단일 클론 항체 개발 접근법 PDF

급하면 하이라이트 친 기술 위주로 보기 4.5 표적 단일 클론 항체 개발을 위한 접근 단일 클론 항체의 종류 대표적으로 human mAb(51%), 4.5.2 Phage Display humanized mAb(34.7%, CDR만 쥐꺼) Phage display 는 시험관 내에서 항체를 선택할...

급하면 하이라이트 친 기술 위주로 보기 4.5 표적 단일 클론 항체 개발을 위한 접근 단일 클론 항체의 종류 대표적으로 human mAb(51%), 4.5.2 Phage Display humanized mAb(34.7%, CDR만 쥐꺼) Phage display 는 시험관 내에서 항체를 선택할 때 주로 항체 생산 기술에는 크게 1) Transgenic animal을 이용하 사용되는 기술. 박테리오 파지 표면에 항체의 가변영역을 는 방법 2) Phage Display 3) Single B cell분리, PCR로 Ig 발현하여 특정 항체를 선택. 유전자 증폭하는 방법이 있음. 1) Phage display vector 만들기 Phage display 라이브러리에서 단일 클론 항체를 식별하 기 위해 항체 라이브러리를 생성.  인간 말초혈액 단핵 4.5.1 XenoMouse hybridoma 기술 세포 (PBMC)로부터 항체의 가변 영역을 암호화하는 유전적으로 변형시킨 쥐를 사용해 인간 항체를 생성하는 RNA를 추출  cDNA로 역전사 PCR을 이용해 항체의 기술. 특정 항원을 표적으로 하는 항체를 대량 생산할 때 가변 영역 유전자를 포함하는 cDNA를 증폭 증폭된 가 사용 변영역의 중쇄 및 경쇄 유전자를 파지 벡터 phagemid 에 삽입  유전자가 박테리오파지의 외피 단백질 pⅢ에 1) Xenomouse 만들기 융합되어, 파지 표면에 ‘항체의 Fab’ 또는 ‘single chain 일반 쥐의 줄기세포에서 쥐의 immunoglobulin 유전자를 variable fragment 형태’로 발현. 제거하여 쥐가 자체적으로 항체를 생성하지 못하게 함.  2) 항체 선별 단계 인간 중쇄 또는 경쇄 DNA를 운반하는 인공 염색체를 배 아줄기세포에 삽입합니다 ( 쥐 immunoglobulin 유전자 대신에 라이브러리에서 생성된 박테리오파지를 항원과 접촉시켜 인간 immunoglobulin 유전자를 도입하여 인간 항체를 생성할 수 있도 항원에 결합하는 박테리오파지만 선택하고, 결합하지 않 록 ) 은 파지는 세척하여 제거, 증폭하는 과정을 반복하는 2) Hybridoma기술 ‘Panning 과정’으로 친화도가 높은 항체를 가진 파지만을 선택  선택된 파지에서 항체의 Fab 영역이나 scFv 형 면역반응이 유도된 XenoMouse 의 비장에서 항체를 생 태의 유전자를 전체 IgG 항체로 변환하여 “Human 단일 성하는 B 세포를 분리.  비장세포는 수명이 짧아 골수 클론 항체를 형성” 종 세포와 융합해 극복  융합된 세포가 hybridoma 세 포 완전한 인간 항체를 생성. 4.5.3 Transgenic mice를 이용한 human mAb 생산 분리된 단일 B 세포의 IgH(중쇄)와 IgL(경쇄) 유전자를 RT-PCR로 증폭해 클로닝에 사용 트랜스제닉 마우스는 인간 면역글로불린 유전자를 삽입하 여 인간형 항체를 생산할 수 있게 만든 쥐. 3) 재조합 단클론 항체 발현 Human Anti-Mouse Antibodies에 의한 면역반응을 없애 증폭된 유전자를 포유동물 세포주(예: HEK293)에서 발현 기 위해 쥐에서 인간 항체를 바로 얻기 위한 기술. 시켜 단클론 항체를 생산. 역사가 나옵니다…. 