Příprava rekombinantních proteinů 2023 PDF

Příprava rekombinantních proteinů C6215 Pokročilá biochemie a její metody Michaela Wimmerová  Osnova Zisk proteinů Izolace z přírodního zdroje, komerčně dostupné proteiny, chemická syntéza, prod...

Příprava rekombinantních proteinů C6215 Pokročilá biochemie a její metody Michaela Wimmerová  Osnova Zisk proteinů Izolace z přírodního zdroje, komerčně dostupné proteiny, chemická syntéza, produkce rekombinantních proteinů Produkce rekombinantních proteinů Princip, hostitelský organismus, příprava rekombinantní DNA, přenos do buněk, selekce klonů, příklady postupů Vektory a značky Exprese genů Problémy pro hostitelskou buňku, indukce exprese, využití kodonů, exprese eukaryotických genů, inkluzní tělíska, expresní systémy Mutageneze proteinů různé přístupy Trochu historie Virtuální exkurze do laboratoře - Kultivace a „sklízení“ buněk  Práce s proteiny, charakterizace proteinů Protein je správně sbalený, ak:vní, v dostatečném množství a koncentraci Op:mální podmínky Struktura Funkce Gen Protein Optimalizace Bioinformatika  Kde se proteiny berou? Izolace nativních proteinů z přirozeného zdroje Krev a další tělní tekutiny http://www.fnbrno.cz/darcovstvi-krve/k1570 Buňky různých tkání a orgánů  Kde se proteiny berou? Izolace nativních proteinů z přirozeného zdroje Je možné získat velké množství Pouze male množství proteinu lze získat touto proteinu. cestou: Organismus může obsahovat velmi málo cílového proteinu, navíc pouze za Může být levná. specifických podmínek a po omezenou dobu. Nemusíme řešit správné sbalování Organismus může být nebezpečný (viry) nebo (folding) proteinů a posttranslační obtížně kultivovatelný/chovatelný. modifikace. Problémem je rovněž složitost přírodního materiálu. Je nutné využívat množství purifikačních a separačních metod!  Kde se proteiny berou? Izolace nativních proteinů z přirozeného zdroje Je možné získat velké množství Zisk a zpracování materiálu může být proteinu. velmi drahé a časově a technologicky náročné. Nebo trestné. Může být levná. Nemusíme řešit správné sbalování (folding) proteinů a posttranslační modifikace. Protein z mozku pandích mláďátek??? http://www.zoovienna.at/  Kde se proteiny berou? Kom€rčně dostupné proteiny Jednoduché a (někdy) rychlé. Může být dost drahé. Definované složení. (nevýhoda: asto nebývá) Omezené množství (za hodně peněz málo proteinu). Výhodné, když používáme proteiny jako NÁSTROJE v běžných metodách Dostupná forma nemusí být vhodná (enzymy, stabilizátory). pro náš účel. h/ps://www.sigmaaldrich.com  Kde se proteiny berou? Chemická syntéza Chemická syntéza peptidů – karbodiimidová metoda, produkce převážně kratších řetězců (syntéza na nosičích, nutnost aktivace funkčních skupin, blokování, odblokování) Chemická syntéza proteinů – metodický rozvoj umožnil úplnou chemickou přípravu i proteinů o délce cca 200 aminokyselin.  Produkce rekombinantních proteinů Gen + Vektor + Rekombinantní DNA Hostitelská buňka Izolace a purifikace Protein proteinu GMO Geneticky modifikovaný organismus Řízená exprese („nadexprese“) našeho genu: „Začni ho dělat teď a hodně a nepřestávej!“  Hostitelský organismus Známý (tj. dobře prostudovaný) organismus Ochotně akceptující cizorodou DNA Bezpečný (tj. neohrožující zdraví, nepatogenní) Krátká generační doba Escherichia coli Snadná kulJvace/pěstování/chov Gramnega(vní fakulta(vně anaerobní Nenáročný („levný“), přizpůsobivý bakterie Vysoká produkce cizorodých proteinů Možnost různých modifikací  Klonování DNA Příprava rekombinantní molekuly DNA Použitá DNA: DNA izolovaná z donorového organismu, komplementární DNA (cDNA) připravená zpětnou transkripcí z mRNA, DNA připravená chemickou syntézou. Úprava DNA pro začlenění do klonovacího vektoru – například pomocí štěpení restrikčními endonukleasami, které vytvářejí komplementární (lepivé, kohezní konce) Restrikční endonukleasy štěpí specifické sekvence na DNA, velmi často palindromatické MOTAL ATOM, UCHEM V MECHU, JELENOVI PIVO NELEJ, KUNA NESE NANUK (a spousta sprostých…) Úvod do molekulární biologie, Stanislav Rosypal & kol.  Klonování DNA Příprava rekombinantní molekuly DNA – pomocí restriktas " " GAATTC AATTC G GAATTC CTTAAG G CTTAA CTTAAG " GAATTC G AATTC GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAA G CTTAAG CTTAAG + ligasa Klonování DNA  Klonování DNA Příprava rekombinantní molekuly DNA - LIC (ligase independent cloning) jednořetězcové překryvy – 12-15 bází (např. T4 DNA polymeráza v přítomnosti pouze jednoho z dNTP)  Klonování DNA Přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky Transformace buněk – příjem exogenní DNA bakteriálními buňkami. Buňky jsou vyhladověny za chladu a působením chloridu vápenatého se zvýší propustnost buněčné stěny (buňky uvedeny do stavu kompetence), poté vystaveny 42 stup - teplotní šok teplotnímu šoku. Obranný mechanismus buněk za nepříznivých podmínek. Elektroporace buněk – elektrickým pulzem o vysokém napětí se v buňce vytvoří póry, kterými exogenní DNA vstupuje do buněk. Ano, při nesprávném postupu můžete buňky usmažit… Celetrix LLC ELEPO21 In Vitro High Energy Electroporator Úvod do molekulární biologie, Stanislav Rosypal & kol.  Klonování DNA Selekce vhodných klonů (selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA) Selekční markery – geny pro rezistenci k antibiotikům na vektoru, selekce na živných půdách s antibiotikem. Problém: porostou i buňky s vektorem, do kterého se nezačlenil náš gen. Řešení: inzerční inaktivace. Klonovací místo ve vektoru je umístěno v genu pro rezistenci k dalšímu antibiotiku. Začleněním DNA se naruší funkce tohoto genu a buňky nesoucí vektor s inzertem nebudou proti tomuto antibiotiku rezistentní. Rezistence Rezistence na tetracyklin na ampicilin Rezistence Rezistence na pouze na tetracyklin a tetracyklin ampicilin Úvod do molekulární biologie, Stanislav Rosypal & kol.  Klonování DNA Selekce vhodných klonů (selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA) Restrikční analýza izolovaného vektoru – cizorodá DNA se vyštěpí a detekuje pomocí elektroforézy v agarosovém gelu. "Colony" PCR – hledání kolonií s vloženým inzertem Alfa-komplementace – vektor nese malou část laktosoveho operonu, která obsahuje klonovací místo. Hostitelský organismus obsahuje rovněž část laktosoveho operonu. Produkty translace těchto částí mohou tvořit enzymově aktivní komplex (β-galaktosidasova aktivita) a hostitelské organismy jsou schopny štěpit chromogenní substrát X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactopyranoside). Inzerce cizorodé DNA tuto funkci naruší. (Blue/white screening) https://www.sigmaaldrich.com/technical- documents/articles/biology/blue-white- screening.html Úvod do molekulární biologie, Stanislav Rosypal & kol. Chcete vědět víc?  Vektory „Jako klonovací vektory se nejčastěji používají kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace, odvozené zejména z plazmidů nebo virů.“ (Stanislav Rosypal & kol.) Plazmidové vektory Vektory odvozené z bakteriofága lambda – rekombinantní DNA lze sbalit in vitro do fágových kapsidů a zavést do hosgtelských buněk procesem fágové infekce. Kosmidy – vektory odvozené z plazmidů + místa cos z bakteriofága lambda. Umožňuje sbalení do kapsidů, ale v buňkách se replikuje jako normální plazmid. Umělé bakteriální chromozomy Umělé kvasinkové chromozomy – kyvadlové vektory, replikující se v bakteriích i kvasinkách. Úvod do molekulární biologie, Stanislav Rosypal & kol.  Značky, tagy Využívané pro purifikaci připravených proteinů – afinitní „tag“ je připojen k proteinu a pomocí interakce afinitního partnera s „tagem“ je protein izolován ze směsi ostatních proteinů, například pomocí afinitní chromatografie. Staphylococcal protein A (protein A) – interakce s protilátkou Oligohistidinová kotva – 6x histidin, metaloafinitní chromatografie Glutathion-S-transferasa – interakce s glutathionem MBP (protein vázající maltosu) – folding, purifikace na amylose Systém streptavidin/biotin – in vivo biotinylace proteinu pomocí biotinylačního signálu SUMO (Small Ubiquitin Like Modifier) - folding, rozpustnost,....... Značka může být součástí vektoru (lze tedy připojit ke každému genu, který bude do vektoru vložen) nebo vkládaného genu (chemická syntéza). Ni NTA (nitriltriacetát) Cu IDA mní se rozdlení vazeb mezi matricí a proteinem (Ni a Cu mají stejný poet vazebných míst 6) Cu->Zn->Ni (snižující se interakce): na Ni se váží slabji než na Cu TED->NTA->IDA (zvyšující se pravdpodobnost, že vychytáme náš protein) volba matrice (jak moc oslabíme interakci s proteinem)  Problematická produkce proteinů Produkce toxických proteinů. Problémem může být i nadprodukce primárně netoxického proteinu – narušení metabolických drah. Produkce proteinů s hydrofobními oblastmi – mohou se vázat na/do membrány.  Problematická produkce proteinů Produkce toxických proteinů. Problémem může být i nadprodukce primárně netoxického proteinu – narušení metabolických drah. Produkce proteinů s hydrofobními oblastmi – mohou se vázat na/do membrány. Řešením je vysoká kontrola exprese nebo použití speciálních kmenů hostitelských buněk.  Kontrola/indukce exprese Geny vkládány do vektorů za silné promotory zajišťující výraznou expresi (nadexpresi) Promotory jsou inducibilní – exprese je závislá na přítomnosI induktoru Pěstování buněčné kultury do vhodné opIcké hustoty, přidání induktoru, produkce proteinů lac promotor lac operátor gen Indukce IPTG RNA Isopropyl-β-D-1-thiogalaktopyranosid protein Kontrola/indukce exprese Buňky BL21(DE3) DE3 je označení buněk nesoucích T7 gen (gen pro T7 RNA polymerasu) v genomové DNA. Jeho indukce probíhá prostřednictvím IPTG. Jedná se o snadno indukovatelný kmen s vysokou úrovní exprese proteinů. Hladina bazální exprese (exprese před indukcí) klonovaného genu činí asi 10 %. Do buněk vkládány vektory s T7 promotorem+lac operátorem. Produkce proteinu vyžaduje T7 RNA polymerasu (v buňkách bez ní k produkci nedochází) a indukci IPTG. Kontrola/indukce exprese Buňky BL21(DE3)pLysS Buňky poskytují důkladnější kontrolu exprese pro toxické proteiny. Děje se tak díky přítomnosti plazmidu pLysS. Ten kóduje T7 lysozym, který je schopen vazby na T7 RNA polymerasu a její inaktivace. Tím dochází k minimalizaci exprese, hladina bazální exprese klonovaného genu činí asi 1–3 %. Využití kodonů  VyužiJ kodonů Využití kodonů odráží dostupnost jejich tRNA. Vzácné kodony jsou využívány zřídka a navíc jsou rozeznávány tRNA dostupnou v malých množstvích. Kodony vzácné v E. coli jsou velmi často obvyklé v eukaryotických organismech. PROBLÉMY S TRANSLACÍ! Kodony na mRNA Předčasné ukončení translace, AUG UCG CAU GCC záměna aminokyselin (místo UAC AGC GUA CGG Antikodony na tRNA argininu je začleněn lysin u kodonu AGA), změna čtecího rámce, vynechání aminokyselin. Met Ser His Ala Aminokyseliny nesené tRNA  Využití kodonů Využití kodonů odráží dostupnost jejich tRNA. Vzácné kodony jsou využívány zřídka a navíc jsou rozeznávány tRNA dostupnou v malých množstvích. Kodony vzácné v E. coli jsou velmi často obvyklé v eukaryotických organismech. PROBLÉMY S TRANSLACÍ! Řešení: využití speciálních kmenů buněk obsahujících extra kopie genů pro vzácné kodony, použití syntetického genu s optimalizovanými kodony. Produkce eukaryoKckých genů – problémy s introny E. coli je prokaryotický organismus = PROKARYOTA NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! Pro produkci eukaryotických proteinů v E. coli vycházíme z komplementární DNA – cDNA. Což je DNA získaná zpětnou transkripcí z mRNA. Exon Intron Exon DNA Transkripce Primární transkript Sestřih mRNA Reverzní cDNA transkripce  Problém inkluzních tělísek Proteinová inkluzní tělíska = nerozpustné proteinové agregáty Špatně sbalené proteiny (problém disulfidických můstků, hydrofobních proteinů, posQranslačních modifikací) Toxické proteiny Proteiny, které se tvoří až příliš dobře – moc rychle a ve velkém množství Proteiny, které tvoří inkluzní tělíska z neznámých důvodů… Mohou se tvořit ve velkém množství. Vysoká čistota. Někdy lze protein renaturovat. Nesbalený protein! Možné řešení produkce toxických proteinů.  Nevýhody E. coli jako expresního systému Rozdílné využívaní kodonů u E. coli a eukaryot Problém s tvorbou disulfidických můstků Problémy s posttranslačními modifikacemi Neprovádí sestřih Tvorba inkluzních tělísek když se potebují neho zbavit Bioinformatická analýza genu/proteinu (i základní = rychlá) před vlastní expresí nám může uspořit spoustu času! Stabilita? Aminokyselinové složení? Homologní proteiny? Funkce? Hydrofobní oblasti? Důležité posttranslační modifikace?  Další expresní systémy Kvasinky, rostliny, houby, savčí buňky, hmyzí buňky, živočichové + umožňují posttranslační modifikace proteinů glykosylace, fosforylace, acetylace, ubikvitinace… + vyšší pravděpodobnost funkčního produktu - buňky citlivější na manipulaci - nižší výtěžky rekombinantních produktů - náročnější na kultivační podmínky a čas - dražší média a speciální vybavení N-glykosylace u různých organismů Fuc Man Gal GlcNAc Xyl Sia Essentials of Glycobiology Second Edition  Saccharomyces cerevisiae kvasinka + jednoduchá transfekce a kultivace + snadná velkoobjemová fermentace, rychlý nárůst kultury - nutnost často zdlouhavé optimalizace kultivačních podmínek - vysoká mannosylace proteinů → možnost využití „humanizovaných“ kmenů  Kvasinkové expresní systémy Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris plasmid nezačleňuje začleňuje plasmid do do genomu genomu – linearizace vysoká mannosylace 1/3 mannosylace oproti proteinů – antigennost S. cerevisiae pro člověka Pichia pastoris Escherichia coli  Živočišné expresní systémy posttranslační modifikace kompatibilní s endogenními proteiny vhodné pro produkci proteinových terapeutik citlivé na manipulaci snadná kontaminace viry nejčastější linie: Human embryonic kidney cells (HEK-293) Human embryonic retinal cells (Crucell's Per.C6) Human amniocyte cells (Glycotope and CEVEC) Chinese hamster ovary cell (CHO) Mouse myeloma lymphoblstoid (e.g. NS0 cell)  Leishmania tarentolae prvok + posttranslační modifikace podobné lidským + růst do vysokých buněčných hustot - drahá kultivační média - zvýšená náročnost na transfekci - vyšší časová náročnost  Leishmania tarentolae h/ps://www.jenabioscience.com/lex sy-expression/lexsy- culfvafon/strains/lt-101-l-t- laboratory-strain-p10 Leishmania tarentolae  Leishmania tarentolae Tyto buňky jsou transformované vektorem a navíc pěkně živé. Než stihnete ukončit fluorescenční focení, utečou...Super J Leishmania tarentolae Červená fluorescence znamená, že buňky přijaly vektor s naším genem... Mutageneze jako nástroj pochopení funkce proteinů  Úvod mutageneze -> hybná síla evoluce => řízená evoluce pomocí in vitro mutageneze: -> strukturně-funkční studie -> proteinové inženýrství 52  Mutageneze mutageneze -> hybná síla evoluce in vivo mutageneze: náhodné „poškozování“ DNA uvnitř buněk (UV, chemické metody,..), “šlechtění“ rostlin,.. in vitro mutageneze: postupy, jimiž se mění primární struktura izolované DNA -> strukturně-funkční studie (funkce neznámých proteinů (knock-out), pochopení klíčových reziduí pro funkci, … -> proteinové inženýrství (řízená evoluce, zásahy do vazebných a katalytických míst, proteiny s novými vlastnostmi, …) 53 Mutageneze - proteinové inženýrství Proces, při kterém modifikujeme sekvenci známého proteinu (nejčastěji enzymu), abychom zlepšili jeho vlastnosY. Vytvoření zcela nové sekvence s požadovanými vlastnostmi = protein design Mutageneze - proteinové inženýrství Co chceme zlepšit? Stabilitu – odolnost vůči (nepřirozenému) prostřední (pH, vysoké koncentrace soli, teplota, organická rozpouštědla) AkYvitu – zvýšit akYvitu v původních podmínkách nebo získat akYvitu v nepřirozených podmínkách Affinitu SelekYvitu – enanYo-, regio-, chemo- Zcela nové vlastnosY - zpracování nových substrátů, katalýza nových reakcí,...  Mutageneze in vitro dvě základní strategie: 1. Řízená evoluce (náhodná mutageneze in vitro) 2. Racionální design (místně cílená mutageneze) 3.eventuálně kombinace obou: semi-rational design místně cílená vs. náhodná 56  Mutageneze in vitro Místně cílená Náhodná sekvence DNA musí být známá není nutné znát sekvenci DNA cílená mutace v sekvenci => nahodilé mutace kdekoliv v genu protein s určitou změnou ve můžou přinést neočekávané a struktuře nebo funkci zajímavé výsledky obvykle produkujeme jednotky až vznikají knihovny o 10 000 desítky mutantů mutantů nutný high-throuput screening a robotizace 57  Místně cílená mutageneze (site-directed) Řízená oligonukleotidem Kazetová základ proteinového inženýrství mutace se zavádějí pomocí cílená záměna delších úseků na DNA syntetických oligonukleotidů obsahujících substituce bazí vyštěpení fragmentu a jeho náhrada (lze krátké inzerce i delece) syntetickým oligonukleotidem oligonukleotidy = primery 58  KAZETOVÁ ŘÍZENÁ OLIGONUKLEOTIDEM delší, než bžné primery na PCR DpnI: štpí methylovanou DNA (likviduje pvodní plazmid 59  Náhodná mutageneze in vitro náhodné mutace kdekoliv v genu objasnění strukturně-funkčních vztahů (před rozvojem klonovacích technologií; mutovaný gen => porušený proces) řízená evoluce -> knihovny mutantů -> mnoho proteinů s různými variacemi ve struktuře a funkci cíl: najít protein s vylepšenými vlastnostmi metodicky rozmanité 60  Náhodná mutageneze Fyzikální – UV záření (-> kovalentní vazby mezi sousedními pyrimidiny) Chemické – EMS (alkylační činidlo) HNO2 (deaminační činidlo) analogy bazí (5-bromuracil, 8-oxo-dGTP) Mol.