5-DNA replikasyonu (EBUBEKİR) (2 saat)-(1. bölüm).pdf

DNA’nın Replikasyonu Prof. Dr. Ali İrfan GÜZEL Doç. Dr. Ebubekir DİRİCAN BŞEÜ-Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı 09.01.2024-SALI (10.30) Öğrenim Hedefleri Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonunun nasıl gerçekleştiğini açıklar. DNA replikasyonunda görev alan enzimleri sayar ve...

DNA’nın Replikasyonu Prof. Dr. Ali İrfan GÜZEL Doç. Dr. Ebubekir DİRİCAN BŞEÜ-Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı 09.01.2024-SALI (10.30) Öğrenim Hedefleri Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde DNA replikasyonunun nasıl gerçekleştiğini açıklar. DNA replikasyonunda görev alan enzimleri sayar ve görevlerini açıklar. Telomer ve telomerazı tanımlar. Telomerlerde DNA replikasyonunu açıklar. DNA replikasyon inhibitörlerini açıklar. REPLİKASYON NEDİR? DNA’nın Kopyalanması (Replikasyonu) (DNA Replication) Canlılar, bütün fonksiyonlarını düzenli bir şekilde yürütebilmeleri için mükemmel bir mekanizmaya sahiptirler.  Bu fonksiyonlarından en önemlisi hücre bölünmeleri sırasında Genetik Materyalin (DNA’nın) yavru hücrelere aktarılması için yapılan kopyalama (replikasyon) işlemidir.  DNA molekülünün Kopyalanması (Replikasyonu) demek; mevcut molekülün aynısından bir tane daha yapılması demektir.  Yani insan hücreleri için düşünecek olursak, 46 kromozomdan (kromozomlar DNA moleküllerinden oluştuğu için) 46 tane daha yapılması demektir.  Genetik materyalinin bütünlüğü ve devamlılığının sağlanabilmesi için, kopyalanma işleminin HATASIZ ve TAM (bire bir) olması gerekmektedir. Hücrelerin sahip olduğu DNA replikasyon mekanizması, genetik materyalin doğru bir şekilde kopyalanabilmesi için gereken bütün bileşenlere sahiptir.  Bu mekanizmanın bileşenlerinden herhangi birinin hatalı çalışması, hücrenin normal fonksiyonlarında hataya veya hücre ölümüne neden olabilmektedir. DNA REPLİKASYONU HÜCRE SİKLUSUNUN HANGİ FAZINDA GERÇEKLEŞİR?  Her hücre döngüsünde S evresinde gerçekleşir. 2n=46 2n=46 2n=46 Hücrelerdeki DNA replikasyon mekanizmasının nasıl işlediği sorusu bilim insanları arasında epeyce tartışılmış ve bir takım modeller ileri sürülmüştür.  Ancak DNA iplikleri arasındaki tamamlayıcı baz eşleşmesinin anlaşılması (Watson-Crick modeli), replikasyonun nasıl gerçekleştiği sorusuna da moleküler bir çözüm getirilebilmesini sağlamıştır.  Buna göre DNA molekülünün iki ipliğinin birbirinden ayrılabileceği ve yeni ipliğin sentezi için kalıp olabileceği fikri ileri sürülmüştür.  Bu model, ‘’her yeni DNA molekülünde atasal DNA ipliklerinden birisi korunduğu için, semikonservatif (yarı korunumlu)’’ olarak adlandırılmaktadır. Watson-Crick DNA modeline de uygun olduğu için günümüzde de kabul gören model semikonservatif DNA replikasyon modeli olmuştur. semikonservatif DNA replikasyon modeli DNA REPLİKASYON MEKANİZMASI ile İLGİLİ ÖNE SÜRÜLEN DİĞER MODELLER HANGİLERİDİR? Yarı korunumlu Korunumlu DNA çift sarmal yapıdan ayrılarak tek zincirli hale gelir ve her zincir kendisinin kopyasını yaparak 2 DNA molekülü oluşturur. DNA çift sarmal haldeyken kendi etrafında dönerek bir ucundan diğer ucuna kopyasını oluşturur. Parçalı DNA kopyalanma sırasında kırılır ve kırılan DNA parçaları iki yeni çift sarmal içine dağılır. DNA Replikasyonu ile ilgili ileri sürülen modeller PROKARYOTLARDA DNA’NIN SEMİKONSERVATİF REPLİKASYON MODELDE OLDUĞU NASIL BELİRLENMİŞTİR?  Maselson ve Stahl-Semikonservatif DNA replikasyon deneyi (1858) 1958 yılında Maselson ve Stahl tarafından yapılan ve DNA’nın, yoğunluğunu değiştiren izotoplarla işaretlenmesine dayanan bir deneyle desteklenmiştir.  Bu deneyle prokaryotlarda DNA replikasyonunun şeması tam olarak ortaya konmuştur. Bu deneyde: E. coli bakterileri azotun normalde bulunan hafif izotopu (14N) yerine, ağır izotopunun (15N) bulunduğu ortamda üretilmiştir. Bu bakterilerin 15N içeren DNA’sı, 14N’lü ortamda üretilen bakterilerinkine göre daha ağır olduğundan CsCl yoğunluk gradienti santrifügasyonu ile ayırt edilebilmekteydi. Bu şekilde ağır DNA’nın (15N), hafif DNA’dan (14N) ayırt edilebilmesi, DNA replikasyonunu deneysel olarak çalışılabilmesini mümkün kılmıştır. ÖKARYOTLARDA DNA REPLİKASYONUN SEMİKONSERVATİF MODELDE OLDUĞU NASIL ANLAŞILMIŞTIR? Ökaryotlarda Yarı-Saklı (Semikonservatif) Replikasyon J. Herbert Taylor, Philip Woods ve Walter Hughes 1957’de Maselson ve Stahl’ın çalışmasının yayınlanmasından bir yıl önce ökaryotlarda da replikasyonun yarı-saklı mekanizma ile olduğunu gösteren kanıtı sunmuşlardır.  Vicia faba (bakla) bitkisinin kök uçlarını deneylerinde kullanmışlar ve DNA’yı, DNA’nın radyoaktif öncülerinden olan 3H-timidin ile işaretleyerek ve otoradyografisini alarak replikasyonu izlemeyi başarmışlardır. İşaretli izotop ortamında birinci replikasyon döngüsü sonucu kardeş kromatidlerin ikisi de radyoaktivite taşımaktadır, fakat ikinci replikasyon döngüsü sonucunda her bir kromatitde bir “yeni” sentezlenen radyoaktif işaretli DNA zinciri ve bir de işaretsiz “eski” zincir bulunmaktadır. J. Herbert Taylor Modern boyama tekniklerinin kullanılmasıyla da günümüzde DNA replikasyonunun yarı korunumlu modele göre cereyan ettiğini göstermek mümkündür. Hücreler BUdR içeren ortamda kültür edilmekte ve hücrelerin 2 kez replike olması sağlanmaktadır. Daha sonra bu hücrelerden fluorescent boya ve giemsa ile boyama ile hazırlanan preparatların mikroskopta incelenmesi ile bir ipliği BUdR içeren bir ipliği orijinal olan melez kromatidlerle her iki ipliği BUdR içeren herlequin kromozomları adı verilen açık renkli kromatidler ayırt edilebilmektedir. YARI KORUNUMLU REPLİKASYON MODELİNE GÖRE REPLİKASYON KAÇ AŞAMADA GERÇEKLEŞİR? DNA replikasyonu 3 basamakta gerçekleşir: 1. Başlama (Initiation): Replikasyon orijini adı verilen özel bir bölgede başlar. 2. Zincir uzaması (Elongation): Replikasyon çatalından başlayarak sentezlenen DNA’ya nükleotidlerin eklenmesidir. 3. Sonlanma (Termination): Kromozomun tamamı ya da bir kısmının (replikon) sentezi tamamlanınca replikasyon sona erer. DNA REPLİKASYON MEKANİZMASINDAKİ BAZI ÖNEMLİ KAVRAMLAR DNA SENTEZİ İÇİN GEREKLİ OLAN TEMEL BİLEŞENLER NELERDİR? DNA Polimerizasyon mekanizmasında gerekli olan ve görev alan bileşenler:  Serbest dNTP (deoksinükleotittrifosfatlar) (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), DNA molekülünün monomerleri, yapı elemanları.  Kalıp DNA (kopya için dizi bilgisini taşır, kopyalanma bölgelerinde tek-iplikli hale getirilir)  Primerler; nükleotidlerin bağlanabilmesi için kalıp DNA ile eşleşebilen tek iplikli kısa (5-15 nt) RNA molekülleri (primazlar tarafından sentezlenir).  