다시 역사… 1985년, transgenic mouse에서 면역글로불린 유전자가 1984년, Epstein-Barr Virus(EBV)를 사용하여 B 세포를 어떻게 조합되고 발현되는지 규명 (쥐를 이용하는 이유는 불멸화하고 단클론 항체를 생성하는 기술을 개발. (B세포 클 유전자 조작 용이, 빠른 번식, 비용 저렴, Ig 발현 매커니 론화 가능하나 생산 효율이 낮고 특정 항체만 생성 가능) 즘이 인간과 유사하기 때문) 1993년, 단일 B 세포의 유전자 조합과 돌연변이를 미세 1989년, 인간 IgH를 삽입한 transgenic mouse를 통한 조작, 소량 PCR 기술을 통해 분석. 단일 세포 수준에서 인간형 항체 생산 (일부 세포가 인간과 쥐 IgH를 동시 발현하는 혼 면역 반응의 유전적 다양성을 이해하는 데 기여. 합형 항체문제, 유전자좌의 제한으로 다양한 항체 확보가 어렵다는 문제 2000년, 단일 B 세포에서 유전자를 증폭하고 재조합 항 가 있음) 체를 생성하는 RT-PCR 기반 기술을 도입. 높은 민감도, 1993년, 최초로 쥐에서 인간항체 생산. IgH 유전자를결실 정확성으로 다양한 항체 생성 가능. 시킴. Bcell이 IgL chain의 조립을 시작하려면 IgH chain 2009년, 고속 미세배열 칩과 마이크로엔그레이빙 기술을 이 필요함을 확인. 활용하여 단일 세포 기반 항체 선별 및 생산 가속화 1994년, 인간 IgH와 Igκ 유전자를 쥐에 삽입하여 인간 2010년, 점막 조직 단일 항체 분비 세포 활용 mAb 제 항체를 생산할 수 있는 시스템 구축. 인간형 항체 생산이 작. 가능해졌고, 치료용 항체 개발의 가능성이 열림. (여전히 일 부 세포가 인간과 쥐 IgH를 동시 발현하는 혼합형 항체문제, 유전자좌 2016년, 뎅기열 항체 생성 특이적 기억 B Cell에서 mAb 의 제한으로 다양한 항체 확보가 어렵다는 문제가 있음) 개발.. 1997년, 처음으로 XenoMouse 기술 도입해 2018년, 칸디다증을 표적으로 하는 단클론 항체를 개발 Humanized mAbs 생성. 하며, 특정 감염병 치료에서도 활용될 수 있음을 증명. 2007년, Panitumab과 같은 humanized mAbs가 FDA 4.5.5 Humanization of mAbs 승인받는 등 XenoMouse 기술을 활용한 항체들이 상업 적으로 성공을 거두며, 치료제 개발에 널리 활용됨. mAbs 장점: 쉽고 빠르게 얻을 수 있다. 싸다. Humanization하는이유: HAMA에 의한 면역반응피하려 4.5.4 B cell 기반 항체 기술 4.5.6 Humanized mAbs 생성과정 개별 B 세포에서 항체 유전자를 직접 분리하여 클로닝, 발현해 단클론 항체를 생산. Hybridoma 기술에 비해 신 속하고 효율적. 1) 항원 특이적 B 세포 분리 면역반응을 개선하기 위해 쥐항체의 CDR만을 남기고 나 면역화된 동물이나 환자의 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 머지 부분을 인간 항체로 대체한 것. 약 90% 이상이 인 서 유세포 분석(FACS)를 사용하여 항원과 결합하는 B 세 간 항체 서열로 구성되어 면역원성이 크게 감소. 포를 선택적으로 분리 2) RT-PCR을 통한 항체 유전자 증폭 1) CDR이란? (상보성 결정 영역 = 초가변영역) 항체의 결합 특이성, 친화성을 결정하는 중요한 부분. 경 7. ELISA 테스트를 통해 잘만들어진(Positive) 클론을 식 쇄와 중쇄에 각각 3개씩 총 6개의 CDR이 있음. 각각은 별 돌출된 loop구조를 가져 항원과 상호작용함. 특히 CDR3 영역이 항원과의 결합에서 중요함. (길이와 아미노산 조성의 변화가 항체의 특이성과 친화성에 큰 영향을 미치기 때문) 2) CDR grafting (humanization 기술) CDR을 비인간 항체에서 인간항체로 옮기는 기술. 1. Mouse B 세포 하이브리도마에서 쥐 항체를 생산 쥐 항체의 가변 영역을 클로닝, 서열 분석(항원 결합을 담 당하는 가변 영역의 중요한 cDNA 서열 확보) CDR 접합 인간 가변 영역을 설계(항원 특이성을 유지하기 위해 쥐 서열의 어떤 부분을 인간 프레임워크에 접합할지 결정) 2. IMGT (The international ImMunoGeneTics information system)라는 데이터베이스에서 가장 비슷한 인간프레임 워크를 검색해서 정함. 3. CDR 접합 인간화된 중쇄와 경쇄 구조체를 생성 ( 쥐 CDR = murine CDR + 인간 항체 프레임워크) 4. CDR 루프 구조 유지 평가 인간 프레임워크와 쥐 CDR 간의 상호작용을 평가하여, 3) H- Score (+ H-score보단 Z-score가 더 중요하다고 하심) CDR 루프의 구조를 유지하는 데 필요한 중요한 잔기를 Humanization 과정에서 생성된 단일클론항체의 확인. humanness를 평가하는 지표. 특정 항체의 서열이 인간 5. 주요 잔기의 역돌연변이 설계 항체 서열과 얼마나 유사한지를 수치화 평가를 통해 필수적인 쥐 잔기를 돌연변이로 복원해 항체 - 100에 가까울수록 인간 항체와 유사성이 높은 의 결합 성능을 최적화. 것을 의미. 6. 클로닝과 발현 - H-score는 Z-score라는 통계학적 기법 기반 수 치를 통해 계산됨. (ex. GluAsp 유사하니 높은 점수, 이렇게 만들어진 재조합 항체를 일시적으로 형질 도입된 GluHis 0점에 가까운 점수) 포유동물 세포에서 인간화된 발현 구조체를 사용해 발현. 4) Humanized mAbs의 예시 * Humanized mAbs는 –zumab이라는 접미사를 사용 1. 다클리주맙(Daclizumab) 1997년 미국 FDA 승인을 받은 최초의 humanized 단클 B cell + Myeloma cell이 conjugate된 형태의 론항체. 장기 이식 거부반응을 예방하는 데 사용됨. IL-2 Hybridoma 수용체(Interleukin-2 receptor)의 a-subunit(CD25)에 특 이적으로 결합. 1. DNA immunization 이후 다발성 경화증에도 사용되었지만, 2018년, 유럽에서 자가면역성 뇌염 사례가 보고, 시장에서 철수 DNA로 면역화된 B 림프구는 골수종 세포에서 발현된 항 원을 통해 효율적으로 선택됨. 2. 레카네맙(Lecanemab) - 초기 알츠하이머병 치료 2. Electric pulse를 통한 융합 3. 트라스투주맙(Trastuzumab) - HER2 양성 유방암 및 위암 치료. Electric pulse에 의해 선택적으로 융합해 목표로 하는 입 체특이적 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 4. 오말리주맙(Omalizumab) -중증 알레르기성 천식 및 생성. 만성 특발성 두드러기 치료. 4.5.7 Human mAbs 와 Humanized mAbs 두 종류의 항체를 대상으로 한 직접 비교 임상시험 (head-to-head trials)이 부족한 상황. 둘 사이에서 전반적인 임상 효능(clinical efficacy)과 안전 성 프로파일(safety profile)에 미치는 영향은 크지 않았음.  