Analytická chémia Prednáška č. 4 PDF

Analytická chémia Prednáška č. 4 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Spektrálne metódy Elektromagnetické žiarenie - svetlo má vlnový charakter a dá sa opísať Maxwellovými rovnicami - priečne vlnenie, každej vln...

Analytická chémia Prednáška č. 4 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Spektrálne metódy Elektromagnetické žiarenie - svetlo má vlnový charakter a dá sa opísať Maxwellovými rovnicami - priečne vlnenie, každej vlne prislúcha elektrická a magnetická zložka (vektory intenzity elektrického a magnetického poľa sú kolmé navzájom na seba aj na smer šírenia žiarenia pričom periodicky menia svoju veľkosť) - žiarenie, ktorého magnetický a elektrický vektor kmitá iba v jednej rovine označujeme za polarizované (lineárne) Frekvencia - (v) je počet jednotkových priebehov vlny, jedenkrát z východiskovej hodnoty cez kladnú a zápornú amplitúdu opäť do východiskovej hodnoty vztiahnutý na jednotku času - jednotkou je Hz - frekvencia je základná vlastnosť elektromagnetického žiarenia, pretože na rozdiel od rýchlosti zostáva konštantná pri prechode žiarenia z jedného prostredia do druhého - trvanie jedného kmitu je perióda vlnenia Vlnová dĺžka - je dráha, o ktorú sa postúpi žiarenie za čas jednej periódy (kmitu) - používajú sa rôzne jednotky dĺžky - medzi frekvenciou a vlnovou dĺžkou platí rovnica v = c/𝛌 - vlnočet je počet vĺn pripadajúci na dĺžkovú jednotku c - konštanta, rýchlosť svetla vo vákuu má hodnotu 2,9979×108 m/s Elektromagnetické spektrum - zahŕňa žiarenia, ktorých vlnové dĺžky sú vo veľmi širokom rozsahu - slnečné svetlo predstavuje široký interval vlnových dĺžok, pričom je to polychromatické žiarenie - žiarenie jednej vlnovej dĺžky sa označuje ako monochromatické - oblasť vlnových dĺžok viditeľného žiarenia (svetla) je veľmi úzka 400-800 nm - oblasť krátkych dĺžok sa označuje ako UV, RTG Interakcia elektromagnetického žiarenia s látkou - interakcia bez výmeny energie: ide o jav ako lom, odraz a interferencia žiarenia, ktoré sa využíva na smerovanie lúčov žiarenia, polarizáciu alebo monochromatizáciu vo všetkých optických zariadeniach (metódy založené na týchto javoch a nazývajú nespektrálne metódy). Nesleduje sa pri nich výmena energie medzi látkou a žiarením, ale zmeny niektorých vlastností žiarenia -refraktometrické metódy využívajú zmenu rýchlosti a smeru šírenia žiarenia - polarimetrické metódy, čiastočnú alebo úplnú polarizáciu lúča, prípadne otočenie roviny polarizovaného svetla opticky aktívnou látkou Interakcia elektromagnetického žiarenia s látkou - interakcia spojená s výmenou energie medzi žiarením a látkou, interakcia pomocou fotónu (častica s nulovou kľudovou energiou a hmotnosťou) s niektorou elementárnou časticou, ktorá tento fotón absorbuje alebo emituje (v oboch prípadoch sa zmení energia) Rozdelenie spektrálnych metód - emisné metódy sú založené na meraní žiarenia emitovaného vzorkou. - analyzovanej vzorke sa dodá budiaca energia v podobe tepla, elektrickej energie, prostredníctvom zrážok s prúdom častíc, chemickej energie alebo pomocou primárneho elektromagnetického žiarenia - prijatím tejto energie sa atómy alebo molekuly dostavajú do menej stabilných vyšších energetických stavov a prebytočnej energie sa zabavujú v podobe elektromagnetického žiarenia, ktoré sa registruje a vyhodnotí Rozdelenie spektrálnych metód - absorpčné metódy sú založené na meraní pohlcovania (absorpcie) žiarenia vzorkou - využíva sa žiarenie z celého elektromagnetického spektra Všeobecné princípy spektrálnych metód - absorpcia žiarenia je proces, pri ktorom dochádza k prechodu atómov alebo molekúl látky z východiskového stavu do možného energeticky vyššieho (exitovaného) stavu - absorpcia žiarenia sa meria nepriamo na základe selektívneho zoslabenia intenzity žiarenia z externého zdroja určitej vlnovej dĺžky po prechode transparentným prostredím s analyzovanou látkou. Základný predpoklad je, že žiarenie sa zoslabuje len v dôsledku absorpcie - mierou absorpcie je pomer intenzity predchádzajúceho a vstupujúceho žiarenia - transmitancia T = 𝜱/𝜱0 Všeobecné princípy spektrálnych metód - transmitancia T = 𝜱/𝜱0 kde 𝜱0 je žiarivý tok pred a 𝜱 je žiarivý tok po prechode cez absorbujúce prostredie (udáva sa v %) Trasmitancia je závislá od: - vlnovej dĺžky - počtu absorbujúcich