Enzimler:  DNA Polimerazlar  Helikaz  Primaz  Topoizomerazlar  DNA Ligaz  Bir takım proteinler (SSBP gibi)  İyonlar; Mg+2 gibi dNTP'ler DNA replikasyonunun öncüsüdür, monomerlerdir. DNA REPLİKASYON MEKANİZMASINDA YER ALAN ENZİMLER HANGİLERİDİR ve GÖREVLERİ NELERDİR? Replikasyon mekanizmasında rol alan enzim ve proteinlerin amino asit dizileri prokaryot ve ökaryot hücreler arasında oldukça farklılıklar göstermesine rağmen sonuçta canlıların hepsinde ortak bir yapıya (A, T, G ve C polimerine) sahip olan DNA molekülünün kopyalanması işlevini tam olarak yapmaktadır. DNA polimerazlar:  DNA Polimerazlar ilk kez 1956 yılında Arthur Kornberg tarafından E. coli özütünde tanımlanmıştır. Arthur Kornberg  DNA polimerazın yapısı kapalı bir sağ el şekline benzetilmiştir.  Başlıca 3 domaini vardır; 1- Thumb (baş parmak) 2- Palm (aya) 3- Fingers (parmaklar) DNA polimerazlar:  DNA polimerazlar uzayan DNA zincirinin 3’-OH (primer iplik) grubuna bir nükleotid ekleyerek DNA sentezini sadece 5’ 3’ yönde gerçekleştirebilen enzimlerdir. Polimerizasyonda görev alan enzimlerin çoğu kompleks bir yapıya sahiptir (çok sayıda alt birimlerden oluşmaktadır). E. coli’de en az 3 tip polimeraz vardır (DNA pol I, II ve III). Bunlardan pol III replikasyonda, pol I tamirde görev almaktadır (pol II’nin görevi henüz tam olarak belirlenememiş). Ökaryotlarda ise en az 5 çeşit bulunmaktadır (Polimeraz alfa, delta, gama, ita, teta, epsilon, kapa vs). U U Polimeraz enzimleri kompleks yapılıdır (çok sayıda alt birimleri var) (alfa) (epsilon) (teta) (beta) (sentez) (sentez) (primer sentezi) (sentez) (primer sentezi ve DNA sentez) (sentez) DNA polimerazların E. coli ve memeli hücrelerindeki rolü: RNA PRİMERLERİ NASIL SENTEZLENİR VE BU PRİMERLERİN FONKSİYONU NEDİR?  Primaz: DNA polimeraz enzimlerinin DNA sentezini başlatabilmesi için primer (öncü) olarak adlandırılan 5-15 nükleotitlik bir moleküle ihtiyaç duymaktadır, bu olmadan polimerizasyon yapamaz.  Polimerizasyon için zorunlu olan ve 3’ ucunda serbest hidroksil grubuna sahip RNA yapısındaki oligonükleotidler (5-15 nt/primer) primaz tarafından sentezlenir. Primer sentezine, primazla birlikte başka proteinler de (n, n’, n’’, i, dnaC, dnaB vs.) katılmaktadır. Bu proteinlerin oluşturduğu komplekse primosom denilir. HELİKAZ, TOPOİZOMERAZ ve DNA LİGAZ ENZİMLERİ ile SSBP’LER DNA REPLİKASYONUNDA NE GÖREV YAPARLAR? HELIKAZLAR Çift zincirli DNA’da, zincirler arasındaki hidrojen bağlarını kırarak tek zincirli DNA molekülü oluşturur.  Replikasyonda iki farklı helikaz görev alır:  DnaB: Replikasyon orijininde DNA zincirleri arasındaki hidrojen bağlarını kırarak sarmalı açar.  Rep proteini: Replikasyon çatalında DNA’yı açar. TOPOİZOMERAZLAR Replikasyon çatalının (DNA çift sarmalının açıldığı yer) ilerisinde oluşan pozitif süpersarmal (supercoil) yapıyı gevşetir.  Topoizomeraz I: tek iplikte kesim/bağlama yapar.  Topoizomeraz II: iki iplikte birden kesim/bağlama yapar. Bu işlemler için ATP hidrolizinden elde edilen enerji kullanılır. DNA LİGAZ Sentezlenen DNA parçacıkları arasında ester bağları kurarak birleştiren enzimdir. SSBP (Single Strand Binding Proteins/Tek İpliğe Bağlanan Proteinler) Tek iplikli hale getirilmiş olan DNA moleküllerini daha kararlı hale getirmek ve tekrar birleşmelerini önlemek için DNA ipliklerine bağlanan proteinlerdir. HANGİ DNA POLİMERAZ RNA PRİMERİNİ TANIYARAK SENTEZİ BAŞLATIR? DNA polimeraz III:  DNA Polimeraz III: Primer replikasyon enzimidir ve DNA sentezine başlar. RNA primerinin 3’OH ucunu tanıyıp bağlanan DNA pol III, nt’leri tek zincirli DNA yapısına ekler. DNA POLİMERAZ I ve II’NİN FONKSİYONLARI NELERDİR?  DNA polimeraz I:  5’3’ ekzonükleaz aktivitesi: RNA primerlerini hidrolitik olarak uzaklaştırır. 5’3’ polimeraz aktivitesi: RNA primerinin yerine DNA sentezler. 3’5’ ekzonükleaz aktivitesi: Proofreading-düzeltme, eklediği her bir nt’den sonra doğruluğunu kontrol eder, yanlış eşleşen nt varsa çıkarıp doğrusunu ekler.  DNA polimeraz II:  DNA tamirinden sorumlu enzimdir.  Tek bir polipeptidten oluşur. 3’5’ ekzonükleaz aktivitesiyle düzeltme fonksiyonu vardır. DNA LİGAZIN FONKSİYONU NEDİR?  DNA ligaz:  DNA pol III ile sentezlenen zincirin 5’fosfat grubu ile DNA pol I ile sentezlenen zincirin 3’ OH grubu arasındaki fosfodiester bağı DNA ligaz tarafından yapılır. Gerekli enerji ATP’den sağlanır. DNA tamir mekanizmalarında da yer alır. DNA ZİNCİRLERİNİN BİRLEŞMESİNİ ÖNLEYEN PROTEİNLER NELERDİR? Helikazların ve tek ipliğe bağlanan proteinlerin hareketi REPLİKASYON SIRASINDA MOLEKÜL İÇİ GERİLİMLERİ AZALTAN ENZİM GRUBU HANGİSİDİR? DNA replikasyonu sırasında topoizomerazların rolü  DNA GİRAZ: Bir tür topoizomeraz olan DNA giraz replikasyon çatalı önünde oluşan süpersarmal yapının önünde kesim yaparak gerilmeyi azaltır. Gerilme (yığılma) düzeldikten sonra kesilen iplik/iplikleri tekrar bağlar.  DNA molekülündeki kesimleri tek yada çift zincirde oluşturulabilir. DNA REPLİKASYONU NEREDE ve NASIL BAŞLAR? Replikasyon orijinleri Replikasyon orijinleri: DNA sentezinin başlama noktalarıdır; çift iplikli DNA molekülleri bu noktalarda tek iplikli hale getirilerek DNA sentezinin başlaması için gerekli primerlerin sentezi buralarda açılan DNA dizilerine komplementer olarak sentezlenir.  Prokaryotlarda bir tane replikasyon orijini varken ökaryotlarda çok sayıdadır (insanda yaklaşık 30.000 adet). Bunun nedeni hem ökaryotların DNA’sı prokaryotlara göre çok daha büyüktür hem de DNA polimerazların sentez hızı farklıdır (prokaryotlarda saniyede 500-1000 iken, ökaryotlarda saniyede 50 nükleotid).  Replikasyon orijinleri ‘A’ ve ‘T’ nükleotitlerinin çoğunlukta olduğu ve özgün DNA dizilerinin yer aldığı bölgeler olup prokaryot ve ökaryot DNA’larda farklı dizilere sahiptir. Replikasyon orijinlerinde ipliklerin açılması ve replikasyon bileşenlerinin bu bölgelerde toplanması sonucu şişkinlikler (replikasyon baloncukları/replication bubbles) oluşur. Prokaryotlarda Ökaryotlarda Replikasyon baloncuğu E. coli replikasyon orjini: E. coli kromozomunda replikasyon, orijin (ori) olarak tanımlanan, tek bir bölgeden başlar. İlk olay, kalıbın kısmen açılmasını sağlayan bir başlatıcı proteinin (ori) DNA’ya bağlanmasıdır. Helikaz ve tek iplik DNA’ya bağlanan proteinlerin etkisi ile DNA çözülmesi devam eder ve primaz tarafından RNA primerleri sentezlenir. Orijinden oluşan iki replikasyon çatalı çembersel DNA molekülünde zıt yönlere doğru hareket eder. Ökaryot kromozomlarında replikasyon orijinleri: Replikasyon, her biri iki replikasyon çatalı oluşturan çok sayıda orijinde (ori) başlar.