Humanizeation 여부와 관계없이 모든 단일클론항체 는 세포 수준에서 동일한 효과를 나타내며, 안전성과 효 율성 측면에서 그 의학적 영향을 개별적으로 평가해야 함 세계보건기구(WHO): “구조적 분류(예: 키메라, 인간화, 완전 인간 항체)에 관계 없이, 각 mAb는 안전성, 효능, 임상적 결과에 따라 개별 적으로 평가되어야 한다”  mAbs의 치료 효과는 항체의 분류보다 표적 항 원(target antigen), 약물동태학 (pharmacokinetics), 그리고 특정 면역학적 상 호작용에 의해 더 크게 좌우된다는 것을 의미 4.5.8 입체특이적 mAbs 1) mAbs가 인식하는 Epitope의 종류 1차 구조(2D)를 이루는 linear epitope / 2차 or 3차 구조 (3D)를 이루는 conformational epitope conformational epitope이 더 우수하다. (Linear epitope는 folding에 의해 가려지기 쉬워서 제한된 영역에 대해서만 친화 성을 가질 수 있기 때문) 2) 입체특이적 표적화 기술(Stereo-Specific Targeting, SST) Hybridoma 기술을 기반으로 입체특이적 단일클론항체를 생산하는 것. 4.6 mAbs의 약물전달시스템 mAbs 약물전달시스템에는 1) Nanoparticles 2)Microspheres 3) Hydrogels 4) Silica를 주로 사용 4.6.1 Nanoparticles Nanoparticle은 크기가 10에서 1000nm 사이인 입자형 s/o/w(solid-in-oil-in-water) emulsion을 이용하면 IgG 약물 전달 시스템. 또는 mAb의 안정성을 손상시키지 않으면서 microsphere 제조 가능 주로 PLGA(Poly lactic co-glycolic acid)라는 생분해성 고 분자를 사용해 제작. (생체 내에서 글리콜산과 젖산으로분해되 s/o/w(solid-in-oil-in-water) emulsion과 분무건조법을 며, 쉽게 대사되기 때문) 병용했을때 IgG를 PLGA 마이크로스피어 핵에 성공적으 로 포집할 수 있었음. . 포집 효율이 60%(w/w),약물 로딩은 6% PLGA 기반 나노입자는 임상 시험, 백신, 항암제, 항염증 (w/w)개선 제 등에서 자주 사용됨. PLGA 농도가 증가함에 따라 약물 방출 속도는 줄어들고, Ex1) Free anti-OX40 mAbs와 비교했을 때, PLGA 기반 포집효율은 증가. 나노입자로 로딩된 mAbs는 활성화된 T 세포에 주로 발 현되는 종양괴사인자(TNF) 수용체 OX40을 더 효과적으 로 표적으로 삼음  Nanoparticle을 이용해 세포독성 T 림프구, 즉 CTL의 발달, 사이토카인 생성,종양 항원 특이적 세포독성을 촉진 가능. Ex2) 3D8 scFv 형태의 mAb 단편을 PLGA 나노입자에 로딩했을 때, 세포 내 흡수 증가. Ex3) PLGA를 적용한 자기 유사성 베바시주맙 나노입자는 폐암세포인 A549에서 폐섬유아세포인 MRC-5보다 약 3 배 더 많이 섭취되었습니다. 이때 암 세포는 일반 세포보 1. PLGA Microsphere 다 코팅되지 않은 mAb 나노입자를 더 잘 흡수  anti-human TNF-α mAb 포집 microsphere, s/o/s 공  항암제로의 개발 가능성 정을 통해 제조되었고 생체 활성 물질 및 mAb를 loading 가능함을 확인. 4.6.2 Microsphere  중간엽 줄기세포와 anti-BMP2 mAbs를 alginate microsphere에 포집했고 약제의 골형성능이 개선됨. 1) IgG-MPEG-PCL-MPEG microspheres 2. EVAc (Ethylene-vinyl acetate copolymer) microsphere PEG-PCL공중합체를 이용해 이중 유화 용매 증발법으로 얻을 수 있음.  에틸렌-비닐아세테이트 공중합체(EVAc)가 건조 분말 형태의 IgG를 loading해 효율적으로 항원을 전달하는데 IgG-PCL microsphere보다 더 낮은 IgG 불안정화율과 더 사용됨. 높은 포획 효율을 보임.  