častíc - absorbujúceho prostredia Všeobecné princípy spektrálnych metód Miera zoslabenia žiarenia sa vyjadruje pomocou Bouguervoho-Lambertovho-Beerovho zákona: 𝜱= 𝜱0 10-a l N kde a je monochromatický absorpčný koeficient, N je počet atómov v objemovej jednotke absorpčného prostredia, l je hrúbka absorpčného prostredia (tento vzťah platí len pre monochromatické zariadenia a pre nízke koncentrácie absorbujúcich látok) Všeobecné princípy spektrálnych metód - v praktických aplikáciách sa transmitancia prepočítava na absorbanciu, ktorá je priamo úmerná počtu alebo koncentrácii absorbujúcich častíc (Beerov zákon) Absorbancia A= -log T = -log (𝜱/𝜱0 ) = aƛ l N Pre molekulovú spektrometriu je definovaný vzťah: A = eƛ l N Všeobecné princípy spektrálnych metód - emisia žiarenia je proces, pri ktorom dochádza k uvoľneniu energie vo forme žiarenia pri prechode častíc (atómov, molekúl, radikálov) z exitovaného stavu na nižšiu energetickú hladinu alebo do základného stavu - pri spektrálnych metódach sú rôzne možnosti budenia častíc: teplo (termické budenie, plameň, plazma), elektrický výboj (iskra, oblúk), pôsobením primárneho elektromagnetického žiarenia - meria sa intenzita signálov v emisnom nespojitom spektre - charakteristické emisné čiary Atómová emisná spektrometria (AES) AES alebo optická emisná spektrometria je založená na sledovaní emitovaného elektromagnetického žiarenia z voľných termicky budených (exitovaných) atómov nachádzajúcich sa v plynom stave Excitovaný atomárny stav sa získava dodaním energie rôznym spôsobom - pôsobením vysokých teplôt (atómová emisná spektrometria, ožarovaním elektromagnetickým žiarením vhodnej energie (atómová fluorescenčná spektrometria) Atómy sa tak dostanú do metastabilného stavu, z ktorého sa vracajú späť do nižšieho prípadne základného stavu pričom vyžiaria polychromatické žiarenie Atómová emisná spektrometria - rozkladom tohoto žiarenia pomocou spektrometra sa získa súbor čiar - čiarové spektrum - čiarové spektrá majú rozsah od 10 do 1500 nm, pričom nad 800 nm patria do IČ, oblasť od 200-800 nm do UV a VIS a pod 200 nm do vákuovej oblasti UV. Čiarové spektrum je špecifické pre každý prvok a slúži na kvalitatívnu a kvantitatívnu elementárnu analýzu Atómová emisná spektrometria Atómový emisný spektrometer sa skladá z: -budiaceho zdroja -optického spektrometra -riadiacej jednotky Atómová emisná spektrometria - budiace zdroje - dodávka potrebnej energie na atomizáciu vzorky a emisiu žiarenia - zdroj žiarenia musí spĺňať dve podmienky: 1. účinná atomizázia vzorky (vznik voľných atómov), 2. Excitácia voľných atómov - prevod z tuhej alebo kvapalnej vzorky do plynnej formy - atomizácia a excitácia nastáva až v plynom skupenstve Atómová emisná spektrometria Budiace zdroje: 1. Plameň - získa sa chemickou reakciou medzi plynným palivom a oxidovadlom Zdroje paliva: propán, acetylén Oxidovadlo: vzduch, kyslík, oxid dusný - účinnosť podľa zmesi paliva a oxidovadla: propán-vzduch (2200 K), acetylén-vzduch (2500 K), acetylén-kyslík (3300 K) Atómová emisná spektrometria Budiace zdroje: 2. Elektrická iskra a oblúk Použitie: tuhý materiál v tégliku alebo v lodičke Dosiahnutá teplota 4000-8000 K - menej spektrálnych čiar ale vyššia intenzita 3. Plazmy Použitie: na analýzu kvapalných vzoriek Vysoké teploty (10000 K) Rôzne druhy plazmy: DCP, MIP, ICP, mikrovlnná Atómová emisná spektrometria Zavedenie vzorky - zariadenie nebulizér - ultrazvukový zhmlovač - zavedenie vzorky vo forme aerosolu - použitie peristaltického čerpadla - vzniknutý aerosól unáša prúdom hnací plyn do horáka Atómová emisná spektrometria Monochromátor: - špecificky izoluje jednu spektrálnu čiaru alebo oblasť - špecificky izoluje niekoľko spektrálnych zón Optické disperzné systémy: - optický hranol: tvar trojuholníka, rozkladá polychromatické žiarenie na monochromatické na základe disperzie indexu lomu - difrakčná mriežka: opakované vrypy alebo línie na rovnom alebo konkávnom povrchu, môžu byť odrazové alebo priepustné Atómová emisná spektrometria - detekcia žiarenia UV a VIS: v minulosti fotografická doska, v súčasnosti nahradená fotoelektrickým detektorom (fotónka, fotonásobič) využívajúcim fotoelektrický jav - najnovšie, využitie DAD detektorov - fotodiódové pole, prípadne snímače typu CCD - nakoľko detektor DAD je pri použití v AES charakteristický vysokým šumom pozadia, preferuje sa využitie CCD snímačov Atómová emisná spektrometria Využitie: Klinická diagnostika: - analýza biologických vzoriek, AES sa používa na meranie koncentrácií prvkov ako meď, zinok a olovo v krvi, moči a iných telesných tekutinách Environmentálne využitie: - stanovenie ťažkých kovov v potravinách, vodách, kaloch, sedimentoch Atómová absorpčná spektrometria (AAS) - podstata AAS je absorpcia elektromagnetického žiarenia voľnými atómami nachádzajúcimi sa v plynom skupenstve pričom dochádza k prechodu valenčného elektrónu zo základnej hladiny na niektorú vyššiu hladinu, na ktorú je prechod dovolený - absorbovať sa bude také žiarenie, ktorého energia sa presne rovná rozdielu týchto energetických hladín. Prechod späť je nežiarivý alebo fluorescenčný - základnou charakteristikou je vlnová dĺžka pohlteného žiarenia pre kvalitatívnu analýzu a absorbované množstvo pre kvantitatívnu analýzu. Atómová absorpčná spektrometria - spektrálne čiary sú jednoduchšie ako emisné, v rámci porovnania techník AES a AAS sú v AAS len malé možnosti sprektrálnej interferencie prekryvu čiar - kvantitatívna analýza podľa Lambertovho-Beerovho zákona Atómová absorpčná spektrometria - atómové absorpčné spektrometre pozostávajú z primárneho zdroja žiarenia na generovanie žiarenia, ktoré sa v atómoch analytu môže absorbovať, zdroja voľných radikálov (atomizátor), systému zavedenia vzorky, monochromatóra, detektora Atómová absorpčná spektrometria Zdroje žiarenia - zdroj nespojitého čiarového žiarenia sa používajú nízkotlakové spektrálne výbojky s parami kovov ako je výbojka s dutou katódou Vo výbojkách dochádza k emisii žiarenia z atómov plynov, ktoré sú excitované prúdom elektrónov medzi elektródami. Pri vysokom tlaku plynov výbojky emitujú spojité UV žiarenie - vodíková a deutériová výbojka - korekcia pozadia Súčasnosť: použitie viacerých výbojok v jednej lampe Atómová absorpčná spektrometria Atomizátory - plameňová atomizácia: rôzne generovanie pomerov zmesi paliva a oxidovadla (podobné ako pri AES), najčastejšie propán-vzduch prípadne propán-kyslík, podľa požadovanej analýzy a potrebnej teploty horáku Rozdielny tvar horáka ako pri AES, pri AAS potrebný iný typ horáka, ktorý ma zabudovaný nebulizér - elektrotermická atomizácia: trubičky vo forme grafitu na analýzu tuhých látok Atómová absorpčná spektrometria Optický disperzný systém Atómová absorpčná spektrometria Detektor CCD Atómová absorpčná spektrometria Atómová absorpčná spektrometria Využitie: Klinická diagnostika: - analýza biologických vzoriek, AAS sa používa na meranie koncentrácií prvkov ako železo, meď, zinok a olovo v krvi, moči a iných telesných tekutinách Environmentálne využitie: - stanovenie ťažkých kovov v potravinách, vodách, kaloch, sedimentoch Analytická chémia Prednáška č. 5 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Molekulová absorpčná spektrometria - podstatou molekulovej absorpčnej spektrometrie v UV a VIS oblasti je absorpcia UV a viditeľného žiarenia (200-800 nm) skúmaným roztokom vzorky, v ktorom sú analyty v molekulovej alebo iónovej forme - Molekulové absorpčné spektrá v UV a viditeľnej oblasti spektra zodpovedajú prechodom elektrónov medzi energeticky rôznymi molekulovými orbitálmi z väzbových a neväzbových MO na protiväzbové MO, pričom absorbovaná energia musí zodpovedať rozdielu energií medzi oboma MO Molekulová absorpčná spektrometria - vnútorná energia molekuly je súčtom troch druhov energie: elektrónovej, vibračnej a rotačnej. Fotóny z UV alebo viditeľného svetla majú dostatočnú energiu na vyvolanie elektrónových prechodov - molekula sa pri bežných podmienkach nachádza na základnej vibračnej hladine a jej elektróny nie sú excitované. Absorpciou fotónov molekula príjme energiu, ktorá môže viesť k prechodu elektrónov na excitovanú hladinu, a k prechodu molekuly na niektorú z vyšších vibračných a rotačných hladín Molekulová absorpčná spektrometria Elektrónové prechody Molekulová absorpčná spektrometria Kolorimetria - technika, ktorá sa zaoberá farebnosťou látok. Farebnosť je dôsledkom absorpcie v oblasti VIS. Látka absorbuje len určité vlnové dĺžky a zvyšné, ktoré prechádzajú roztokom, sú len doplnkové farby Fotometria - spočíva v objektívnom fotoelektrickom meraní žiarivého toku, ktorý prešiel cez skúmaný roztok. Na meranie sa využívajú jednoduché fotometre (na vymedzenie vlnovej dĺžky sa využívajú farebné filtre), prípadne spektrofotometre, ktoré využívajú monochromátor Molekulová absorpčná spektrometria Spektrofotometria je metóda, ktorá poskytuje záznam celých absorpčných spektier v oblasti UV a VIS. Ako prístroje sa používajú spektrometre. Molekulová absorpčná spektrometria Spektrometre - sú zložené z polychromatického širokospektrálneho zdroja žiarenia, disperznej jednotky, kyvety pre vzorky, detektoru, elektroniky na spracovanie záznamu Rozdeľujeme ich na: 1. Monokanálové - používa sa len jeden druh detektora 2. Multikanálové - používa sa viacero typov detektorov, najčastejšie DAD detektor Molekulová absorpčná spektrometria Spektrometre - zdroje žiarenia - použitie vodíkovej alebo deutériovej výbojky (pre UV oblasť žiarenia), pre VIS oblasť sa využívajú wolfrámové alebo halogénové žiarovky Molekulová absorpčná spektrometria Spektrometre - disperzia žiarenia - monochromátor, najčastejšie podľa typu výrobcu konkrétneho prístroja - optický hranol, disperzná mriežka - úzka štrbina je dôležitá na získanie monochromatického žiarenia - podmienka platnosti Lambertovho-Beerovho zákona Molekulová absorpčná spektrometria Spektrometre - absorpčné prostredie - sklenené kyvety (typická hrúbka 0,1-1 cm); transparentné - oblasť VIS od 350 nm - kyvety z taveného kremeňa - celá oblasť UV-VIS Rozpúšťadlo: - voda (191 nm) - organické rozpúšťadlá: metanol (203 nm), chloroform (237 nm) Molekulová absorpčná spektrometria Spektrometre - usporiadanie Molekulová absorpčná spektrometria Spektrometre - detektory - používajú sa DAD, CCD, prípadne fotonásobiče Molekulová absorpčná spektrometria Kvalitatívna analýza - absorpčné pásy zodpovedajú chromofóru, pričom môžu byť ovplyvnené substituentmi a rozpúšťadlom - UV a VIS spektrá sa doplnkovo využívajú na identifikáciu neznámych organických látok - majú však byť podkladom pre doplnenie informácie z analýzy IČ spektier a NMR prípadne MS Molekulová absorpčná spektrometria Kvantitatívna analýza - meranie absorbancie sa využíva na určenie koncentrácie zlúčením s chromofórom Molekulová luminiscenčná spektrometria Do skupiny luminiscenčných metód zaraďujeme: 1. Molekulová fluorescenčná spektrometria 2. Molekulová fosforescenčná spektrometria 3. Chemiluminiscenčná spektrometria - spoločný princíp predstavuje meranie emisných spektier, ktoré sa získajú, keď sa excitované molekuly vracajú do základného stavu V porovnaní s absorpčnými technikami sú luminiscenčné metódy extrémne citlivé Molekulová luminiscenčná spektrometria Fluorescencia - pri excitácii vzorky svetlom (napr. UV alebo svetlo) dôjde k prechodu elektrónov do vyšších energetických hladín. Keď sa elektróny vrátia do pôvodného stavu, vyžarujú svetlo (fluorescenciu) s dlhšou vlnovou dĺžkou Fosforescencia - ide o jav, pri ktorom látka absorbuje svetlo a následne ho emituje s oneskorením, ktoré môže trvať od niekoľkých milisekúnd po niekoľko hodín. To je tým, že elektróny prechádzajú do excitovaných stavov, ktoré sú stabilnejšie a vracajú sa do základného stavu pomalšie Molekulová luminiscenčná spektrometria Chemiluminiscencia - je jav, pri ktorom dochádza k emisiám svetla v dôsledku chemickej reakcie. Tento proces sa využíva v rôznych spektrálnych metódach na analýzu látok, a to najmä kvôli svojej vysokej citlivosti a špecifickosti - základný princíp: v chemiluminiscenčných reakciách sa uvoľnená energia chemickej reakcie transformuje na svetlo - na tento proces môžu mať vplyv faktory ako teplota, pH a množstvo reaktantov Molekulová luminiscenčná spektrometria - excitačné fluorescenčné spektrum - závislosť žiarivého toku fluorescencie od vlnovej dĺžky excitačného žiarenia pri konštantnej vlnovej dĺžke maxima emisie (flourescencie) - v praxi sa častejšie definuje excitačná vlnová dĺžka ako konštantná a zaznamenáva sa emisné fluorescenčné spektrum - emisné fluorescenčné spektrum - závislosť toku žiarenia fluorescencie od vlnovej dĺžky pri konštantnej vlnovej dĺžke excitácie Molekulová luminiscenčná spektrometria Molekulová luminiscenčná spektrometria Zariadenia pre fotoluminiscenčné merania Analytická chémia Prednáška č. 6 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Optické nespektrálne metódy Nefelometria a turbidimetria - využívajú rozptyl svetla časticami v suspenziách a koloidných roztokoch - pri interakcií elektrickej zložky elektromagnetického žiarenia a elektrónov sa elektróny uvedú do vynútených oscilácií, ktorých frekvencia zodpovedá frekvencii dopadajúceho žiarenia - veľkosť indukovaného dipólového momentu molekuly sa preto mení s rovnakou frekvenciou - oscilujúci dipól je zdroj sekundárneho žiarenia Optické nespektrálne metódy Reyleighov rozptyl - je fyzikálny jav, ktorý sa vyskytuje pri rozptyle svetla na malých častiach, ktoré sú oveľa menšie ako vlnová dĺžka svetla - pre analytické aplikácie má význam meranie rozptylu svetla spôsobeného makromolekulovými látkami alebo suspendovanými časticami v roztoku - Tyndalov jav Optické nespektrálne metódy Detekcia rozptýleného žiarenia Turbidimetria a nefelometria sa od seba líšia umiestnením detektora V nefelometrii sa sleduje rozptýlené žiarenie najčastejšie v smere kolmom na vstupujúci lúč a používa sa pre nižšie koncentrácie rozptýlených častíc V turbidimetrii je detektor zaradený za vzorkou v smere osi vystupujúceho lúča a sleduje sa ním žiarenie, ktoré prešlo vzorkou a je ochudobnené o rozptýlenú zložku žiarenia. Metóda je vhodná pre koncentrované roztoky Optické nespektrálne metódy - obe metódy je možné vykonávať na spektrofotometroch s pridávnym doplnkom - koncentrácia analytu je priamo úmerná časticiam vo vzorke Využitie: Klinická diagnostika: - stanovenie koncentrácie imunoglobulínov v sére - možno určiť prítomnosť baktérií v biologických vzorkách Optické nespektrálne metódy Ramanova spektrometria Sir Chandrasekhara Venkata Raman v roku 1930 dostal Nobelovu cenu za fyziku a bol prvým Ázijcom a prvým nebielym, ktorý dostal Nobelovu cenu v akomkoľvek odbore vedy. - patrí k skupine molekulových vibračných sprektroskopií - základ metódy je meranie rozptýleného žiarenia, ktoré vzniká interakciou monochromatického žiarenia z viditeľnej až blízkej infračervenej oblasti spektra s molekulami skúmanej sústavy za zmeny ich vibračných a rotačných stavov Ramanova spektrometria Rayleighov rozptyl žiarenia - ak sa na skúmanú sústavu pôsobí viditeľným alebo blízkym IČ žiarením s vlnočtom, ktorý nie je vhodný na elektrónový prechod, časť žiarenia sa prepustí a časť sa rozptýli. Ak má rozptýlené žiarenie rovnakú vlnovú dĺžku ako dopadajúce žiarenie jedná sa o Rayleighov rozptyl na molekulách - intenzívne monochromatické elektromagnetické žiarenie, ktoré sa skúmanou vzorkou neabsorbuje a nevyvolá excitáciu elektrónu, môže pri prechode vzorkou rozkmitať molekuly látok Ramanova spektrometria Ramanov rozptyl žiarenia - ak sa meria rozptýlené žiarenie, nájde sa aj časť žiarenia, ktorá zmenila vlnočet. Malá časť žiarenia totiž čiastočne vymieňa energiu s molekulami a po nepružnej zrážke fotónu a vibrujúcich molekúl má iný vlnočet ako dopadajúce žiarenie - podstata procesu spočíva v tom, že keď molekula prijme časť energie dostane sa do nekvantovaného kváziexcitovaného stavu. Predpokladá sa, že rozkmitaná molekula sa nevráti na pôvodnú hladinu, ale zaujme iný vibračný a rotačný stav Ramanova spektrometria Ramanove spektrá - získavajú sa neelastickým rozptylom žiarenia molekulami - na excitáciu sú potrebné monochromatické laserové zdroje vo viditeľnej oblasti - Ramanov rozptyl spôsobuje posun pásov k väčším vlnovým dĺžkam s porovnaním Rayleighovými pásmi. Súbor pásov pri menších vlnočtoch (väčších vlnových dĺžkach) sa označuje ako Stokesove pásy - opačným prípadom sú anti-Stokesové čiary - rozptýlené žiarenie má väčšie vlnočty (menšie vlnové dĺžky) Ramanova spektrometria Ramanove spektrá Analytická chémia Prednáška č. 7 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Elektroanalytické metódy - svojimi princípmi merania vychádzajú z fyzikálnej chémie, hlavne z elektrochémie, ktorá sa zaoberá vlastnosťami chemických sústav schopných viesť elektrický prúd - predmetom elektroanalytickej chémie je súvis merateľných elektrických veličín (prúd, potenciál, náboj, vodivosť) s prítomnosťou určitých analytov (redoxnými vlastnosťami a koncentráciou). Procesy prebiehajú na fázovom rozhraní elektróda-roztok - elektrický systém musí obsahovať aspoň dve elektródy a kontaktný roztok elektrolytu = galvanický článok Elektroanalytické metódy - po zapojení článku do elektrického obvodu prebiehajú vo vnútri článku reakcie, ktorými sa postupne znižuje elektrická energia, článok sa vybíja - tieto reakcie môžu byť nevratné - napätie článku sa po vybití nedá obnoviť (primárny článok) alebo vratné - článok sa dá znova nabiť (sekundárny článok = akumulátor) - pri prechode elektrického prúdu článkom sa prejaví vnútorný odpor článku. Vnútorný odpor má za následok zníženie napätia článku na svorkovom napätí - galvanický článok je vždy zdroj jednosmerného prúdu. V elektrických obvodoch, kde záleží na smere prúdu, je treba pred zapojením skontrolovať správnu polaritu elektród Elektroanalytické metódy - pri zostavovaní galvanického článku sa pre elektródy a elektrolyty používa taká kombinácia chemických látok, aby potenciál vznikajúci na elektróde bol čo najväčší, a zároveň aby článok čo najviac vydržal - vhodnými a najčastejšími látkami pre zápornú elektródu je zinok, kadmium, lítium a hydridy rôznych kovov, pre kladnú elektródu uhlík (grafit) obklopený burelom (MnO2), nikel a striebro - v suchých článkoch a v olovenom akumulátore sa ako elektrolyt používa roztok kyseliny, v alkalických článkoch a v akumulátoroch sa používa roztok zásaditých zlúčenín alkalických kovov - prípadné ďalšie látky v elektrochemických článkoch majú za úlohu regulovať chemické reakcie tak, aby sa napríklad predĺžila životnosť článku, znížila možnosť úniku nebezpečných látok a pod Elektroanalytické metódy Z hľadiska meracieho princípu elektroanalytické metódy rozdeľujeme: 1. Metódy, pri ktorých je elektródová reakcia základom merania: - potenciometria - voltampérometria - ampérometria - coulometria Elektroanalytické metódy 2. Metódy, pri ktorých elektródová reakcia nie je významná: - konduktometria - dielektrometria Elektroanalytické metódy Potenciometria - elektrochemická metóda založená na meraní rovnovážneho napätia galvanického článku zostaveného z indikačnej a referenčnej elektródy za podmienok nulového prúdu. Pri meraní nedochádza k oxidačno-redukčným procesom - v zmysle Nernstovej rovnice závisí potenciál indikačnej elektródy od aktivity sledovanej látky v roztoku, s ktorým vytvára elektrochemický poločlánok Predpokladá sa, že referenčná elektróda sa správa reverzibilne, jej potenciál je časovo stály a nezávislý od malého prúdového zaťaženia, je tiež nezávislý od koncentrácie stanovovaného iónu Elektroanalytické metódy Potenciometria - meracie zariadenia - úlohou meracieho prístroja v potenciometrii je zaistiť, aby sa z elektrochemického článku neodoberal žiadny významný prúd. Na toto sa využívajú potenciometre s vysokým vstupným odporom 1000-krát vyšším ako odpor meracieho článku a s rozlíšením 0,1 mV Elektroanalytické metódy Potenciometria - elektródy Ako indikačná a referenčná elektróda sa používajú: - elektródy 0. druhu - redoxné elektródy, inertné kovy Pt, Au, ktoré sú v kontakte s roztokom redoxného páru Pt, Ce. Ideálny inertný materiál vymieňa elektróny so zložkami roztoku vratne, neoxiduje ani neredukuje sa - vhodná elektróda na meranie redoxného potenciálu - elektródy 1. druhu - reverzibilné systémy kov/ ión kovu (Ag/Ag+) sú to kovy vymieňajúce ióny ponorené do roztoku obsahujúceho ich vlastný kov Elektroanalytické metódy Potenciometria - elektródy - elektródy 2. druhu - reverzibilné systémy kov/ión kovu vo forme málo rozpustnej soli v nasýtenom roztoku s prebytkom protiiónu soli (Ag/AgX/X-). Používajú sa ako referenčné elektródy, najznámejšie sú argentochloridová a kalomelová referečná elektróda Argentochloridová elektróda predstavuje systém Ag/AgCl/KCl s polčlánkovou reakciou - elektródy 3. druhu - reverzibilný systém kov/soľ kovu alebo rozpustný komplex kovu/soľ druhého kovu a nadbytok iónu druhého kovu (Pb/šťaveľan olovnatý/šťaveľan vápenatý/Ca2+) Elektroanalytické metódy Elektródy ISE - okrem uvedených elektród sa používajú membránové indikačné elektródy v podobe iónovoselektivných elektród (ISE) - ISE sú polčlánky pozostávajúce z iónovoselektívnej polopriepustnej membrány, vnútorného roztoku a vnútornej referenčnej elektródy. Membrány sú vo vode nerozpustné a vykazujú určitú iónovú vodivosť vďaka voľným iónom prítomným v objeme membrány. Vlastná membrána má husté póry, teda pôsobí ako sito prípustné pre jeden druh iónov Elektroanalytické metódy Elektródy ISE - Iónovoselktívne elektródy charakterizuje membránový potenciál EM, ktorý vzniká po ustálení rovnováhy na základe difúznych a iónovovýmených dejov na stranách polopriepustnej membrány - potenciál