucleotidi trifosfato Sito attivo Nuovo trascritto Breve tratto di di RNA elica DNA/RNA  Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. L’RNA polimerasi somiglia la DNA polimerasi, ma ci sono pure delle differenze: - Catalizza il legame fosfodiestere fra ribonucleotidi, invece che deossiribonucleotidi. - Può cominciare la sintesi di RNA senza innesco. - Non possiede attività esonucleasica. Non ha bisogno di essere così accurata: un errore nell’RNA non è così drammatico come nel DNA. La DNA polimerasi sbaglia 1 ogni 107 nucleotidi, con la correzione 1 ogni 109 ; l’RNA polimerasi sbaglia 1 nucleotide ogni 104. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Visto che il trascritto di RNA si stacca presto dal DNA stampo, si può cominciare la sintesi di un nuovo trascritto dallo stesso gene prima che il precedente sia stato finito: si possono sintetizzare simultaneamente tanti trascritti dallo stesso gene.  Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Trascrizione nei procarioti: terminazione: La parte finale del filamento stampo (regione del terminatore) ha sequenze ricche in C e G, che sono complementari e si appaiano formando una forcina. Il sito di terminazione è ricco di A. ore CUGGCGGC GCCGCCAG equenze GeC hi di T UUUU RNA assume struttura a forcina ricca in CG Trascrizione negli eucarioti - Ci sono tre tipi di RNA polimerasi con ruoli diversi: Tipo di polimerasi Geni trascritti Maggioranza del RNA ribosomiale (rRNA) Geni codificanti proteine (mRNA); miRNA; altri piccoli RNA Geni per RNA transfer (tRNA); gene per rRNA 5S; altri piccoli RNA - Il controllo dell’espressione genica è molto più complesso negli eucarioti: ci sono lunghi tratti di DNA non codificante tra i geni, dove si trovano tante sequenze di regolazione dell’espressione genica. - Promotori più variabili, a volte si trovano a valle del gene. - Il DNA eucariotico è organizzato in modo complesso, insieme a certe proteine, formando la cromatina. Trascrizione negli eucarioti: inizio Richiede l’intervento di tante proteine: fattori generali di trascrizione. Tutti insieme: - fanno legare l’RNA polimerasi al promotore; - aprono la doppia elica di DNA; - fanno partire l’RNA polimerasi. In alcuni geni, il primo fattore di trascrizione (TFIID) lega un tratto del promotore contenente tante A e T: la TATA box o sequenza TATA. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. La proteina che lega la sequenza TATA (TBP, TATA box binding protein) causa un piegamento dell’elica di 80°; questo piegamento, insieme alla sequenza ricca in A e T, facilitano la separazione dei due filamenti di DNA, rendendo possibile l’inizio della trascrizione. Dopo il legame di TFIID si legano gli altri fattori generali di trascrizione e l’RNA polimerasi, formando il complesso d’inizio della trascrizione.  Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Trascrizione nei eucarioti: allungamento e terminazione Una volta che l’RNA polimerasi si è legata per bene, si deve sganciare dal complesso d’inizio e avviare la trascrizione. Questo succede grazie alla fosforilazione della ‘coda’ della RNA polimerasi, operata da un fattore di trascrizione che ha attività chinasi. I fattori generali di trascrizione si staccano e sono disponibili per un altro ciclo. La RNA polimerasi completa la sintesi del trascritto, si stacca dal DNA e viene defosforilata, così è pronta per un altro ciclo. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. transcription Dopo la trascrizione, i trascritti vengono processati per assumere la sua forma funzionale: maturazione dell’RNA. La maturazione di rRNA e tRNA segue processi simili in procarioti ed eucarioti, quella dell’mRNA è diversa. Maturazione degli rRNA Negli eucarioti, gli rRNA vengono sintetizzati nei nucleoli, e ci sono 4 tipi di rRNA: 18 S, 28 S e 5,8 S provengono da un trascritto comune 5 S viene trascritto separatamente Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Maturazione dei tRNA - Taglio di alcune sequenze - Aggiunta del trinucleotide CCA al 3’ - Modificazione del 10-15% dei nucleotidi (metilazioni o basi insolite) Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. La maturazione degli mRNA nei eucarioti Nelle cellule eucariotiche la trascrizione avviene al interno del nucleo, dove gli mRNA sono sottoposti a un processo di maturazione dopo la sintesi e prima del suo trasporto al citoplasma. Gli enzimi per la maturazione interagiscono con l’RNA polimerasi, e cominciano ad agire man mano che il trascritto esce dalla polimerasi. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Ci sono tre processi di maturazione degli mRNA negli eucarioti: 1 - Apposizione de un cappuccio di guanina metilata all’estremità 5’, quando l’mRNA è ancora in sintesi (dopo circa 25 nucleotidi). 2- Addizione de una coda di poli-A (150-250 A) all’estremità 3’: poliadenilazione. Queste due modifiche stabilizzano l’mRNA (prolungano la sua vita) e lo identificano come messaggero pronto per il trasporto al citoplasma e la traduzione in proteina. Cappuccio di guanina metilata all’estremità 5’, aggiunto quando l’mRNA è ancora in sintesi (dopo circa 25 nucleotidi). Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Gli mRNA batterici sono semplici: una sequenza ininterrotta codifica una proteina. I geni delle cellule eucariotiche producono mRNA che hanno sequenze interposte: introni, non codificanti; e sequenze codificanti, che danno la proteina: esoni. C’è tanta variazione, ma in genere i geni eucariotici contengono diversi introni, più lunghi degli esoni. La presenza d’introni è stata scoperta grazie a sperimenti d’ibridazione tra DNA e RNA: Denaturazione di DNA (separazione dei filamenti riscaldando sopra 70°C) → rinaturazione in presenza di mRNA purificato in eccesso → il DNA del gene è molto più lungo dell’mRNA corrispondente SEQUENZE CODIFICANTI → presenti sia nel DNA che nell’mRNA (1 - 7) Expressed regions = EXONS (ESONI) SEQUENZE NON CODIFICANTI → presenti solo nel DNA (A - G) Intragenic regions = INTRONS (INTRONI) Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Il terzo processo di maturazione del mRNA: 3 - taglio degli introni e saldatura degli esoni - splicing per produrre un mRNA di sequenza codificante continua. Lo splicing può cominciare già durante la trascrizione dell’RNA, e la poliadenilazione può avvenire durante o dopo lo splicing. Gli introni hanno delle sequenze nucleotidiche che sono segnali per il processo di splicing: Sequenze richieste per la rimozione dell’introne Parte di un trascritto primario R=AoG Parte di un Y=CoU mRNA maturo N = qualunque Lo splicing avviene con la formazione d’una struttura prima ad ansa e poi a cappio, dove c’e una A che gioca un ruolo fondamentale. Per far avvenire lo splicing serve: - Distinguere gli esoni dagli introni - Identificare il confine tra esoni e introni - Avvicinare le estremità 3’ di un esone all’estremità 5’ dell’esone successivo - Rimuovere l’introne e unire le estremità degli esoni Il processo di splicing viene svolto dallo spliceosoma: aggregato di piccole molecole di RNA (piccoli RNA nucleari, snRNA) che si uniscono a proteine formando piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari (snRNPs: small nuclear ribonucloproteins). In questo aggregato nucleoproteico, sono gli snRNA a svolgere per lo più le funzioni catalitiche necessarie per il taglio e saldatura che elimina gli introni. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. RNA_splicing_mech Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Caratteristiche degli introni nei diversi geni: dimensioni singolo introne: 80 - 10.000 bp numero di introni per gene: da 1 a > 50 sequenza altamente variabile, eccetto gli estremi Composizione di alcuni geni umani, in migliaia di basi Proteina Dimensioni Dimensioni % N. introni gene mRNA -globina 1,5 0,6 40 2 Albumina 25 2,1 8,4 14 catalasi 34 1,6 4,7 12 Recettore LDL 45 5,5 12,2 17 Fattore VIII 186 9 4,8 25 Tiroglobulina 300 8,7 2,9 36 Distrofina >200 17 50 Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Perché i geni degli eucarioti sono così complessi? - Un vantaggio è la possibilità di combinare gli esoni in maniere diverse per fare più versioni della proteina: splicing alternativo: proteine diverse da un unico mRNA trascritto primario Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Grazie allo splicing alternativo, si fanno versioni diverse (isoforme diverse) della stessa proteina in tessuti diversi, partendo da un unico gene e trascritto primario. Con lo splicing si aumenta il potenziale di codificazione del genoma: Nell’uomo da 30.000 geni → 100.000 proteine Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. - Un altro vantaggio è di tipo evolutivo: l’organizzazione modulare dei geni permette fare proteine nuove ricombinando domini già esistenti in altre proteine (per ricombinazione genetica). Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Non c’è correlazione tra complessità di un organismo e le dimensioni del suo genoma Solo il 2% del genoma umano codifica per proteine, e il resto? DNA spazzatura? Il DNA non codificante aumenta con l’aumentare della complessità dell’organismo. La maggior parte dei geni dei mammiferi non codifica per proteine, ma per molecole di RNA. L’RNA intronico (e forse anche quello degli esoni) può avere un ruolo regolatorio nell’espressione dei geni agendo su DNA, RNA,e proteine. REGOLARE l’espressione genica richiede informazione!  Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Soltanto gli mRNA che sono stati maturati correttamente possono uscire dal nucleo per essere tradotti a proteina nel citoplasma. Gli altri sono degradati all’interno del nucleo, e i nucleotidi riciclati. L’uscita è selettiva e controllata, e dipende del legame di diverse proteine che riconoscono le modifiche avvenute durante la maturazione. Proteina che lega il cappuccio TRADUZIONE Proteina che lega la coda poli-A EJC: complesso di giunzione esonica Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. I procarioti hanno una espressione genica più semplice, ma ancora non sappiamo: - se le cellule eucariotiche hanno acquisito gli introni come materiale genetico invasivo, - o le cellule primitive avevano introni, e poi i procarioti li hanno eliminato per essere più efficienti nella replicazione ed espressione del proprio genoma. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Gli mRNA si usano diverse volte per produrre proteina. Quanto più a lungo persiste una molecola di mRNA nel citoplasma, tante più volte può essere usata per sintetizzare la proteina. La durata di un mRNA dipende da diversi segnali che regolano la degradazione dell’RNA, che alla fine avviene per azione di nucleasi. Questi segnali e altri si trovano nell’estremità non tradotte degli mRNA: 5’ e 3’ UTR (untranslated regions). 3’ UTR Sequenza codificante 5’ UTR  Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. L’origine della vita nella Terra Studiando i processi d’espressione genica, si arriva a un dilemma: se gli acidi nucleici sono necessari per fare le proteine, e le proteine sono necessarie per sintetizzare e processare gli acidi nucleici, quale molecola è comparsa prima? Un’ipotesi sostiene che c’e stato un periodo dove la vita era tutta basata sull’RNA: il mondo a RNA, dove l’RNA era la molecola che portava l’informazione e pure quella che svolgeva le funzioni catalitiche. Come prova, sono rimasti degli RNA con funzione catalitica (ribosoma e spliceosoma), due casi di ‘fossili molecolari’. Nel mondo a RNA, le molecole di RNA erano in grado di svolgere attività che oggi si considerano proprie degli esseri viventi: formavano un sistema autocatalitico, in grado di: - replicarsi per formare molecole identiche alla prima, usando materia prima dall’ambiente (nucleotidi); - competere con altre forme autocatalitiche per le risorse ambientali; - ‘morire’ se le reazioni catalizzate raggiungono l’equilibrio chimico o se le condizioni ambientali (temperatura, nutrienti, etc) sconvolgono i loro processi chimici. L’RNA si può replicare usando il meccanismo a stampo per fare molecole identiche alla prima: L’RNA è pure in grado di catalizzare delle reazioni: ribozimi. Grazie alla loro sequenza nucleotidica, gli RNA possono adottare delle conformazioni tridimensionali particolari, alcune delle quali sono adatte a catalizzare reazioni chimiche mediate dall’accoppiamento delle basi con il substrato. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. Non sappiamo se il mondo a RNA sia veramente esistito, ma ci sono RNA in natura e fatti in laboratorio in grado di catalizzare diverse reazioni: Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita. L’inizio dell’evoluzione… L’RNA è più semplice chimicamente del DNA: il ribosio si può formare nel ‘brodo primitivo’, invece il deossiribosio ha bisogno di enzimi proteici per la sua sintesi. Le proteine, con più gruppi reattivi e più capacità catalitiche, hanno preso il posto come molecole funzionali delle cellule. Il DNA, comparso probabilmente più tarde nella storia evolutiva, è più stabile e più adatto alla riparazione dei danni chimici. Ha preso il posto come molecola per tramandare l’informazione genetica. Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita.