Analytická chémia Prednáška č. 9 PDF

Analytická chémia Prednáška č. 9 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Analytické separačné metódy Separácia je operácia, pri ktorej sa analyzovaná zmes látok rozdelí aspoň na dve časti odlišného zloženia. V ideá...

Analytická chémia Prednáška č. 9 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Analytické separačné metódy Separácia je operácia, pri ktorej sa analyzovaná zmes látok rozdelí aspoň na dve časti odlišného zloženia. V ideálnom prípade sa očakáva toľko častí (frakcií), koľko je zložiek v zmesi. Vzorka obsahuje cieľové analyty a iné látky, ktoré nie sú predmetom stanovenia, a z ktorých niektoré môžu so stanovením analytov interferovať. Ak selektivita vybranej metódy stanovenia analytu po úprave vzorky (rozpustením, homogenizáciou) nie je dostatočná, musia sa pred použitím metódy stanovenia interferujúce látky odstrániť. Separáciu látok možno dosiahnuť využitím rôznych princípov: 1. Chemickou premenou látky s vytvorením novej fázy a nasledujúcim oddelením fáz: zrážanie s vytvorením tuhej fázy, vylučovanie elektrolýzou, vytesnenie vo forme plynu po chemickej reakcii. 2. Bez chemickej premeny pôvodnej látky prostredníctvom jej fázovej premeny, s nasledujúcim oddelením fáz a skoncentrovaním sledovanej látky v jednej fáze: destilácia a rektifikácia, sublimácia, tavenie, kryštalizácia, lyofilizácia (vymrazenie). O miere oddelenia rozhoduje rozdielnosť tlaku pár látok, selektivita fázovej premeny v daných podmienkach a schopnosť vytvárať nadmolekulové asociáty a zmesné zlúčeniny. 3. Na základe rovnovážnej distribúcie zložiek medzi dve nemiešateľné fázy, pričom každá zložka má tendenciu prenikať do fázy, v ktorej dôjde k zníženiu jej chemického potenciálu. Jedna fáza môže byť dispergovaná v druhej fáze v dôsledku: povrchového náboja (napr. micely v roztoku), malej hmotnosti jednotlivých podielov (napr. tuhá fáza v okolitej kvapaline), a porovnateľnej hustoty fáz (kvapky jednej kvapaliny v druhej). Pod pojmom separácia fáz rozumieme priestorové oddelenie fáz v sústave, v najjednoduchšom prípade dvoch fáz, kde sa vytvorí jedno pozorovateľné fázové rozhranie (napr. kvapalina/plyn, alebo rozhranie dvoch nemiešateľných kvapalín). O miere oddelenia analytov rozhoduje odlišnosť ich vlastností a správania sa ich aktuálnych foriem v sústave.  4. Separáciou na základe veľkosti molekúl (alebo iónov): s prestupom do vnútorných priestorov pórovitej tuhej fázy (využitie molekulových sít a polymérnych gélov). 5. Separáciou s prestupom do tretej fázy cez pórovité membrány (dialýza, ultrafiltrácia, reverzná osmóza, a elektrodialýza). Membránové separácie využívajú rozdiely v rýchlosti pohybu jednotlivých zložiek cez rozhranie, ktorým je obvykle selektívne priepustná membrána. Hnacou silou je gradient chemických alebo elektrochemických potenciálov.  6. Separáciou na základe náboja častíc: separácia poľom využíva rozdiely v pohyblivosti častíc v silovom poli, separujú sa ióny v kvapalnej alebo v plynnej fáze pôsobením poľa: - podľa rôznej rýchlosti pohybu iónov v kvapalnej fáze v elektrickom poli (elektromigračné analytické metódy, napr. elektroforéza), - podľa rôznej rýchlosti a dráhy pohybu iónov v magnetickom a elektrickom poli vo vákuu - separácia iónov (metódy hmotnostnej spektrometrie). Rozdelenie analytických separačných metód Mnohé separačné metódy sa používajú v preparatívnej chémii alebo v technológii. Pre analytickú chémiu majú najväčší význam rôzne typy extrakcií, chromatografické separácie a elektromigračné separačné metódy. Ak sa má jednou analýzou detegovať a stanoviť čo najviac analytov v zmesi podobných látok, musia sa tieto analyty najprv separovať. Pritom sa kombinujú minimálne dva nezávislé metodické princípy, z ktorých jeden slúži na oddelenie (separáciu) jednotlivých zložiek a druhý na detekciu a stanovenie zložiek po ich separácii. Zároveň sa minimalizuje vplyv interferujúcich látok z matrice vzorky. Rozdelenie analytických separačných metód Chromatografické metódy sú skupina metód využívajúca ako základ separácie dvojfázové systémy, v ktorých sa proces ustaľovania distribučnej rovnováhy mnohonásobne opakuje. Jedna z použitých fáz je určitým spôsobom fyzicky stabilizovaná (nepohybuje sa) a nazýva sa stacionárna fáza. Druhá fáza sa ustáleným spôsobom pohybuje a označuje sa ako mobilná fáza. Stacionárna fáza môže byť: tuhá - s aktívnym povrchom, pórovitá alebo nepórovitá, vo forme častíc tuhého materiálu podobnej veľkosti, s priemerom od 1,5 µm. Rozdelenie analytických separačných metód kvapalná - viskózny film s hrúbkou od 0,1 µm na zrnách nosiča alebo inom tuhom povrchu, pričom tuhý materiál je čo najmenej aktívny, využíva sa len ako podpora filmu - tzv. nosič. vo forme objemných funkčných skupín povrchovo viazaných na tuhú fázu, čím sa vytvorí maximálne monomolekulová vrstva. Mobilnou fázou je plyn alebo kvapalina, ktorá preteká ponad stacionárnu fázu alebo okolo jej častíc. Elektro (migračné) separačné metódy sú skupina metód využívajúca ako základ separácie rôznu rýchlosť pohybu iónov v kvapalnej fáze v elektrickom poli. Využívajú rôzne prostredie (elektrolyty a prídavné látky), ktoré ovplyvňuje migračnú rýchlosť iónov. Charakteristika separačných metód Selektivita vyjadruje schopnosť metódy separovať látky na základe jednej alebo viacerých špecifických vlastností. Môžu sa využívať špecifické vlastnosti fyzikálne (separácia na základe rôznej veľkosti molekuly, separácia na základe rôznej teploty varu a i.) alebo chemické (využitie odlišnej polarity molekúl látok). Selektívnejšou metódou sa dajú oddeliť aj látky, ktoré sa len málo odlišujú svojimi vlastnosťami. Charakteristika separačných metód Rozlišovacia schopnosť vyjadruje mieru separácie jednotlivých zložiek zmesi, vyjadruje sa u analytických separácií a používa sa aj ako kritérium optimalizácie pracovných podmienok Účinnosť separácie hodnotí teoretické možnosti daného separačného systému, používa sa na hodnotenie a porovnávanie viacerých analytických separácií. Princíp chromatografickej separácie V chromatografii sa používa dvojfázová sústava, v ktorej sa predpokladá ustaľovanie rovnováhy prestupu analytu z jednej fázy do druhej alebo jeho akumulácia na povrchu jednej z fáz. V sústave zloženej z dvoch fáz, aj v každom jej čiastkovom objeme, zahŕňajúcom rozhranie fáz, sa na základe schopnosti analytu zotrvávať v týchto fázach alebo na ich povrchu (napr. rozpúšťať sa v objeme kvapalnej fázy alebo adsorbovať sa na povrchu tuhej fázy) ustáli určitý pomer koncentrácií analytu vo fázach - dosiahne sa distribučná rovnováha. Princíp chromatografickej separácie Rovnováha je dynamická, t. j. rýchlosť prestupu častíc analytu cez rozhranie dvoch fáz je rovnaká v oboch smeroch. Pomer koncentrácií analytu vo fázach závisí od tých vlastností analytu, ktoré sa uplatnia vo vzťahu ku konkrétnym fázam (dochádza k rôznym typom interakcií medzi analytom a každou z fáz), a od experimentálnych podmienok. Javy, ku ktorým dochádza pri distribúcii látky medzi fázami, sú základ mechanizmu chromatografickej separácie. Ide o rozdeľovanie látky medzi dve fázy s rozpúšťaním v kvapalnej fáze alebo difúziou v plynnej fáze; adsorpciu na povrchu tuhej fázy z plynu aj z kvapaliny; chemisorpciu na fázovom rozhraní tuhej a kvapalnej fázy (tvorbu asociátov a výmenu iónov); alebo vstup molekúl analytov do vnútročasticových pórov. Separačný systém sa volí tak, aby prevládal jeden mechanizmus. Princíp chromatografickej separácie Predpokladá sa, že analyty navzájom nereagujú a pomer koncentrácií sa ustaľuje nezávisle pre jednotlivé zložky analyzovanej vzorky. Rozdielne vlastnosti sa môžu využiť na chromatografickú separáciu látok, vytvorená rovnováha sa opakovane porušuje vonkajším zásahom napr. vynúteným pohybom jednej fázy (mobilnej) voči druhej fáze (stacionárnej). Vzorka sa rozpustí alebo disperguje v jednej fáze, ktorá bude vo funkcii mobilnej fázy, môže to byť plyn, kvapalina alebo tekutina v nadkritickom stave. Princíp chromatografickej separácie Po zavedení k stacionárnej fáze je donútená prechádzať popri jej povrchu pomocou mobilnej fázy. Stacionárna fáza môže byť umiestnená v rúrke (chromatografickej kolóne) alebo v tenkej vrstve na tuhom inertnom povrchu. Zložky vzorky môžu byť stacionárnou fázou zachytávané (interagujú s ňou) a prerozdeľujú sa medzi mobilnú a stacionárnu fázu. V každom mieste styku fáz sa ustaľuje rovnováha, pričom sa uvedený proces mnohonásobne opakuje: čím viac a silnejšie molekuly alebo ióny analytu interagujú so stacionárnou fázou alebo sa lepšie v nej rozpúšťajú, tým menšia je rýchlosť, ktorou sa zóna rovnakých molekúl (alebo iónov) premiestňuje. Princíp chromatografickej separácie Tak sa postupne zóny obsahujúce molekuly (alebo ióny) jednotlivých zložiek vzorky od seba vzďaľujú a na koniec priestoru so stacionárnou fázou (napr. koniec kolóny) sa dostávajú skôr tie zložky, ktoré sú menej zadržiavané. Vďaka interakciám zložiek so stacionárnou fázou sa po dostatočnom čase analýzy separujú zložky vzorky do oddelených zón. Chemicky a konformačne rôzne analyty sa zbrzďujú odlišne. V skutočnosti všetky kroky procesu prebiehajú súbežne a nepretržite, t.j. ide o stacionárny stav, ktorý sa pre zjednodušenie opisuje pomocou rovnovážneho modelu. Na realizáciu chromatografickej separácie sa používajú prístroje, ktoré sú zostavené podľa typu mobilnej fázy, usporiadania fázového systému a spôsobu zavádzania vzorky. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa skupenstva mobilnej fázy rozdeľujeme: s kvapalnou mobilnou fázou („LC - liquid chromatography"), s kvapalinou v nadkritickom stave ako mobilnou fázou („SFC- supercritical fluid chromatography" - mobilnou fázou je tekutina v podmienkach, ktoré tlakom a teplotou prevyšujú podmienky jej kritického bodu). s plynnou mobilnou fázou („GC - gas chromatography"). Plynová chromatografia a nadkritická chromatografia sa dajú vykonávať len v uzavretom zariadení, takže k separácii dochádza v kolóne. Kvapalinová chromatografia sa dá vykonávať v kolóne aj v plošnom usporiadaní. Preto sú rovnaké fyzikálnochemické základy a princípy metód LC platné aj pre chromatografiu s plošným usporiadaním („TLC - thin-layer chromatography, PC - paper chromatography). Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa fyzikálno-chemického deja rozdeľujeme: rozdeľovacia chromatografia - o separácii rozhoduje odlišná rozpustnosť zložiek vzorky v stacionárnej fáze (kvapalnej) a rozpustnosť a difúzia v mobilnej fáze (kvapalnej), alebo vyparovanie a difúzia v mobilnej fáze (plynnej). adsorpčná chromatografia - separácia je riadená rôznou schopnosťou zložiek adsorbovať sa na povrch stacionárnej fázy (tuhá látka). ionexová chromatografia - pri separácií sa využívajú rôzne veľké elektrostatické príťažlivé sily medzi funkčnými skupinami stacionárnej fázy (ionexu) a iónmi analytov v roztoku. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa fyzikálno-chemického deja rozdeľujeme: vylučovacia chromatografia - podľa veľkosti molekúl (gélová chromatografia) - zložky sa separujú podľa veľkosti svojich molekúl na pórovitej stacionárnej fáze alebo géli, menšie molekuly sa vo vnútorných priestoroch zdržujú dlhšie (efekt molekulového sita). afinitná chromatografia - stacionárna fáza je schopná viazať zo vzorky práve určité zložky, ku ktorým má selektívny vzťah (afinitu). Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa experimentálneho usporiadania rozdeľujeme: kolónová chromatografia, pri ktorej je stacionárna fáza umiestnená v rúrke (kolóne) a mobilná fáza preteká cez voľné priestory medzi časticami alebo okolo vrstvy či filmu stacionárnej fázy. Ako mobilnú fázu používa kvapalnú fázu (otvorený alebo uzavretý systém), alebo plynnú fázu (uzavretý systém), alebo paru v nadkritickom stave (uzavretý systém). Všetky zložky prejdú rovnakú dráhu cez separačný materiál (od začiatku po koniec kolóny) a vďaka špecifickým interakciám so stacionárnou fázou vystupujú z kolóny v rôznych časoch a môžu sa detegovať detektorom. Zaznamenáva sa signál detektora v čase (tzv. externý chromatogram), a charakteristickým parametrom pre konkretny analyt je čas, za ktorý prejde kolónou. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa experimentálneho usporiadania rozdeľujeme: plošné usporiadanie - papierová chromatografia, v ktorej je stacionárna fáza nanesená do štruktúry chromatografického papiera; chromatografia, tenkovrstvová chromatografia, v ktorej je zrnitá stacionárna fáza umiestnená na pevnom plochom podklade (napr. sklených doskách alebo hliníkovej fólii). Mobilná fáza sa pohybuje cez stacionárnu fázu vďaka kapilárnym silám alebo vplyvom gravitačných síl (v otvorenom systéme), alebo je privádzaná na vrstvu čerpadlom (látky vo vzorkách jednej vrstve sa podrobujú separácii súčasne v rovnakom časovom intervale. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa experimentálneho usporiadania rozdeľujeme: Odlišné zložky vzorky sa prenesú na rôzne vzdialenosti v tom istom čase a po ukončení separácie sú stále lokalizované na separačnej vrstve a detegujú sa priamo na nej - generuje sa tzv. interný chromatogram. Charakteristický parameter pre konkrétny analyt je vzdialenosť konečnej polohy zóny od východiskovej polohy pri dávkovaní. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa spôsobu zavádzania vzorky rozdeľujeme: elučná chromatografia - je založená na jednorazovom nadávkovaní vzorky do prúdu mobilnej fázy pred vstupom do kolóny a jej vymývaní neustále prúdiacou mobilnou fázou. Z kolóny vychádza ako prvá tá zložka, ktorá sa najmenej zachytáva alebo sorbuje stacionárnou fázou. Vznikne tak postupnosť zón zložiek vystupujúcich z kolóny, ktoré sa zaznamenajú detektorom a výsledný záznam signálu detektora v závislosti od času tvorí séria elučných kriviek (chromatografických píkov). Kvalitatívnym parametrom je poloha píku na časovej osi a kvantitatívne zastúpenie zložky určuje plocha pod krivkou. Používa sa aj v plošnom usporiadaní chromatografie. Táto technika je najbežnejšia pre analytické účely. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa spôsobu zavádzania vzorky rozdeľujeme: frontálna chromatografia - je založená na kontinuálnom privádzaní vzorky do kolóny. Prvá začne z kolóny vychádzať najmenej sorbovaná (zachytávaná) látka. Postupne sa pridávajú ďalšie látky a zóny sú zmesné. Nakoniec z kolóny vychádza už zmes vzorky s mobilnou fázou v takom zložení ako vstupuje do kolóny. Táto technika sa používa na výskum a charakterizáciu sorpčných procesov pre nové materiály. Rozdelenie metód chromatografickej separácie: Podľa spôsobu zavádzania vzorky rozdeľujeme: vytesňovacia chromatografía - je založená na jednorazovom nadávkovaní vzorky do prúdu mobilnej fázy pred vstupom do kolóny. Do mobilnej fázy sa pridáva tzv. vytesňovacie činidlo, ktoré sa v kolóne sorbuje najsilnejšie a konkuruje zložkám vzorky. Posúva pred sebou teda zóny jednotlivých látok, tieto sa usporiadajú od najmenej sorbovanej po najsilnejšie sorbovanú zložku  Hlavné charakteristiky chromatogramu v kolónovej elučnej chromatografii Na chromatograme, ktorý vznikne elučnou metódou, sa pozorujú píkové maximá pre jednotlivé zóny zložiek vystupujúce z kolóny. Dôležité parametre každého píku sú: poloha chromatografického píku charakterizovaná plochou - maxima píku časovej osi, určuje základné elučné charakteristiky súvisiace s vlastnosťou analytu veľkosť píku - vyjadrená výškou píku alebo plochou pod krivkou píku určenou integráciou v intervale od začiatku do konca píku, ktoré sa vzťahujú k množstvu alebo koncentráciu analytu.  Hlavné charakteristiky chromatogramu v kolónovej elučnej chromatografi šírka a tvar píku - je šírka píku pri základni alebo v polovici jeho výšky (s elučným časom analytu a prostredníctvom nej sa hodnotí účinnosť kolóny a separácie. Tvar, resp. symetria píku, je ďalší dôležitý parameter Základné elučné charakteristiky Merateľné a odvodené charakteristiky separácie vyplývajú z rýchlosti, ktorou častice látky prechádzajú cez kolónu. Zbrzďovanie molekúl (alebo iónov) jednotlivých zložiek vzorky stacionárnou fázou spôsobuje, že kolónou prechádzajú menšou rýchlosťou ako je rýchlosť mobilnej fázy. V daných podmienkach sa molekuly jednej zložky správajú takmer rovnako v štatistických medziach normálneho rozdelenia, preto vytvoria jednu zónu, ktorej koncentračný profil zodpovedá približne Gaussovej funkcii (pík na chromatograme). Základné elučné charakteristiky V praxi sa porovnávajú častejšie časové charakteristiky, ktoré sa dajú priamo merať. Elučný čas analytu , označovaný tR,i je čas od nadávkovania analyzovanej zmesi (vzorky) do kolóny resp. do dávkovača chromatografu po výstup zóny analytu z kolóny v maximálnej koncentrácii. Predstavuje ho časová súradnica maxima píku na chromatograme. Tento časový interval sa skladá z času, ktorý analyt strávi (sumárne) v mobilnej fáze a ktorý sa nazýva mŕtvy čas tM, a času stráveného (sumárne) v stacionárnej fáze, ktorý sa nazýva redukovaný elučný čas tR,i Základné elučné charakteristiky Mŕtvy čas tM sa určuje ako elučný čas takej inertnej látky, ktorá sa v kolóne nezbrzďuje, teda neinteraguje so stacionárnou fázou a po celý čas prechodu kolónou sa nachádza len v mobilnej fáze, pričom sa pohybuje rovnakou rýchlosťou ako mobilná fáza. Zodpovedá času potrebnému na to, aby molekuly mobilnej fázy prešli cez kolónu (prakticky od aktuálneho miesta nadávkovania do miesta detekcie). Elučný objem analytu Vr,i, sa určuje ako objem mobilnej fázy, ktorý musí prejsť kolónou, aby analyt prešiel od vstupu po výstup chromatografickej kolóny. Základné elučné charakteristiky Mŕtvy objem kolóny VM sa určuje ako objem mobilnej fázy, ktorý musí prejsť kolónou, aby nezbrzďovaná látka prešla od vstupu po výstup chromatografickej kolóny. Relatívne elučné charakteristiky Zbrzdenie zložky v kolóne sa vyjadruje rôznymi elučnými (retenčnými) charakteristikami, ktoré porovnávajú rýchlosť pohybu zóny vybranej zložky voči rýchlosti pohybu mobilnej fázy, alebo inej referenčnej zložky. Takou charakteristikou je relatívny elučný čas. Retenčný faktor k (v literatúre nazývaný aj kapacitný pomer) vyjadruje relatívne zdržanie analytu v stacionárnej fáze v porovnaní s pohybom mobilnej fázy, nezávisí od rýchlosti pohybu mobilnej fázy, ale závisí od teploty, pomeru objemov fáz v kolóne a distribučnej charakteristiky (konštanty). Relatívne elučné charakteristiky Účinnosť chromatografickej kolóny a separácie Efekt rozširovania zón pozdĺž prechodu kolónou má významný vplyv na separáciu susediacich zón rôznych látok. Šírka píku je v nepriamom vzťahu k účinnosti separácie alebo účinnosti kolóny. Pojem účinnosť chromatografickej kolóny charakterizuje mieru rozširovania zón v kolóne. Výpočet vychádza zo šírky chromatografického píku na zázname, ktorá sa porovnáva s elučným časom. Separačnú účinnosť možno charakterizovať z nameraných údajov pre jednu látku: počtom teoretických priehradiek N a výškovým ekvivalentom teoretickej priehradky H. Relatívne elučné charakteristiky Teoretická priehradka je (hypoteticky) časť kolóny, v ktorej dochádza k jednotkovému procesu ustálenia rovnováhy pre distribúciu analytu medzi mobilnou a stacionárnou fázou. Dĺžka tejto časti kolóny sa nazýva výškový ekvivalent teoretickej priehradky H. Keď sa látka premiestňuje v kolóne, znamená to postupný prechod spolu s mobilnou fázou z jedného separačného stupňa na ďalší stupeň. Čím je menšia hodnota H, tým vyššia je účinnosť kolóny, zóny látok v kolóne sú užšie a lepšie sa dokážu od seba oddeliť. Účinnosť kolóny rastie s dĺžkou kolóny. Keď sa porovnávajú rôzne kolóny vzhľadom na počet teoretických priehradiek, mala by sa použiť tá istá zlúčenina. Teória priehradiek je len približnou aproximáciou skutočného procesu v kolóne. Relatívne elučné charakteristiky Príspevky k rozširovaniu zóny a veľkosti H - kinetická teória Rozširovanie zón sa odvodzuje od kinetického vplyvu, ktorého rozsah závisí od rýchlosti rôznych procesov pri prenose látky medzi mobilnou a stacionárnou fázou. Faktory, ktoré ovplyvňujú účinnosť kolóny sú: rýchlosť toku mobilnej fázy, rýchlosť sorpcie/desorpcie analytu, difúzny koeficient v mobilnej fáze, difúzny koeficient v stacionárnej fáze, rozmer častíc náplne (nosiča alebo priamo tuhej stacionárnej fázy), hrúbka filmu kvapalnej stacionárnej fázy, priemer kolóny. Relatívne elučné charakteristiky Kinetické vplyvy sa hodnotia v kombinovaných členoch, ktoré opisujú vírivú difúziu, pozdĺžnu difúziu v mobilnej a stacionárnej fáze, prenos látky do a z kvapalnej stacionárnej fázy, prenos látky na a z tuhej stacionárnej fázy a prenos látky v mobilnej fáze. Posledné tri uvedené faktory sa charakterizujú príspevkom odporu proti prenosu látky. Relatívne elučné charakteristiky Turbulentná difúzia (vírivá difúzia) - príspevok HA Molekuly mobilnej fázy pretekajú okolo zrniek stacionárnej fázy. V dôsledku odlišnosti trajektórií sa porovnávané molekuly za určitý čas dostanú do inej vzdialenosti. Tým sa zóna zložky v kolóne rozširuje. Hlavný vplyv na turbulentnú difúziu má veľkosť a tvar častíc náplne kolóny a rovnomernosť ich uloženia. Rýchlosť toku mobilnej fázy nemá žiadny vplyv na tento dej. Nulovú hodnotu príspevku HA majú kapilárne kolóny s tenkou vrstvou/filmom stacionárnej fázy na vnútornom povrchu kolóny v GC. Relatívne elučné charakteristiky Odpor proti prenosu látky - príspevok HC Molekuly zložky prenikajú do rôznej hĺbky stacionárnej fázy. Ak sa dostanú do hlbšej vrstvy, zdržia sa dlhšie, ako keď sú len pri povrchu alebo na povrchu stacionárnej fázy. Na prenos látky medzi fázami sa požaduje určitý čas, v prietokových systémoch často nie je dostatočný na ustálenie rovnováhy. Príspevok HC je priamo úmerný rýchlosti toku mobilnej fázy, pretože rýchly pohyb mobilnej fázy spôsobí väčšie vzájomné vzdialenie molekúl prenikajúcich do rôznych hĺbok. Zóna sa tak rozširuje. Chromatografický rozlišovací faktor Na vyjadrenie miery, s akou sa od seba separujú dve zložky i a j susediace na chromatograme, sa používa veličina chromatografický rozlišovací faktor Rij Analytická chémia Prednáška č. 10 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Kvapalinová chromatografia Kvapalinová chromatografia je analytická separačná metóda, ktorá slúži na analýzu zmesí látok. Vzorky môžu byť vo forme zmesi kvapalných látok alebo roztokov tuhých látok. LC umožňuje separovať nedisociovateľné aj disociovateľné látky, polárne aj nepolárne látky organického a anorganického charakteru, nízkomolekulové aj vysokomolekulové látky. Základná podmienka je, aby látky boli rozpustné v bežných organických rozpúšťadlách, vo vode alebo v zriedených minerálnych kyselinách. Vzhľadom na to, že väčšina separácií sa dá uskutočniť pri laboratórnej teplote, je LC vhodná na separáciu málo prchavých látok a látok tepelne nestálych pri vyšších teplotách. Kvapalinová chromatografia V kvapalinovej chromatografii sa vzorka (analyzovaná zmes látok) dávkuje do prúdu kvapalnej mobilnej fázy (bez prerušenia jej toku) a tá ju unáša chromatografickou kolónou, v ktorej je umiestnená stacionárna fáza. Počas separácie (s výnimkou SEC) sa uplatňujú v rôznej miere vzájomné interakcie medzi molekulami látok a molekulami stacionárnej a mobilnej fázy. Proces separácie, a tým aj hodnoty elučných charkteristík, sa môže ovplyvňovať voľbou zloženia mobilnej a stacionárnej fázy (separačného systému). Zóny separovaných látok sa detegujú vhodným detektorom. Získaný chromatografický záznam sa vyhodnocuje z hľadiska kvalitatívnej aj kvantitatívnej analýzy. Kvapalinová chromatografia V kvapalinovej chromatografii sa na separáciu látok môžu využiť nasledujúce vratné dvojfázové fyzikálno-chemické deje (mechanizmy separácie): adsorpcia na povrchu tuhej fázy, rozdeľovanie medzi dve nemiešateľné kvapaliny, výmena iónov, separácia molekúl podľa veľkosti a špecifické interakcie. To umožňuje nájsť dostatočne selektívny a účinný separačný systém pre analýzu zložitých zmesi látok. Hranice jednotlivých metód nie sú vždy jednoznačné a v reálnych separačných systémoch sa uplatňuje viac mechanizmov (typov interakcií) súčasne. Na dosiahnutie separácie látok sa zvyčajne používa elučná technika vyvíjania chromatogramu. Kvapalinová chromatografia Mobilné fázy Ako mobilné fázy sa používajú zmesi organických rozpúšťadiel, vody a roztokov elektrolytov. Požiadavky kladené na rozpúšťadlá sú: maximálna možná chemická čistota, nízka viskozita, chemická stálosť, schopnosť rozpúšťať stanovované látky, kompatibilita so stacionárnou fázou a kompatibilita so zvoleným typom detekcie. Mobilné fázy nesmú rozpúšťať stacionárnu fázu ani s ňou alebo separovanými látkami reagovať. Kvapalinová chromatografia Ak analyzovaná vzorka obsahuje látky, ktoré sa výrazne odlišujú svojimi fyzikálno-chemickými vlastnosťami môže analýza s použitím mobilnej fázy s konštantným zložením (izokratická separácia) trvať veľmi dlho (rozdiel v hodnotách retenčných faktorov viac ako 10) príp. je nízka účinnosť kolóny (nízky počet teoretických priehradiek). Napr. pri analýze vzorky, ktorej zložky sa veľmi odlišujú polaritou, na nepolárnej stacionárnej fáze budú pri izokratickej separácii polárnou mobilnou fázou eluovať polárne zložky veľmi rýchlo (nízke hodnoty retenčných faktorov). Rýchlosť elúcie nepolárnych látok bude malá (vysoké hodnoty retenčných faktorov) a ich zóny veľmi široké. Kvapalinová chromatografia Vyššia účinnosť a skrátenie času analýzy sa dosiahne programovanou zmenou zloženia mobilnej fázy počas analýzy (gradientová separácia). V adsorpčnej a rozdeľovacej kolónovej chromatografii sa používa zvýšenie elučnej sily, v ionexovej programovaná zmena pH alebo iónovej sily mobilnej fázy. Kvapalinová chromatografia Stacionárne fázy Stacionárnou fázou v kvapalinovej chromatografii sú zrná tuhého sorbentu, kvapalina zachytená na pevnom inertnom nosiči alebo blok polymérneho materiálu. Na dosiahnutie vysokej účinnosti kolón sa používajú také typy sorbentov, ktoré minimálne prispievajú k rozširovaniu elučných zón separovaných látok, a tým k zhoršovaniu účinnosti. Z teórie chromatografie vyplýva, že na separáciu látok na tuhých sorbentoch má významný vplyv veľkosť, distribúcia a homogenita usporiadania zŕn stacionárnej fázy. HPLC Vysokoúčinná kolónová kvapalinová chromatografia Na rozdiel od klasickej kolónovej chromatografie, s cieľom rýchlejšej a účinnejšej separácie látok pracuje pri vyššom prietoku mobilnej fázy a využíva stacionárne fázy s priemerom zŕn menším ako 10 µm (najčastejšie 5 µm) alebo monolyty. Tie kladú pohybujúcej sa kvapaline veľký odpor, a preto je potrebné pracovať pri vysokom tlaku (do 40 MPa). HPLC je vhodná na separáciu zložitých zmesí látok. Zariadenie pre HPLC, podobne ako zariadenie pre klasickú LC, pozostáva z častí, ktoré zabezpečujú transport mobilnej fázy, separáciu zložiek zmesi a ich detekciu. UHPLC Ultra-vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (UHPLC) Na separáciu sa používajú kratšie chromatografické kolóny s menším vnútorným priemerom (v porovnaní s HPLC), ktoré sú naplnené sorbentami s vysokou mechanickou pevnosťou a veľkosťou častíc okolo 1,7 µm. Separácia sa uskutočňuje pri vyšších tlakoch (do 120 MPa) ako v HPLC. UHPLC má oproti HPLC viac výhod. Okrem zvýšenia separačnej účinnosti aj zníženie medze detekcie, zvýšenie citlivosti, skrátenie času analýzy a tiež aj celkových nákladov vzhľadom k menšej spotrebe rozpúšťadiel. Technika je vhodná na rutinné analýzy v laboratóriách spracovávajúcich veľké množstvá vzoriek. Zariadenie HPLC Základné zariadenie na HPLC sa môže podľa potreby dopĺňať ďalšími časťami. Mobilná fáza sa zo zásobníka vedie cez odplyňovacie zariadenie do vysokotlakového čerpadla (prípadne sa v zmiešavači podľa zvoleného programu miešajú prúdy z viacerých zásobníkov a potom sa vedú do vysokotlakového čerpadla). Odtiaľ sa dopravuje cez zariadenie na dávkovanie vzoriek do chromatografickej kolóny. Kolóna, v ktorej je umiestnená stacionárna fáza, je priamo spojená s detektorom. Z neho je výstup do zberača frakcií alebo do zberača odpadu. Detektor je spojený so zariadením na zaznamenávanie a vyhodnocovanie údajov. Zariadenie HPLC Riadiaca jednotka môže kontrolovať a riadiť aj činnosť vysokotlakového čerpadla a dávkovacieho zariadenia. Doplňujúce zariadenia sú predkolóna, termostat pre chromatografickú kolónu, automatické dávkovacie zariadenie a ďalší detektor v „on-line" spojení. Zariadenie HPLC - odplynovač Pri zmiešavaní vodných roztokov s organickými rozpúšťadlami klesá rozpustnosť plynov a vznikajú mikrobublinky, ktoré spôsobujú odchýlky v prietoku mobilnej fázy a tým nereprodukovateľnosť elučných časov i dávkovaného objemu a ovplyvňujú aj funkciu detektora. V praxi sa používa viac spôsobov odplyňovania mobilnej fázy: pôsobením ultrazvuku, pôsobením vákua, prebublávaním inertným plynom (He) a membránovým odplyňovaním často priamo spojeným s vysokotlakovým čerpadlom. Zariadenie HPLC - vysokotlakovo čerpadlo Vysokotlakové čerpadlo zabezpečuje konštantné, reprodukovateľné a bezpulzové prúdenie mobilnej fázy v celom rozsahu pracovných prietokov, s menej ako 1% kolísaním prietoku pri tlaku až 40 MPa (pri UHPLC tlaky až 120 MPa). Hodnota prietoku sa líši v závislosti od typu použitej chromatografickej kolóny – nl/min pre kapilárne kolóny, μl/min pre mikronáplňové kolóny, ~1 ml/min pre bežné analytické náplňové kolóny, desiatky ml/min pre preparatívne kolóny. Zariadenie HPLC - dávkovacie zariadenie Dávkovacie zariadenie slúži na opakovateľné presné dávkovanie zmesi látok (vzorky) do chromatografickej kolóny bez prerušenia toku mobilnej fázy. Pri manuálnom dávkovaní sa väčšinou používajú dávkovacie ventily s vymeniteľnou vonkajšou slučkou s definovaným objemom (od 5 do 1000 µl), ktoré sú zhotovené z inertných materiálov (nehrdzavejúca oceľ, PEEK) a plnia sa pomocou injekčnej striekačky. Automatické dávkovače sú spojené so zásobníkom, v ktorom sú vzorky umiestnene v uzavretých mikronádobkách. Priestor je chránený pred svetlom a môže byť aj temperovaný (0 až 50 °C). Vzorka sa dávkuje pomocou dávkovacieho ventilu. Na zabránenie kontaminácie vzoriek sa používajú oplachy dávkovacích častí pomocnými rozpúšťadlami. Zariadenie HPLC - chromatografické kolóny Materiály chromatografických kolón v HPLC musia odolávať vysokým tlakom. Kolóny sú zhotovené ako rovné rúrky s hladkým vnútorným povrchom vyrobené z nehrdzavejúcej ocele alebo pevného skla. Dĺžka kolón je