ISE sa sníma pomocou vnútornej referenčnej elektródy ponorenej do vnútorného roztoku a meria sa voči vonkajšej referenčnej elektróde - závislosť potenciálu ISE od aktivity analytu X- pri súčasnom vplyve interferujúcich iónov opisuje Nikolského-Eisenmanova rovnica Elektroanalytické metódy Analytické vlastnosti ISE - selektivita (vyjadruje koeficient selektivity) - smernica kalibračnej krivky - lineárny koncentračný rozsah - medza stanovenia - čas odozvy Elektroanalytické metódy Druhy ISE elektród: 1. Primárne ISE - so sklenenou membránou - s tuhou membránou (kryštalická alebo polykryštalická) - s kvapalnou membránou - s polymérnou membránou 2. Zlúčeninové alebo viacmembránové ISE - molekulové senzory - plynové alebo enzýmové elektródy 3.Iónovoselektívne tranzistory - hybridné elektródy Elektroanalytické metódy Sklenená elektróda - ISE elektróda - vnútorný tlmivý roztok, stála hodnota pH a chloridových iónov - roztok KCl s obsahom AgCl - elektróda argentochloridová - vnútorná referenčná elektróda - kombinovaná Elektroanalytické metódy Voltamperometria - charakteristický znak je závislosť medzi napätím vnúteným elektróde v elektrolytickom okruhu a sním súvisiacim tokom prúdu - keď elektrickým článkom prechádza elektrický prúd dochádza na elektródach v oboch poločlánkoch k reálnym chemickým reakciám. To spôsobuje zmenu pôvodného zloženia roztoku v okolí jednotlivých elektród - zmena potenciálu, ktorý bude iný ako rovnovážny - zvyčajne je zaujímavý priebeh len na pracovnej elektróde, pričom látka musí byť elektroaktívna Elektroanalytické metódy Voltampérometria - meracie zariadenie - pozostáva z generátora funkcie potenciálu od času - potenciostatu, ktorý riadi napätie medzi pracovnou a referenčnou elektródou Galvanometer slúži na merania prúdu na pracovnej elektróde Časový priebeh potenciálu a meranie prúdu v závislosti od potenciálu riadi počítač Elektroanalytické metódy Ampérometria - polarizačný potenciál pracovnej elektródy sa udržiava na konštantnej hodnote zodpovedajúcej oblasti limitného prúdu pre daný analyt - meria sa prúdová odozva elektrochemickej oxidácie alebo redukcie elektroaktívnej látky za stacionárnych podmienok, teda za miešania alebo prúdenia roztoku - využitie ampérometrie v prietokovej injekčnej analýze FIA, odmernej analýze (sledovanie titrácii), prípadne HPLC Elektroanalytické metódy Coulometria - princípom je makroelektrolýza, ktorá predstavuje redoxnú premenu všetkého analytu prítomného v roztoku, pričom sa vyhodnocuje elektrický náboj potrebný na uvedenú premenu Základom coulometrie sú Faradayove zákony Predpokladom coulometrických stanovení je: 100% využitie prejdeného náboja na elektrochemickú premenu 100% účinnosť elektrolýzy za podmienok, že na pracovnej elektróde prebieha len jedna reakcia Správne indikovanie ukončenia elektrolýzy Presné meranie eklektického náboja Elektroanalytické metódy Konduktometria - v konduktometrii sa meria vodivosť roztokov elektrolytov, teda vodičov druhej triedy Analyticky sú významné dva typy meraní: 1. Priama konduktometria - z hodnoty vodivosti sa usudzuje obsah rozpustných elektrolytov 2. Konduktometrické titrácie - sleduje sa závislosť vodivosti elektrolytu od objemu pridávaného titračného činidla a vyhodnocuje sa konduktometrická titračná krivka Analytická chémia Prednáška č. 8 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Elektromigračné metódy - elektroforetické (elektromigračné a elektroseparačné) separačné metódy sú založené na separácii nabitých zložiek (malé anorganické ióny a makromolekuly) na základe rozdielnej rýchlosti pohybu týchto zložiek v jednosmernom elektrickom poli Rýchlosť pohybu nabitých častíc závisí od: - fyzikálnochemických vlastností samotných častíc (celkový náboj, veľkosť, tvar, disociácia, adsorpcia, tvorba komplexov) - niektoré z týchto vlastností ovplyvňuje prostredie (elektrolyt), v ktorom sa častice pohybujú Elektromigračné metódy - vlastností prostredia (typ elektrolytu, koncentrácia, iónová sila, pH, prítomnosť neelektrolytov). Na elektroforetickú separáciu sa používajú elektrolyty spravidla tlmivé roztoky s definovanou koncentráciou, iónovou silou, pH, vodivosťou a viskozitou - vlastnosti nosiča alebo kapiláry (gél, sorbent, povrch kapiláry) - vlastnosti eklektického poľa (intenzita, stabilita, homogenita) Na účinnosť elektroforetickej