국소 투여, 지속 방출, 주사제, 장기 방출 IgG 등 다 양한 방식으로 사용 가능  EVAc 마이크로스피어 응용예로는 vaginal ring을 이용 한 질 전달 시스템이 있음. 쥐 모델에서 항체를 전달하는 데 사용됨. 1) 이온간의 상호작용 2)소수성 상호작용 3)수소결합에의 한 가교로 구분됨 3. PLA(Poly-L-lactic acid)와 hydrogel의 비교  수술 후 카르복시메틸셀룰로오스로 만든 수성겔을 국 소적으로 적용하면 효과적인 항감염 목적으로 국소 항체 4) Hydrogel의 방출 매커니즘 (7) 전달 가능 약물의 방출 매커니즘은 polymer들 간의 network와 단  히알루론산 공유결합 항체 하이드로겔을 통해 CNS로 백질의 특성에 따라 크게 7가지로 분류 항체를 안정적으로 전달할 수 있음. Hydrodynamic radius: 단백질의 직경과 그 주변의 단백질과 같은 유체 역학적 특징을 갖는 용매까지 포함하는 개념 Pore: polymer들이 만드는 mesh의 구멍 4.6.3 Hydrogel 1. Diffusion 수용성 고분자가 물리적 또는 화학적 결합에 의해 3차원 망상구조를 형성하여, 수용액 상에서 용해되지 않고, 물을 Pore가 단백질의 hydrodynamic 다량으로 함유하고 있는 구조체. radius보다 큰 경우 driving force로 작용 확산 속도는 protein size와 hydrogel 내 자유수 함량에 의해 결정됨 Pore가 hydrodynamic radius보 다 작은 경우에는 swelling, degradation이 방출에 주요하게 1) 장점 작용 생체조직의 세포외 기질(extracellullarmatrix)과 유사한 2. Swelling 구조적 특성을 가져 생체적합성이 뛰어남 Swelling-controlled system은 matrix내 물의 함량과 약 다양한 형태로 제조 가능. 물의 분산도에 의해 조절됨. Swelling은 polymer의 유동 서방형 조절을 통해 1회의 하이드로겔의 주입만으로 여러 성을 높이고 pore의 크기를 증가시켜 약물의 이동성이 번의 약물을 주입해야 했던 기존의 불편함을 극복, 복약 증가. 순응도 높일 수 있음 3. Degradation 난용성 약물의 용해도를 증가시켜 약물을 효과적으로 전 Degradation-controlled system에는 주로 생분해성 달시킬 수도 있습니다. polymer가 활용되며 이러한 고분자가 분해되면서 matrix 에 갇혀있던 약물이 방출 2) 한계점 4. Stimuli 약물을 봉입하기 어렵고 초기에 빠른 약물 방출을 보이는 특정 온도나 pH에 도달했을 때 경우가 많음, 치료적 지수(therapeutic index)만큼 균일한 gel 구조에 변화가 생겨 약물이 약물 방출 유도가 어려움 + 규격화하기 어렵 방출 5. Affinity 3) 제조 원리 Polymer와 약물의 친화도 조절 물리적 가교는 화학적 가교와 달리 별도의 화학첨가제나 6. Covalent bond 복잡한 과정이 필요하지 않아 제조가 용이. 생체 이용에 linker를 이용해 단백질과 더 적합. 화학적 가교에 비해서는 강한 부착력과 기계적 polymer 간에 공유결합을 형성 강도를 갖지 못함. 7. Mutiple Carrier 4.6.4 Mesophorous Silica Matrix내에 nanoparticle과 같은 carrier에 약물을 담아 pH 가 7.4 인 용액(PBS)에서 평균 직경이 이용 2~50nm(mesophorous)인 실리카와 베바시주맙간의 5) Hydrogels을 이용한 성장인자 기반 상피조직치료제개 전기적 인력을 이용해 실리카를 carrier 로 활용한 실험 발에 대한 연구  최대 30 일까지 베바시주맙의 방출이 지연됨. 