v rozsahu 3 až 25 cm a vnútorný priemer je najčastejšie v rozsahu 2 až 5 mm, pre ktoré je vhodný prietok mobilnej fázy 0,5 až 2 ml-min. Kolóny sú naplnené stacionárnou fázou, ktorou je zrnitý materiál (s veľkosťou častíc 1,7 až 10 µm) s rôznymi vlastnosťami (celopórovitý alebo povrchovopórovitý) alebo do určitého tvaru (najčastejšie valca) polymerizovaný pórovitý materiál (tzv. monolitové kolóny). Zariadenie HPLC - chromatografické kolóny Rozmery kolón závisia od požiadaviek na analýzu, napr. požadovaná účinnosť, počet separovaných látok, a od veľkosti častíc náplne. Čím je menšia veľkosť častíc náplne, tým kratšiu kolónu použijeme. Pri priemernej veľkosti zŕn náplne 5 µm je dĺžka kolóny v rozsahu 10 až 25 cm (vnútorný priemer kolóny 3 až 5 mm). Účinnosť separácie, čas analýzy a pracovný tlak sa zvyšujú s predlžovaním kolóny a so znižovaním priemeru častíc náplne. Pri práci s kolónami s priemerom menším ako 2 mm, dĺžkou aj niekoľko desiatok cm ide o tzv. kapilárnu kvapalinovú chromatografiu. Zariadenie HPLC - regulácia teploty Zariadenie na reguláciu teploty kolóny (kolónový termostat) nie je nutnou súčasťou chromatografického zariadenia, ak je pri separácii zabezpečená konštantná teplota iným spôsobom. Väčšina chromatografických separácií sa uskutočňuje pri laboratórnej teplote a v prípade, že je potrebné uskutočniť separáciu pri presne definovanej teplote (zvýšenej alebo zníženej) môžu sa použiť vzduchové termostaty. Medzi hlavné charakteristiky termostatov patrí teplotná stálosť a rýchlosť dosiahnutia nastavenej teploty. Niektoré termostaty umožňujú programovať teplotné zmeny počas separácie. Zariadenie HPLC - detektory Detektor poskytuje informáciu o zložení eluátu na výstupe z kolóny na základe merania rozdielov vo fyzikálnych vlastnostiach separovaných látok a mobilnej fázy. Prítomnosť látky v mobilnej fáze sa prejaví zaznamenaním píku na chromatografickom zázname. Rozlišujú sa univerzálne (neselektívne) detektory, ktoré detegujú prítomnosť akejkoľvek látky v mobilnej fáze (meranie celkovej vlastnosti kvapaliny, napr. index lomu, vodivosť) a selektívne detektory, ktoré detegujú prítomnosť len malej skupiny látok a merajú charakteristickú vlastnosť alebo za charakteristických podmienok. Zariadenie HPLC - detektory V HPLC sa najčastejšie používajú nasledujúce typy detektorov: spektrofotometrický pracujúci v UV až VIS oblasti elektromagnetického žiarenia, fluorescenčný, refraktometrický, vodivostný, hmotnostne spektrometrický a elektrochemický. K ďalším typom detektorov patria detektor rozptylu žiarenia, infračervený detektor, detektor jadrovej magnetickej rezonancie (NMR) a detektory pre špeciálnejšie aplikácie (polarimetrický detektor, detektor na základe kruhového dichroizmu, rádiochemický detektor). Kvapalinová chromatografia v plošnom usporiadaní Pri chromatografii v plošnom usporiadaní stacionárnej fázy, separované zložky postupujú stacionárnou fázou v podobe škvŕn a detegujú sa vhodnou chemickou, fyzikálnou alebo biologickou metódou. Pre každú zložku je charakteristická jej poloha na chromatograme a intenzita škvrny súvisí z množstvom zložky. Technika má využitie vďaka jednoduchosti uskutočnenia a nenáročnému experimentálnemu zariadeniu. Kvapalinová chromatografia v plošnom usporiadaní Princíp separácie látok pomocou chromatografie plošnom usporiadaní stacionárnej na distribúcií látky medzi fázy je, podobne ako v kolónovej chromatografii, založený na distribúcii látky medzi stacionárnu a mobilnú fázu, ktoré sú ešte navyše v kontakte s parami mobilnej fazy. Zo separačných mechanizmou sa sa najčastejšie uplatňuje adsorpcia látok na povrch stacionárnej fázy (adsorpčná chromatografia), rozdielna rozpustnosť látok v dvoch obmedzene miešateľných fázach (rozdeľovacia chromatografia), prípadne výmena iónov (ionexová chromatografia) Kvapalinová chromatografia v plošnom usporiadaní Technika analýzy Na rozdiel od kolónovej chromatografie v týchto technikách je stacionárna fáza umiestnená na podložke. V papierovej chromatografii sa používa kvalitný filtračný papier na základe čistej celulózy. Celulózové vlákna môžu interagovať vodíkovými väzbami s polárnymi rozpúšťadlami a vytvárať na svojom povrchu film kvapalnej fázy. Zvlášť vysokú afinitu má celulóza k vode (schopná viazať 5 až 20 %). Pri použití mobilnej fázy s nižšou polaritou ako voda sa separácia uskutočňuje rozdeľovacím (LLC) mechanizmom. Kvapalinová chromatografia v plošnom usporiadaní V tenkovrstvovej chromatografii (TLC) je tuhá stacionárna fáza umiestnená vo forme tenkej vrstvy (hrúbka vrstvy 0,1 až 0,25 mm) na podložke zo skla alebo hliníkovej fólie. Stacionárnou fázou sú podobné materiály ako v kolónovej chromatografii (adsorbenty na základe silikagélu alebo oxidu hlinitého, ionexy, chemicky viazané fázy, chirálne fázy) a ich voľba závisí od charakteru separovaných látok. Pre hydrofóbne látky sú vhodné napr. adsorbenty oxid hlinitý, silikagél, a pre hydrofilné látky zase napr. celulóza, ionexy a chemicky viazané nepolárne fázy. V súčasnosti sa využívajú komerčne dostupné TLC platne, ktoré