Analytická chémia Prednáška č.1 PDF

Analytická chémia Prednáška č.1 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Osnova predmetu Úvod do analytickej chémie, proces chemickej analýzy, zabezpečenie kvality v analytickej chémii Odber a úprava vzorky...

Analytická chémia Prednáška č.1 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Osnova predmetu Úvod do analytickej chémie, proces chemickej analýzy, zabezpečenie kvality v analytickej chémii Odber a úprava vzorky Chemické metódy analýzy Spektrálne metódy - základné rozdelenie, AES, AAS Spektrálne metódy - molekulová absorpčná /luminiscenčná spektrometria Optické nespektrálne metódy - nefelometria, turbidimetria, polarimetria Elektroanalytické metódy - potenciometria, konduktometria, ampérometria, coulometria Elektromigračné metódy - plošná elektroforéza, CE, CZE, CITP, CIEF Analytické separačné metódy - základy chromatografickej separácie, plošné usporiadanie chromatografickej separácie Analytické separačné metódy - základné pojmy a inštrumentácia LC, HPLC, UHPLC, GC Hmotnostná spektrometria - princíp a základné pojmy, spojenie GC-MS, LC-MS, CE-MS Bioanalytické metódy - enzýmové analytické metódy, imunochemické analytické metódy, analýza s použitím biosenzorov, analýza nukleových kyselín Podmienky absolvovania predmetu: Záverečný písomný test (max. 80% hodnotenia) Odovzdanie všetkých protokolov z praktických cvičení (max. 10 % hodnotenia) Úspešné absolvovanie testu z príkladov zameraných na prípravu roztokov (3 príklady, z ktorých je na úspešné absolvovanie testu potrebné vypočítať̌ aspoň̌ 2) (max. 10 % hodnotenia) Historický vývoj analytickej chémie V závislosti od uhla pohľadu považujeme analytickú chémiu za jeden z najstarších, ale zároveň aj najmladších odborov chémie Jednoduché skúšky súvisiace so zberom plodov Spracovanie kovov (drahé kovy) - platidlá Prvá analýza: Archimedovo stanovenie rýdzosti zlata Rozvoj jednoduchých analytických postupov a techník - klasické chemické analýzy Prvý rozvoj polovica 19 storočia základ kvalitatívnej analýzy (tvorba základov pre vznik analytickej chémie ako vednej disciplíny) Metódy analytickej chémie Pri analytickom chemickom meraní sa rozlišujú princípy, metódy a postupy merania. Princíp merania je daný typom hlavne využívanej interakcie analytu a skúmadla (chemická reakcia, elektrolýza, emisia, absorpcia svetla) Analytická metóda je aplikácia princípu použitého na dôkaz a stanovenie zložiek vzorky (analytov) Metódy možno rozdeliť na kvantitatívne a kvalitatívne prípadne podľa princípu, spôsobu vykonania analýzy, množstva, povahy, a skupenstva vzorky Metódy - rozdelenie Kvalitatívna analýza je v zmysle IUPAC definovaná ako analýza, pri ktorej sa látky identifikujú, alebo klasifikujú na základe ich fyzikálno-chemických vlastností Najjednoduchší výsledok kvalitatívnej analýzy je dôkaz, teda poskytnutie informácie o prítomnosti iónov, zlúčenín, alebo funkčných skupín V prípade, že potrebujeme určiť neznámu látku (molekulovú zlúčeninu) hovoríme o identifikácii. Identifikácia zlúčenín je omnoho náročnejšia ako dôkaz Metódy - rozdelenie Kvantitatívna analýza je v zmysle IUPAC definovaná ako analýza, pri ktorej sa určuje a vyjadruje v číselnej hodnote množstvo alebo koncentrácia zložky/ zlúčeniny vo vzorke Na kvantitatívnu analýzu nie je potrebná kvantifikácia ale kvantitatívna analýza vždy vyžaduje dôkaz zložiek alebo identifikáciu zlúčenín, pre ktoré sa určuje hodnota koncentrácie alebo množstva Proces získania kvantitatívnej analytickej veličiny sa volá stanovenie - výsledok sa vyjadruje v absolútnej hodnote (mg), alebo v relatívnej hodnote (%) Semikvantitatívna analýza - neurčuje presné množstvo Rozdelenie podľa princípu Senzorické (zmyslové) - na posúdenie vzorky sa využívajú ľudské zmysly. Využitie: potravinárstvo (vzhľad produktov, ich chuť, vôňa alebo farba). Neznáme vzorky je prísne zakázané ochutnávať a hodnotiť ich zápach - zdraviu nebezpečné! Chemické - zloženie a množstvo zložiek sa určuje na základe chemických reakcií prebiehajúcich medzi stanovovanou zložkou a chemickým skúmadlom Fyzikálne - zloženie a množstvo zložiek sa určuje na základe merania zmeny fyzikálnej veličiny Rozdelenie podľa princípu Fyzikálno-chemické - zloženie alebo množstvo sa určuje na základe zmeny fyzikálnych alebo chemických vlastností analyzovaného materiálu (vzorky), pri aplikácií týchto metód je obyčajne potrebné používať rôzne prístroje Biochemické - zloženie a množstvo zložiek sa určuje na základe biochemických reakcií medzi analytom a vhodným skúmadlom Biologické/mikrobiologické - sledovanie vplyvu sledovaných zlúčenín na organizmy a živočíchy Rozdelenie podľa histórie Klasické analytické metódy (analýza mokrou cestou) - využíva hlavne chemické a senzorické princípy - Pri kvalitatívnej analýze: zmena sfarbenia alebo tvorba zrazeniny, tvorba plynu, zápach uvoľneného plynu (plyn nesmie byť toxický!) - Pri kvantitatívnej analýze váženie produktov reakcie s chemickým skúmadlom (gravimetria) alebo meranie objemu pridávaného skúmadla potrebného na úplnú reakciu stanovovanej zložky vzorky (odmerná analýza - titračné metódy) Rozdelenie podľa histórie Inštrumentálne metódy vychádzajú z fyzikálnych, fyzikálno- chemických alebo biochemických princípov. Podľa toho ich rozdeľujeme do troch hlavných skupín: 1. Elektrochemické metódy - meranie elektrochemických veličín ako prúd, potenciál, odpor, kapacita, väčšina týchto metód je založená na elektochemickej reakcii, ktorou sa generuje chemické skúmadlo, alebo sa reakcie zúčastňuje priamo stanovovaná zložka vzorky 2. Spektrometrické metódy 3. Separačné metódy Koncentračné úrovne Jednotlivé zložky sú prítomné vo vzorkách na rôznej koncentračnej úrovni Podľa toho sa zložky rozdeľujú na: Hlavné (majoritné): viac ako 1,00% Vedľajšie (minoritné): 0,01 - 1,00% Stopové (mikrozložky): 10-6 - 0,01% Utrastopové: obsah menej ako 10-6 % Proces chemickej analýzy Získanie informácií o zložení vzorky, alebo množstve analytov prítomných vo vzorke Proces chemickej analýzy však nezahŕňa len vlastné meranie, ale všetky úkony potrebné na získanie požadovanej informácie Definícia problému, odber vzorky, spracovanie vzoriek, meranie analytického signálu, spracovanie a vyhodnotenie dát, výsledok - záver. Proces chemickej analýzy - metódy Vo všeobecnosti sa uprednostňujú štandardné analytické metódy dané medzinárodnými /národnými normami Pri výbere metódy sa prihliada na pracovné charakteristiky metódy napríklad: selektivita, špecifickosť, výťažnosť, medza detekcie, medza stanovenia, linearita odozvy, robustnosť, časová náročnosť a cena stanovenia Charakteristiky poskytnutého výsledku sú: pravdivosť, presnosť, správnosť, opakovateľnosť, reprodukovateľnosť Terminológia Rozsah metódy, pracovný rozsah (Range of method, working interval) - interval koncentrácií, ktoré možno s definovanou presnosťou (s definovanou neistotou) zisťovať danou metódou Selektivita (Selectivity) - schopnosť meracieho systému alebo metódy dokázať alebo stanoviť príslušný analyt aj v zložitej zmesi bez toho, aby iné zložky ovplyvňovali výsledok analýzy. Tento pojem sa týka mnohozložkovej analýzy Terminológia Špecifita (Specificity) - vlastnosť metódy vzťahovať sa výlučne na danú vlastnosť alebo analyt. Tento pojem sa teda týka jednozložkovej analýzy Citlivosť (Sensitivity) - smernica kalibračnej krivky (závislosti analytického signálu od koncentrácie alebo množstva analytu). Hovorí sa, že metóda je citlivá, keď malá zmena koncentrácie (c) alebo množstva (q) analytu zapríčiní veľkú zmenu signálu (x); t. j. keď ide o veľkú hodnotu pomeru dx/dc alebo dx/dq Terminológia Medza stanovenia (Limit of quantification) - najmenšia/najväčšia koncentrácia analytu (dolná a horná medza stanovenia), pri ktorej ešte má jeho stanovenie dohodnutú metrologickú kvalitu Blank, slepá vzorka (Blank sample) - materiál obdobného charakteru ako sa predpokladá u vzorky, v ktorom koncentrácia analytu je pod medzou detekcie použitej analytickej metódy Terminológia Chyba merania (Measurement error) - rozdiel medzi nameranou hodnotou a referenčnou hodnotou veličiny Chyba merania má dve zložky: náhodnú a systematickú Poznámka 1: Chyba sa nesmie zamieňať s omylom Poznámka 2: Chybu merania možno vzťahovať aj ku skutočnej hodnote veličiny, pokiaľ je známa Poznámka 3: Chyba a neistota merania sú dve úplne rozdielne koncepcie hodnotenia výsledku merania a nemožno ich zamieňať Terminológia Náhodná chyba merania (Random measurement error) - zložka celkovej chyby merania, ktorá sa pri opakovaní merania mení nepredpovedateľným spôsobom. Náhodná chyba vzniká ako výsledok náhodných fyzikálnych alebo chemických zmien počas merania, ktoré ovplyvňujú meranú veličinu, ale ktoré sú mimo kontroly zo strany pracovníka. Je to chyba, ktorá je pri meraní vždy prítomná a ktorá má štatistický charakter. Nemožno ju odstrániť, možno ju však minimalizovať zvýšeným počtom opakovaných meraní Terminológia Systematická chyba merania (Systematic measurement error) - zložka celkovej chyby merania, ktorá pri opakovaní merania ostáva konštantnou alebo sa mení predpovedateľným/odhadnuteľným spôsobom. Nezávisí od počtu meraní. Ak je to možné, treba ju pred meraním odstrániť alebo treba výsledok merania korigovať. Experimentálne ju možno zistiť tak, že sa analyzuje referenčný materiál za podmienok opakovateľnosti Terminológia Vychýlenie, bias (Bias) - odhad systematickej chyby. Rozdiel priemernej hodnoty výsledkov analýz a referenčnej hodnoty Pravdivosť merania (Measurement trueness) - tesnosť zhody medzi priemernou hodnotou výsledkov teoreticky nekonečného (v praxi štatisticky významného) počtu opakovaných meraní a referenčnou hodnotou veličiny Terminológia Správnosť merania (Measurement accuracy) - tesnosť zhody medzi nameranou hodnotou veličiny/výsledkom merania a pravou (skutočnou, nominálnou či konvenčnou) hodnotou veličiny Presnosť merania (Measurement precision) - vyjadruje vzájomnú tesnosť v súbore výsledkov získaných opakovaním meraní s použitím toho istého podielu vzorky za špecifických podmienok (podmienok opakovateľnosti). Presnosť je mierou rozptýlenia nameraných hodnôt. Jej matematickým vyjadrením je odhad smerodajnej/štandardnej odchýlky. Čím menšie sú hodnoty smerodajnej/štandardnej odchýlky, tým je presnosť väčšia. Presnosť závisí len od distribúcie náhodných chýb a nevzťahuje sa na pravdivú skutočnú hodnotu ani na konkrétnu hodnotu Terminológia Opakovateľnosť merania (Repeatibility of measurement) - presnosť merania určená zo súboru výsledkov merania získaných za podmienok opakovateľnosti merania. Opakovateľnosť sa vzťahuje k sérii výsledkov získaných meraním (analýzou) toho istého podielu vzorky na tom istom prístroji, tým istým pracovníkom, v tom istom laboratóriu v krátkych časových úsekoch medzi meraniami. Za týchto podmienok možno systematickú chybu považovať za konštantnú a štatistickým spracovaním výsledkov dostaneme informáciu o presnosti výsledkov merania, resp. analýzy. Vyjadruje sa odhadom smerodajnej/štandardnej odchýlky za podmienok opakovateľnosti Terminológia Reprodukovateľnosť merania (Reproducibility of measurement) - presnosť merania určená zo súboru výsledkov merania získaných podmienok reprodukovateľnosti merania. Reprodukovateľnosť sa vzťahuje k sérii výsledkov získaných meraním (analýzou) toho istého podielu vzorky rovnakou metódou, ale rozličnými pracovníkmi, na rozličných prístrojoch, v rozličných laboratóriách a aj po dlhších časových úsekoch medzi meraniami. Za týchto podmienok výsledky merania dávajú informácie o náhodnej aj o systematickej chybe. Odhad smerodajnej/štandardnej odchýlky za podmienok reprodukovateľnosti, je vždy väčší ako odhad smerodajnej/štandardnej odchýlky za podmienok opakovateľnosti. Nepokrýva však systematické chyby vyplývajúce z vlastností vzorky (matrice) a samotnej analytickej metódy Kalibrácia (Calibration) Činnosť, ktorou sa nájde vzťah medzi hodnotami veličín (s príslušnými neistotami) poskytovanými etalónmi/štandardmi merania a príslušnými experimentálne nameranými hodnotami signálov Súčasťou kalibrácie je vyhodnotenie neistôt merania Cieľom kalibrácie je využitie uvedeného vzťahu pre získanie výsledku merania z hodnoty meranej veličiny, ktorá spĺňa požiadavku nadväznosti Kalibračná krivka (Calibration curve) Je grafické znázornenie závislosti meraného signálu od veľkosti meranej veličiny Na osi nezávisle premennej (x) má kalibračná krivka hodnoty koncentrácie/množstva a na osi závisle premennej (y) hodnoty meraného signálu Pre získanie kalibračnej krivky sa meranie vykoná pomocou sady roztokov [kalibračných vzoriek pripravených napríklad z (certifikovaných) referenčných materiálov] so zvyšujúcou koncentráciou stanovovaného analytu Metóda kalibračnej krivky Pri kalibrácii sa meraním hodnôt signálu pre sériu známych množstiev analytu zistí tvar závislosti signálu a meranej veličiny (množstva/koncentrácie analytu), teda model / funkcia merania. Po zistení hodnoty signálu prislúchajúceho skúšobnému roztoku / podielu vzorky sa pomocou inverznej funkcie získa hodnota meranej veličiny platná pre podiel vzorky. Použitím parametrov presnosti v procese kalibrácie a v procese merania signálu vzorky sa vyhodnotia parametre presnosti stanovenia Metóda prídavku štandardu Predpokladá sa platnosť kalibračnej krivky, ale jej parametre nie sú vopred známe z nezávislého kalibračného experimentu. Meraním sa získa signál analytu pre skúšobný roztok / podiel vzorky. Ku skúšobnému roztoku / podielu vzorky sa pridá známe množstvo analytu tak, aby sa nezmenil charakter matrice. Potom sa získa nový signál, ktorý zodpovedá zvýšenému množstvu analytu. Prídavky známeho množstva analytu môžu byť viaceré. Na základe predpokladaného typu závislosti, nameraných signálov a známych prírastkov množstva analytu sa určí hodnota meranej veličiny (obsah analytu) a pri opakovaných prídavkoch aj parametre presnosti stanovenia Variabilita výsledkov merania Výsledok merania je vždy len priblížením ku skutočnej hodnote veličiny. Je to dôsledok nedokonalosti meracieho zariadenia, nedokonalosti metódy a vplyvu podmienok merania. Túto skutočnosť treba mať vždy na pamäti, pretože chemická analýza (analytické chemické meranie) je často základom pre rozhodovanie, ktoré môže mať dopad na zdravie ľudí, na ekonomiku organizácie a pod. Preto je nevyhnutné mať indikátor kvality ako mieru spoľahlivosti výsledkov merania. Prijateľný indikátor kvality musí byť univerzálny z hľadiska použiteľnosti, musí sa dať kvantitatívne vyjadriť a jednoznačne interpretovať. Takým indikátorom splňujúcim uvedené požiadavky je neistota merania Zabezpečenie kvality v analytickej chémii Systém správnej laboratórnej praxe (Good Laboratory Practice) - opisuje základné pravidlá pre správny výkon jednotlivých operácií v skúšobných laboratóriách. Pravidlá GLP musia obsahovať postupy pre manipuláciu s dátami, spravovanie jednotlivých protokolov - príprava roztokov, postupy jednotlivých analýz Akreditácia - formálne uznanie spôsobilosti skúšobného laboratória na vykonanie skúšky podľa ISO 17025. Na Slovensku je akreditačný systém zavedený od roku 1994. V roku 1999 zriadená SNAS - jediný akreditačný orgán v SR Zabezpečenie kvality v analytickej chémii Základný dokument podľa ISO 17025 je príručka kvality - ktorej právny subjekt (laboratórium) dokumentuje organizačné vzťahy, pracovné povinnosti a organizáciu laboratória Akreditované laboratórium musí preukázať schopnosť vykonávať jednotlivé skúšky podľa uznávaných (štandardných) analytických metód a postupov pričom laboratórium musí dodržať porovnateľné charakteristiky meraní (presnosť, správnosť, neistotu, medzu stanovenia) Validácia - experimentálne potvrdenie, že navrhnutá metóda zodpovedá zamýšľanému použitiu Zabezpečenie kvality v analytickej chémii Zabezpečenie kvality analytického merania Paralelné vzorky - jedna vzorka rozdelená na dva podiely Preskúšanie uchovaných vzoriek - analýza za niekoľko mesiacov (podľa charakteru analytu) Referenčné materiály - certifikovaný referenčný materiál Certifikovaný referenčný materiál: komerčná výroba, deklarovaná koncentrácia od výrobcu, deklarovaná stabilita a skladovanie Neistota merania (Measurement uncertainity) Neistota je nezáporný parameter charakterizujúci rozptýlenie hodnôt meranej veličiny Odhad neistoty zahŕňa náhodné (neistoty typu A) aj systematické (neistoty typu B) príspevky zo všetkých potenciálnych známych zdrojov Preto je najvhodnejším prostriedkom na vyjadrenie presnosti výsledkov  Neistota typu A - neistota stanovená experimentálne z opakovaných meraní. Štandardná neistota typu A sa rovná smerodajnej/štandardnej odchýlke priemeru nameraných údajov Neistota typu B - neistota stanovená inak ako štatistickými postupmi. Má viacero čiastkových zdrojov a celková neistota typu B vzniká zlúčením čiastkových neistôt typu B. Zdrojmi neistoty typu B v analytických meraniach bývajú napríklad neistota meracích zariadení, neistota referenčných materiálov, neistota tabuľkových hodnôt, neistota podmienok pri meraní (tlak, teplota, konštantnosť zloženia matrice a pod.) Štandardná neistota typu B sa odhaduje ako smerodajná/štandardná odchýlka predpokladaného rozdelenia pravdepodobnosti chýb Analytická chémia Prednáška č.2 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Základné pojmy Vzorka - predstavuje podiel materiálu, s ktorým sa má uskutočniť analýza. Odber vzorky je krok na získanie informácie o zložení objektov. Je súčasť procesu analýzy, ale nie súčasťou analýzy. Analytický chemik nemá zodpovednosť za vzorkovanie. Laborant nemá zodpovednosť za odobratú vzorku Vzorkovanie - je proces získania vzorky a jej prvá úprava potrebná na ďalšie analytické spracovanie. Ide o odborné odobranie vzorky uskutočnené predpísaným spôsobom Protokol o odbere vzorky - identifikačné údaje Odber vzorky Odber vzorky obvykle zabezpečuje zadávateľ, vykonávateľ analýzy má so zadávateľom odber dohodnúť a konzultovať Zásady vzorkovania v SR norma STN 1510 až 1513 Vzorkovanie rôznych typov materiálov: skupenstvo (tuhá, plynná, kvapalná látka) Odber vzorky - biologický materiál S_sérum P_plazma (EDTA, heparín-Li) U_moč dU_zbieraný moč (12/24 hodín) B_plná krv CSF_likvor F_stolica Syf_synoviálna tekutina Iné telesné tekutiny - pleurálna, peritoneálna, punktát, ejakulát Odber biologického materiálu Odber biologického materiálu musí byť vykonaný - legeartis a za sterilných podmienok Zlaté pravidlo používania jednorazových odberových súprav a spotrebného materiálu je základom správnej laboratórnej diagnostiky! Odber biologického materiálu vykonáva zdravotnícky pracovník podľa osobných kompetencií určených príslušným zákonom Pred odberom biologického materiálu je potrebné ako prvé označenie odberovej skúmavky/ nádoby. Zamedzenie chyby identifikácie! Po odbere, urýchlený transport do laboratória (možné výnimky podľa špecifikácie biologického materiálu) Odbery pre biochemické laboratória: sérum / plazma - venepunkcia (odber viacerých skúmaviek pre rôzne vyšetrenia, treba dodržať predpísané poradie) Typy odberových skúmaviek:  Kapilárna krv (cB) - vyšetrenie kapilárnej glykémie, ABR Na vpich je potrebné použiť sterilnú lancetu - rezná rana! Postup pre ABR: (Heparín-Li) Prvú kvapku je potrebné zotrieť sterilným tampónom, potom priložiť odberovú kapiláru šikmo k reznej rane a naplniť ju celú krvou tak, aby nevznikli vzduchové bubliny. Jeden koniec ihneď uzatvoriť klobúčikom. Druhým koncom vložiť do kapiláry kovové teliesko a uzatvoriť klobúčikom aj druhý koniec. Obsah kapiláry ihneď po uzavretí premiešať dlhými ťahmi pomocou magnetu po celej dĺžke kapiláry. V kapiláre nesmú ostať vzduchové bubliny Postup pre glykémiu: (inhibítor NaF) Krv sa odoberá do skúmaviek s obsahom látky, ktorá inhibuje zrážanie krvi a látky, ktorá zabraňuje glykolýze. Pomer činidla a objemu krvi musí byť konštantný. Do komerčne dostupných skúmaviek sa odoberie množstvo, ktoré je uvedené na skúmavke Najčastejšie chyby pri odbere pre vyšetrenie ABR: nedostatočný objem krvi - nie je naplnená celá kapilára prítomnosť množstva vzduchových bublín v kapiláre masírovanie - vytláčanie krvi z miesta vpichu nedostatočné premiešanie transport vo zvislej polohe a bez ľadu  Moč – spontánne vymočený, cievkovanie, punkcia Dôležité predanalytické faktory, poučenie pacienta, výrazne môžu ovplyvniť výsledok vyšetrenia !!! Odber sa vykonáva pri prvom rannom močení do čistej nádoby, ktorá nesmie obsahovať zvyšky čistiacich alebo dezinfekčných prostriedkov tesne pred močením sa pohlavné orgány omyjú čistou vodou prvá časť moču sa vymočí do toalety, do nádoby sa zachytí až stredná časť, posledná časť moču sa vymočí znova do toalety. Na vyšetrenie je potrebné dodať 10 ml vzorky moču.  Zbieraný moč - 12/24 hodín Dôsledná predanalytická fáza, poučenie pacienta, nakoľko zvyčajne moč zberá doma, pri hospitalizovaných pacientoch - jednoduchšie, hlavne edukácia personálu (objem moču hrá veľmi dôležitú úlohu) Pacient sa na začiatku zberného obdobia (napríklad o 6:00 hod.) vymočí do toalety a od tohto času potom všetky porcie moču zbiera do čistej nádoby, poslednú porciu moču na konci zberného obdobia vymočí tiež do zbernej nádoby (napr. o 6:00 hod. nasledujúci deň, ak bol potrebný 24 hod. zber moču) Do laboratória pacient doručí buď celé množstvo moču, alebo vzorku moču, pričom sa na žiadanku uvedie množstvo moču za dané zberné obdobie (diurézu je potrebné zmerať presne)  Stolica - odberová nádoba na stolicu  Iné telesné tekutiny Podľa špecifikácie telesnej tekutiny: Likvor - sterilná odberová nádoba Synoviálna tekutina - sterilná odberová nádoba Punkcie (perikardiálna, pleurálna, peritoneálna) Pot - filtračný papier (dopredu odvážený) v sterilnej nádobe Ejakulát - sterilná odberová nádoba Úprava laboratórnej vzorky Predstavuje spoločné označenie pre všetky činnosti používané v laboratóriu na úpravu vzorky do konečného stavu, ktorý umožňuje vykonanie analýzy, transportu alebo dlhodobého skladovania Úprava vzorky predstavuje kritický krok postupu chemickej analýzy, pretože je nielen časovo náročná a prácna, ale je aj zdrojom najväčších chýb Techniky na úpravu vzorky: riedenie, filtrácia, úprava pH, prídavok štandardu, sušenie, sitovanie, destilácia, homogenizácia, extrakcia, centrifugácia Chemické rozklady vzoriek V rámci postupu analýzy je obvykle previesť tuhé vzorky do roztoku, najčastejšie sa používajú vodné roztoky ak ide o anorganické vzorky Vzorky, ktoré sú len čiastočne rozpustné vo vode, je potrebné rozpustiť prídavkom zriedenej kyseliny alebo hydroxidu Nerozpustné vzorky je potrebné rozložiť - premena na vhodnú formu Rozklad - chemický proces, pri ktorom v dôsledku chemickej reakcie dochádza k úplnej deštrukcii pôvodného materiálu Chemické rozklady vzoriek Rozklad vzoriek sa rozdeľuje: Mokré rozklady (kyseliny, hydroxidy) HCl - rozklad uhličitanovej rudy, horniny, železo HNO3 - farebné zliatiny, technické kovy (Cd, Cu, Pb, Fe) H2SO4 - kovy Zn, organické látky (-NH2) HF - rozklad kremičitanov zmes HCl/HNO3 3:1 (Lúčavka kráľovská) Suché rozklady (spaľovanie, tavenie, spekanie) Chemické rozklady vzoriek Suché rozklady (spaľovanie, tavenie, spekanie) Spaľovanie - v atmosfére alebo v prúde kyslíka, kremenná trubica, normálny tlak / zvýšený tlak Tavenie - rozklad v tégliku, zmiešanie s tavidlom - vznikajú zlúčeniny lepšie rozpustné v kyselinách alebo vo vode Tavidlo: Na2CO3, NaOH, KOH Téglik: Pt, Ni, Fe, porcelán Extrakcia V analytickom kontexte sa ako extrakcia označujú separačné metódy založené na prechode zložiek fázovým rozhraním z jednej fázy do druhej fázy Z kvapaliny do kvapaliny Z tuhej fázy do kvapaliny Z kvapaliny alebo plynu do tuhej fázy (na povrch) Extrakcia kvapalina-kvapalina Technika extrakcie analytov z kvapalnej vzorky do inej kvapaliny Podmienka: navzájom nemiešateľné kvapaliny! Organické látky možno extrahovať priamo do vhodného organického rozpúšťadla alebo zmesi rozpúšťadiel. Anorganické látky sa vo vodnom roztoku vyskytujú vo forme iónov ich extrakcia do nepolárneho rozpúšťadla je pomerne slabá - nutná premena na nenabitú látku (neutrálny komplex) Výťažnosť extrakcie má byť čo najvyššia (viacnásobná extrakcia) Extrakcia kvapalinou z tuhej fázy Z tuhého materiálu sa účinkom vhodného rozpúšťadla rozpúšťa požadovaná zložka (analyt) Macerácia - látka v tuhej fáze sa extrahuje pri laboratórnej teplote opakovanými dávkami rozpúšťadla (použitie pri nestálych latkách, ktoré sa degradujú pri zvýšenej teplote) Digescia - tuhá látka sa extrahuje pri zvýšenej teplote opakovanými dávkami rozpúšťadla pri zvýšenej teplote (rýchlejší proces ako macerácia) Perkolácia - tuhá látka sa extrahuje opakovane rozpúšťadlom Macerácia Digescia Perkolácia - Soxhletov extraktor Iné techniky extrakcie Extrakcia tuhou fázou (SPE) Extrakcia kvapalinou v nadkritickom stave (SFE) Membránové separačné techniky Sú založené na selektívnom transporte určitých látok cez obmedzujúce rozhranie, ktorým je selektívne priepustná membrána Membránové separačné procesy sa klasifikujú na základe hnacej sily, ktorá sa pri separácií uplatňuje Filtrácia - je technika na oddelenie dvoch zložiek zmesí, ktoré sú v dvoch fázach, pomocou priepustného materiálu - pórovitej membrány, ktorým prechádza iba jedna z týchto dvoch fáz. Hnacou silou prechodu zložiek cez membránu je rozdielny tlak na oboch stranách membrány Membránové separačné techniky Ultrafiltrácia - je subtechnika membránovej filtrácie na separáciu zložiek, pri ktorej je hnacou silou hydrostatický tlak, ktorý spôsobuje, že voda a nízkomolekulové zložky prechádzajú cez membránu zatiaľ čo vysokomolekulové zložky cez membránu neprejdú. Princíp separácie je podobný aj pri technikách mikrofiltrácie a nanofiltrácie. Tieto techniky sa líšia len vo veľkosti molekúl, ktoré dokážu oddeliť Dialýza - separačná technika rozdelenia rozpustných zložiek od matrice difúziou cez polopriepustnú membránu (separácia molekúl podľa ich veľkosti). Dialýza je samovoľný pomalý proces, ktorého hybnou silou je koncentračný gradient Analytická chémia Prednáška č.3 RNDr. et. Mgr. Nicholas Martinka, PhD. Trnavská Univerzita v Trnave Katedra laboratórnych vyšetrovacích metód Chemické metódy analýzy Analytické metódy založené na chemických princípoch patria medzi najstaršie používané metódy v kvalitatívnej a kvantitatívnej analytickej chémii Tieto metódy využívajú na získanie analytickej informácie chemické reakcie medzi analytom a chemickým skúmadlom Kvalitatívna analýza anorganických zlúčenín Chemické reakcie medzi skúmadlom a vzorkou je možné rozdeliť na: Skupinové - reakcie, ktoré umožňujú dokázať prítomnosť celej skupiny iónov Selektívne - reakcie, ktoré umožňujú dokázať alebo stanoviť jednu zložku Špecifické - reakcie, ktoré umožňujú dokázať uvažovanú látku v ľubovoľnej zložitej zmesi Kvalitatívna analýza anorganických zlúčenín Prvým krokom analýzy sú predbežné alebo orientačné skúšky s tuhou vzorkou Tavenie Rozpustnosť Tvorba plynu Skúška v plameni - sfarbenie Dôkaz katiónov a aniónov rôznych skupín Katióny  Anióny Skupina Anióny Reakcia na detekciu Zrážacie činidlo Uhličitany (CO₃²⁻), sírany (SO₃²⁻), I. skupina Reakcia s kyselinou HCl (kyselina chlorovodíková) sirovodík (S²⁻) Sírany (SO₄²⁻), fosforečnany (PO₄³⁻), II. skupina Reakcia s báriovými soľami BaCl₂ (chlorid bárnatý) chromáty (CrO₄²⁻) Chloridy (Cl⁻), bromidy (Br⁻), jodidy Reakcia s dusičnanom III. skupina AgNO₃ (dusičnan strieborný) (I⁻) strieborným Dusitany (NO₂⁻), dusičnany (NO₃⁻), Koncentrovaná H₂SO₄ (kyselina IV. skupina Reakcia s difenylamínom chlorečnany (ClO₃⁻) sírová) V. skupina Oxaláty (C₂O₄²⁻), acetáty (CH₃COO⁻) Reakcia s vápnikovými soľami CaCl₂ (chlorid vápenatý) Kvalitatívna analýza organických zlúčenín Pri výbere metódy organickej analýzy zlúčenín je potrebné zohľadniť základné rozdiely v stavbe anorganických a organických zlúčenín Organické zlúčeniny sú charakteristické obsahom len niekoľkých prvkov (uhlík, vodík, dusík, kyslík, síra a halogény) Organické zlúčeniny vo vode nedisociujú a sú prítomné vo forme neutrálnych molekúl Kvalitatívna analýza organických zlúčenín Na identifikáciu organickej zlúčeniny nepostačuje určenie molekulového vzorca zlúčeniny, ale je potrebné určiť vnútornú stavbu - funkčné skupiny Rozdelenie analýzy organických zlúčenín: Elementárno-analytické - určujú prvkové zloženie látky umožňujú vypočítať empirický vzorec Molekulárno-analytické - určenie charakteristiky látky (teplota topenia, teplota varu, hustota, index lomu, optická aktivita, spektrálne vlastnosti) Kvalitatívna analýza organických zlúčenín Štruktúrno-analytické - skúmanie prítomnosti funkčných skupín, fragmentov molekúl a štruktúry molekuly Pri analýze neznámej organickej látky vykonávame senzorické skúšky (skupenstvo, farba, zápach, tvar kryštálov) pričom tieto informácie poskytujú cenné informácie o charaktere látky Skúška rozpustnosti - sledovanie rozpustnosti neznámej organickej látky v rôznych rozpúšťadlách (voda, éter, kyseliny, zásady) Kvalitatívna analýza organických zlúčenín Rôzne dôkazy prvku v organickej zlúčenine: Dôkaz uhlíka, síry, a halogénov - premena na anorganické látky, následne dôkaz kyanidového aniónu, sulfidového aniónu, a jednotlivých halogenidov Dôkaz kyslíka - termický rozklad v prúde dusíka, redukcia olova Dôkaz uhlíka, vodíka - oxidačné spaľovanie v prúde kyslíka, v prítomnosti CuO ako katalyzátora. Vzniknuté produkty sa určia gravimetricky Kvalitatívna analýza organických zlúčenín Dôkaz dusíka (Dumasova metóda) - redukcia dusíka na žeravej medenej špirále - vznik elementárneho dusíka Dôkaz dusíka v bielkovinách (Kjeldahlova metóda) - zohrievanie vzorky s kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora, organické zlúčeniny, ktoré obsahujú dusík sa prevedú na amónny katión - stanovenie celkového obsahu titračne Elementárna analýza - inštrumentálna metóda Spaľovanie vzorky v prúde kyslíka pri teplote 990 stupňov v trubici naplnenej katalyzátorom CuO za vzniku reakčných produktov CO2, H2O, NOx, SOx Vzniknuté produkty sa zavedú do redukčnej komory, Cu piliny zohriate na 660 stupňov pričom sa jednotlivé produkty redukujú na N2, SO3, SO2, Chromatografická analýza Stanovenie kyslíka vyžaduje špeciálne podmienky Odmerná analýza Odmernou analýzou sa označujú metódy stanovenia látok založené na zistení objemu skúmadla (titrantu) s presne známou koncentráciou na úplne zreagovanie stanovovanej látky (titrandu) v analyzovanom roztoku Analytickým signálom je spotrebovaný objem skúmadla, preto sa metóda nazýva aj