성장인자들은 반감기가 짧아 치료용으로 사용하기 어려움 (2~10분 정도) 성장인자를 하이드로겔에 포획하여 제어 된 방식으로 전달함으로써 특정 조직으로의 지속적인 방 출을 유도하는 방법이 연구되고 있음. 4.7 mAbs 제제화의 한계 상피세포성장인자(EGF)와 curcumin(항산화제)을 봉입한 1. 단백질이 물리적 스트레스에 매우 민감해 개발의 모든 나노 전달체가 들어있는 Hydrogels을 조직 재생에 활용 단계에서 구조적인 변화가 나타나고 쉽게 분해, 응집됨. 한 실험. 2. 비본래 단백질을 제거해야 함 시험관 내 약물 방출 특성(In vitro drug release profile) 3. 용액 형태에서 용량이 균일하지 않을 수 있음 EGF-Cur Hydrogel에서 약물 방출이 가장 느리게 나타남. 4. 특정 cell에서 제조된 mAbs에서 byproduct가 나오거 나 면역원성을 가질 수 있음 4.8 mAbs의 치료적 응용과 전망 1) 단클론항체의 치료적 응용 1. 편두통 치료, Anti-CGRP 수용체 항체 편두통을 유발하는 신경 전달 경로를 차단, Erenumab 2. 고지혈증 치료, Anti-PCSK9 항체 쥐 상피의 일부를 제거하고 약물을 투여한 EGF-Cur를 콜레스테롤을 처리 하는 효소의 활성을 조절해 혈중 콜레 Hydrogel로 만든 sample에서 조직 재생이 가장 빠르게 스테롤 수치를 낮춤, Evolocumab 나타남.  성장인자 기반 상처 치료제의 개발 가능성을 확인 3. X연관 저인산혈증 치료, Anti-FGF23 항체 뼈의 건강을 유지하고, 골질환과 관련된 문제를 해결, Burosumab 4. 류마티스 관절염 치료, Anti-IL6R 항체 염증을 유발하는 경로를 억제해 관절염 증상을 완화, Sarilumab 5. 혈우병A, Anti-IXa/Xa 항체 혈액 응고를 조절, Emicizumab 6. 혈전성 혈소판 감소 자반증(TTP), Anti-폰 빌레브란트 인자 항체 혈액 응고를 조절하여 질환의 진행을 막는데 기여 2) 치료용 단클론항체의 분자적 기전 1. 네이키드 항체 (Naked mAbs) 질병 치료를 위해 추가적인 변형 없이 직접 사용 되는 항 체. 특히 암 치료에서 중요한 역할. 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 기전에서는 자연살해세포 (NK cell)과 같은 effector cell이 암세포를 공격 보체 의존성 세포 독성(CDC) 기전에서는 보체 시스템이 활성화되어 암 세포를 공격, 막 공격 복합체(MAC)형성 유도 2. 이중 특이성 항체 (Bispecific mAbs) 두 가지 서로 다른 항원에 결합. 한쪽은 암 세포 표적에, 다른 한쪽은 effector cell에 3. 결합형 단클론항체 (Conjugated mAbs) 약물, 방사선, 또는 특정 입자와 결합해 종양 세포에 직접 부착 (1)면역 체크포인트 차단 4. 면역 결합 단클론항체(Immunoconjugated Monoclonal Antibody) PD-1 또는 CTLA-4를 차단하여 T세포 활성화를 유도 (1) 리간드-수용체 결합 차단 (세포신호전달 방해) (2) 약물 전달 (2) 세포자살 유도 (종양세포를 죽임) 약물이 결합된 항체를 통해 특정 약물을 전달 (3) 수용체의 결합 억제 (세포의 비정상적 활성 막음) (3) SiRNA 전달 SiRNA 입자를 사용해 특정 유전자를 억제 mAbs의 향후 연구 방향은 치료법의 효율성과 특이성을 (4) 방사선 전달 높이는데 집중될 것. 환자 맞춤형 치료법 개발과 유전자 방사성 동위원소를 항체와 결합시켜 암 세포에 방사선을 의 분자적 분석을 통해 개별화된 접근이 시도될 것으로 직접 전달 보임. (5) 면역 독소 독성 약물을 항체에 결합해 종양 세포에 전달