separácie v elektrolytoch má nepriaznivý vplyv pohyb zložiek konvekciou a tiež tepelný pohyb vznikajúci v dôsledku zahrievania elektolytu Elektromigračné metódy - podľa experimentálneho usporiadania možno elektroforetickú separáciu rozdeliť na: 1. zónovú elektroforézu 2. izoelektrickú fokusáciu 3. izotachoforézu 4. gélovú elektroforézu 5. micelárnu elektrokinetickú chromatografiu - v kapilárach sa vykonávajú všetky typy elektroforéz, v plošnom usporiadaní sa vykonáva gélová elektroforéza a izoelektrická fokusácia Elektromigračné metódy Elektroforetická migrácia - predstavuje pohyb iónov v elektrickom poli v dôsledku elektrostatického priťahovania elektrického náboja iónu k opačne nabitej elektróde. Ióny sa v homogénnom elektrickom poli pohybujú konštantnou elektroforetickou rýchlosťou Elektroosmotický tok (EOF) - predstavuje tok kvapaliny kapilárou, v ktorej je vytvorené elektrické pole vložením napätia 10-30 kV medzi elektródy na koncoch kapiláry. Vo vodných roztokoch má väčšina tuhých povrchov záporný náboj, ktorý vzniká disociáciou Elektromigračné metódy funkčných skupín v povrchu alebo adsorpciou iónov na povrch. Na kremennom povrchu kapiláry nastavajú oba prípady alebo EOF závisí od disociácie silanových skupín. Teflonové kapiláry sa taktiež vyznačujú vznikom EOF v dôsledku adsorpcie aniónov z roztoku Elektromigračné metódy - priemerná stredná (lineárna) rýchlosť EOF je priamo úmerná intenzite elektrického poľa a závisí od veľkosti záporného náboja, ktorý nesie vnútorná stena kapiláry. Čím je vyššia hodnota pH roztoku vo vnútri kapiláry, tým je väčší záporný náboj na vnútornej stene kapiláry Elektromigračné metódy Elektroforéza v plošnom usporiadaní - vertikálna alebo horizontálna - nosič: acetylcelulózová fólia, gél - separácia je založená na veľkosti elektrického náboja - nosič: PAGE (polyakrilamidový gél) - separácia prebieha nielen podľa veľkosti elektrického náboja ale aj podľa Mr - nosič: PAGE + SDS - separácia prebieha podľa Mr, nakoľko SDS uniformne všetkým bielkovinám poskytuje rovnaký elektrický náboj Elektroforetická aparatúra - horizontálna Elektroforetická aparatúra - vertikálna Elektromigračné metódy Kapilárna elektroforéza - existujú dva spôsoby ako separovať ióny s rozdielnou pohyblivosťou: 1. pracovať pri konštantnom E (elektrické pole) a separovať ióny na základe ich rozdielnej rýchlosti (elektroforéza) 2. pracovať pri konštantnej v (migračná rýchlosť), ktorá sa dosiahne pre rôzne ióny pri rôznej hodnote E (izotachoforéza) - v kapilárach možno realizovať rôzne elektroforetické techniky  Elektromigračné metódy CZE - kapilárna zónová elektroforéza ITP/CITP - kapilárna izotachoforéza IEF/CIEF - kapilárna izoelektrická fokusácia CGE - kapilárna gélová elektroforéza MECC/MEKC - micelárna elektrokinetická kapilárna chromatogrfia Elektromigračné metódy Elektromigračné metódy Prístrojová technika - všetky typ kapilárnej elektroforézy je možné realizovať na spoločnom prístroji, rozdielom je len použitie elektrolytov gélov, micel, kapilár Elektromigračné metódy - zdroj vysokého napätia - kapiláry: ideálny materiál je chemicky stály, neabsorbuje UV žiarenie, ohybný, robustný a lacný. Možná aj vnútorná modifikácia kapiláry - kovalentné naviazanie rôznych látok - dávkovanie vzoriek - hydrodynamické dávkovanie - regulácia teploty - potrebné zabezpečiť stále podmienky separácie (chladiaci vzduch alebo kvapalina) - detekcia: fotometrická (UV, VIS), fluorimetrická, vodivostná, MS, Ramanova spektrometria Elektromigračné metódy Analytické parametre kapilárnej elektroforézy - kvalitatívna analýza - elektroforeogram má tvar píkov, poloha píkov určuje migračný čas, z ktorého sa vypočíta elektroforetická pohyblivosť zložky a následne sa porovná so štandardom - kvantitatívna analýza - plocha píku je úmerná množstvu alebo koncentrácii zložky vo vzorke - na vyhodnotenie sa využíva kalibračná krivka, prípadne metóda prídavku štandardu Elektromigračné metódy Kapilárna zónová elektroforéza (CZE) - Separácia analytov na základe rozdielnej migrácie spôsobenej rozdielmi v ich pomeroch hmotnosti a náboja v prostredí vhodného základného elektrolytu - katióny sa pohybujú rýchlejšie, pretože ich vlastná elektroforetická rýchlosť aj rýchlosť EOF smeruje ku katóde - anióny sa taktiež pohybujú ku katóde ale pomalšie, nakoľko sú priťahované anódou