volumetria Stav, pri ktorom práve kvantitatívne prebehne reakcia medzi stanovovanou zložkou a skúmadlom sa nazýva bod ekvivalencie Odmerná analýza Metódy odmernej analýzy podľa typu využitia chemickej reakcie delíme na: Acidobázické (neutralizačné) titrácie - sú založené na protolytických reakciách medzi odmerným roztokom a analytom. Ak je odmerný roztok kyselina hovoríme o acidimetrii, ak zásada hovoríme o alkalimetrii Komplexometrické titrácie - sú založené na komplexotvorných reakciách medzi iónom kovu M a ligandom L, pri ktorých vznikajú málo disociované komplexné zlúčeniny ML Odmerná analýza Zrážacie titrácie - sú založené na zrážacích reakciách medzi iónmi M a X, ktoré poskytujú málo rozpustné zlúčeniny Oxidačno-redukčné titrácie - sú založené na redoxnej reakcii medzi titrandom a titrantom. Ak je odmerný roztok oxidovadlo hovoríme o oxidometrii, ak je redukovadlo hovoríme o reduktometrii Odmerná analýza Chemická reakcia využívaná v odmernej analýze ma byť: Kvantitatívna - chemická rovnováha má byť posunutá v smere tvorby reakčných produktov Dostatočne rýchla, aby sa po každom prídavku titrantu rýchlo dosiahla rovnováha Jednoznačná, aby sa dala opísať chemickou rovnicou Stechiometrická, aby sa dal urobiť prepočet látkového množstva titrantu na látkové množstvo titrandu Spoľahlivo indikovateľná z hľadiska určenia bodu ekvivalencie Odmerná analýza - titračná krivka Titračná krivka je grafické zobrazenie závislosti pH roztoku od objemu pridaného titračného činidla (titru) Slúži na vizualizáciu priebehu titrácie a je užitočná na stanovenie bodu ekvivalencie, teda bodu, v ktorom sú všetky molekuly analyzovaného roztoku (titrovaného roztoku) úplne zreagované s pridaným činidlom Odmerná analýza - typy titračných kriviek 1.Silná kyselina a silná zásada: Krivka má strmý prechod v oblasti okolo bodu ekvivalencie, kde pH rýchlo stúpa alebo klesá 2.Slabá kyselina a silná zásada: Krivka začína v nižšom pH, ale bod ekvivalencie je v mierne zásaditej oblasti (pH > 7). Pred bodom ekvivalencie má krivka pufrovaciu zónu 3.Silná kyselina a slabá zásada: Krivka začína s nízkym pH a bod ekvivalencie je v mierne kyslej oblasti (pH < 7) 4.Slabá kyselina a slabá zásada: Krivka nemá výrazný strmý prechod, ale bod ekvivalencie môže byť veľmi nepresný a obtiažne detekovateľný Odmerná analýza - tvar titračnej krivky 1. Začiatočná fáza: Keď sa začne pridávať titračné činidlo, pH sa mení len mierne 2. Pufrovacia oblasť (ak je prítomná): Pri titrácii slabej kyseliny alebo zásady dochádza k pufrovaniu, kde pH roztoku zostáva relatívne stabilné 3. Bod ekvivalencie: Náhle a strmé zvýšenie alebo pokles pH, ktoré signalizuje, že všetky molekuly analyzovaného roztoku zreagovali s činidlom 4. Konečná fáza: Po dosiahnutí bodu ekvivalencie sa pH opäť stabilizuje a reaguje menej výrazne na ďalší pridaný titrant  Odmerná analýza Indikátory Odmerná analýza - titrácia Vážková analýza - gravimetria Technika opísaná už v starom Egypte, rozmach 19. storočie Vážková analýza nevyžaduje zvláštne zariadenia, je však náročná na kvalitu laboratórnej práce Experiment musí splniť dve prísne podmienky: úplné vylúčenie analytu vo forme zrazeniny a jej úplne oddelenie, pričom je potrebné získať chemicky presne definovaný čistý produkt Nevýhodou je čas potrebný na analýzu 3-48 hodín, veľmi skúsený pracovník Vážková analýza - gravimetria Pri vážkovej analýze sa stanovovaná látka najprv kvantitatívne vylúči z roztoku vo forme čistej a málo rozpustnej zrazeniny, ktorá sa nazýva vylučovacia forma Vytvorená zrazenina sa nechá postáť istú dobu na teplom mieste, je potrebné aby vznikla hrubozrnná dobre filtrovateľná zrazenina. Filtrácia môže prebiehať za normálneho alebo zníženého tlaku Následne treba zrazeninu premeniť na vážiteľnú formu so známym chemickým zložením, určenú pre meranie hmotnosti vážením Vážková analýza - gravimetria Táto premena sa vykonáva tepelným spracovaním oddelenej zrazeniny vysušením alebo žíhaním do konštantnej hmotnosti Sušenie sa zvyčajne vykonáva v elektrickej sušiarni pri teplote 60-150 stupňov. Sušením sa zrazenina zbaví prebytočného rozpúšťadla Žíhaním pri vysokej teplote 500-1200 stupňov sa zrazenina premieňa na novú látku, chemicky odlišnú od vylúčenej formy Žíhanie prebieha v porcelánovom alebo kovovom tégliku Vysušená alebo vyžíhaná látka sa nechá vychladnúť v exsikátore