majú homogénne pokrytie, vysokú hustotu a priľnavosť vrstvy. Kvapalinová chromatografia v plošnom usporiadaní Detekcia separovaných zložiek sa uskutočňuje : buď na základe prirodzeného zafarbenia ich škvŕn alebo v prípade, že zložky nie sú farebné látky, zviditeľnia sa chemickou reakciou s vhodným činidlom (postrekom činidla, ktoré so zložkami vzorky reaguje a poskytne farebné zlúčeniny), alebo ožiarením s UV žiarením (pozoruje sa zmena zafarbenia škvrny alebo platne po interakcii so žiarením) Plynová chromatografia Je separačná analytická metóda, ktorá slúži na analýzu zmesí plynov alebo látok, ktoré možno previesť do plynnej fázy pri teplotách do 450 °C. Umožňuje analyzovať len také látky, ktoré majú dostatočný tlak nasýtených pár, sú tepelne stále a majú relatívnu molekulovú hmotnosť menšiu než 1000. Vzorky môžu byť vo forme zmesí plynov, pár prchavých zlúčenín, kvapalných zmesí nedisociovateľných zlúčenín, roztokov organických látok v organických rozpúšťadlách, a zmesí zlúčenín, ktoré vznikajú rozkladom analyzovaných materiálov pri teplotách do 800 °C (v pyrolýznej plynovej chromatografii). Plynová chromatografia GC sa nedá priamo použiť na separáciu makromolekúl, organických a anorganických solí. Často sa používa chemická zmena analytu, ktorý má nevyhovujúce vlastnosti, na deriváty, ktoré sa plynovou chromatografiou už dajú analyzovať. Plynová chromatografia V plynovej chromatografii sa vzorka dávkuje do prúdu pomocného (nosného) plynu, zložky vzorky sa vyparujú a prenášajú ďalej chromatografickou kolónou vo forme pár s pomocou plynu ako mobilnej fázy (nosný plyn). Interakcia analytu s mobilnou fázou nie je významná, pretože v podmienkach GC sa používa inertný nosný plyn. V kolóne sa zložky separujú na základe rôznej schopnosti interagovať so stacionárnou fázou, pretože sa kontinuálne distribuujú medzi nosný plyn a stacionárnu fázu, pričom sa ich pohyb oproti nosnému plynu spomaľuje charakteristicky pre danú zložku. Zóny zložiek, vystupujúce z kolóny, sa zaznamenávajú detektorom. Plynová chromatografia Ako stacionárna fáza sa môže využiť: Tuhá fáza (látka), na ktorej dochádza k molekulovej adsorpcii. Metóda GSC („gas-solid chromatography") alebo adsorpčná chromatografia sa používa v praxi na analýzu plynných látok a ovzdušia, ako aj veľmi prchavých zlúčenín z rôznych vzoriek. Hlavný separačný mechanizmus tuhej stacionárnej fázy je adsorpcia analytu z plynnej fázy na aktívny povrch. Plynová chromatografia Ako stacionárna fáza sa môže využiť: Viskózna kvapalina alebo polymér nad teplotou jeho sklovitého prechodu. Metóda GLC („gas-liquid chromatography") alebo rozdeľovacia chromatografia je určená na analýzu organických zlúčenín s rôznou prchavosťou. Hlavný separačný mechanizmus je rozdeľovanie a podieľa sa na ňom molekulová difúzia v plyne a rozpúšťanie analytu v molekulovej forme v stacionárnej fáze. Plynová chromatografia Plynová chromatografia sa predovšetkým používa na analýzu mnohozložkových zmesí organických zlúčenín, analýzu cieľových analytov vo vzorkách s komplikovanou matricou, štúdium chemických reakcií a iných teplotne závislých premien zlúčenín, a štúdium separačného mechanizmu pre nové sorpčné materiály. Plynová chromatografia Súčasti plynového chromatografu: Zariadenia pre plynovú chromatografiu sa môžu odlišovať druhom nosného plynu, typom vstupu na dávkovanie vzoriek, druhom kolóny a typom detektora. Dávkovací priestor predstavuje vyhrievaný blok, do ktorého je zavedená chromatografická kolóna a z druhej strany sa doň privádza vzorka. Kolóna je časť chromatografu, v ktorej je umiestnená stacionárna fáza, a v ktorej dochádza k separácii zložiek vzorky na relatívne samostatné zóny podľa miery ich odlišnosti. Používajú sa náplňové alebo kapilárne kolóny. Plynová chromatografia Súčasti plynového chromatografu: Detektor slúži na detekciu látok v nosnom plyne na výstupe z kolóny. Vyhodnocovacie zariadenie spracováva signál detektora, zaznamenáva chromatografickú krivku, chromatogram, a vykonáva jej vyhodnotenie. Plynová chromatografia Dávkovacie zariadenia a techniky dávkovania vzoriek Dávkovanie vzorky predstavuje jednu z najkritickejších operácií v plynovej chromatografii, pretože spôsob dávkovania vzorky do kolóny môže priamo ovplyvniť výsledky kvantitatívnej analýzy aj pozorovanú účinnosť separačného procesu. Základná úloha dávkovacieho zariadenia je umožniť čo najrýchlejšie zavedenie definovaného podielu vzorky na vstup kolóny vo forme úzkej zóny, zloženie ktorej je totožné so zložením vzorky. Plynová chromatografia Množstvo vzorky musí byť dobre definované a reprodukovateľné a dávkovací systém nemá zhoršiť účinnosť separácie, poskytovanú kolónou. Zložky vzorky sa pri dávkovaní nemajú chemicky meniť, adsorbovať alebo meniť vzájomné pomerné zastúpenie. Ideálne dávkovanie nesmie diskriminovať zložky vzorky v závislosti od teploty varu, polarity alebo molekulovej hmotnosti, kvôli snahe znížiť čas transportu z dávkovacieho vstupu do kolóny. Musí sa zabezpečiť úplný prenos do kolóny tak pre stopové ako aj hlavné zložky vzorky.