-biologické – error-prone PCR rolling circle error-prone PCR DNA míchání (DNA shuffling) mutátorové bakteriální kmeny náhodná delece/inzerce 61  Klasická PCR Polymerase Chain Reaction in vitro klonování konkrétního úseku DNA cyklické střídání tří teplot: denaturační (94ºC – 95ºC) annealingová (nasedání primerů, 50ºC – 65ºC) teplota syntézy (72ºC – 75ºC) termostabilní DNA polymerasa, směs deoxyribonukleofdů, pufr (opfmální podmínky) thermocycler velký počet amplifikačních cyklů (30 – 35) => velké množství kopií klonovaného úseku DNA 62  Klasická PCR PCR – Polymerase Chain Reaction 63  Error-prone PCR PCR „náchylná k chybám“ vychází ze standardní PCR, změnami ve složení typického pracovního pufru docílíme, že polymeráza dělá v průběhu PCR chyby Taq polymerasa (nejvyšší míra chybovosf; zaměňuje báze; postrádá 3‘->5‘ exonukleasovou akfvitu) ↑c MgCl2 (stabilizuje nekomplementární páry bazí) MnCl2 (Mn2+ ionty snižují templátovou specifitu polymerasy) dNTP mix: 0,2mM ATP + GTP; 1mM CTP + TTP (Taq pol. T->C transice) ↑počet amplifikačních cyklů (někdy až 50) 64  Error-prone PCR Komponenty PCR Standardní PCR Error-prone PCR směsi (ve 100µl) (ve 100µl) MgCl2 1,5mmol/l 7mmol/l KCl 50mmol/l 50mmol/l Tris (pH 8,3) 10mmol/l 10mmol/l dNTP směs 0,25mmol/l 1mmol/l dCTP+dTTP každého nukleotidu 0,2mmol/l dATP+dGTP templátová DNA 100pg/µl 20pg/µl MnCl2 – 0,5mmol/l Taq polymerasa 2,5 U 5U 65  DNA shuffling Molecular breeding: DNAsa rozštěpí gen na malé (10-50pb). Pak se udělá PCR této směsi bez primerů – úseky DNA, které se částečně překrývají poslouží jako primery. Využio restrikčních enzymů: s vícero štěpícími místy v sekvenci, vzniklé úseky se náhodně spojí ligací 68  Cíleně-náhodná mutageneze Různé kombinace předešlých přístupů určujeme pozice, kde má k docházet k vícenásobný náhodným mutacím mutace v jednom místě à ATGCATGCTNNNAGGATCATTTGG… vícenásobné mutace à AAGTCANNNTGGGTANNNNNNCCGTA… … 69  Cíleně-náhodná mutageneze náhodná mutageneze v předdefinovaných „hotspots“ možnost in silico predikce (počítačové modelování) → predikce aminokyselinových změn obvykle směsí speciálních nikleoYdových primerů (viz předešlý obrázek) 70 the gene of interest mixture of oligonucleotide primers carried random base substitutions on hot selected sites spo ts annealing of primers cíleně- NN náhodná mutageneze N long PCR NN PCR product – whole plasmid containing N gene with nucleotide substitutions  Historie 1962 - Objeveny restrikční endonukleasy 1985 - Objevena PCR  Historie 7 October 2020 The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the Nobel Prize in Chemistry 2020 to Emmanuelle Charpen6er Max Planck Unit for the Science of Pathogens, Berlin, Germany Jennifer A. Doudna University of California, Berkeley, USA “for the development of a method for genome edi2ng”  Historie 1973 - vyvinuta technika klonování DNA.  Historie (hrubý výběr…) 1974 – transgenní myš 1978 – lidský inzulin připravený v bakteriích (humulin) 1983 – transgenní rostlina (tabák) 1988 – produkce lidských protilátek v rostlinách 2000 – zlatá rýže (biosyntéza beta-karotenu) 2003 – GloFish (geneticky modifikované ryby) 2011 – ZMapp: protilátky proti Ebole produkovány v tabáku (kombinace tří monoklonálních protilátek, použity v roce 2014 při epidemii Eboly bez kompletních klinických testů) „Tobacco is readily amenable to gene3c engineering and has many desirable agronomic a5ributes, like high biomass yield and high soluble protein levels that are essen3al for crops used to produce recombinant proteins. It is a non-food crop, making containment in an agricultural se?ng feasible. Most produc3on systems are based on the accumula3on of proteins in leaves, elimina3ng the need for flowering and pollen produc3on. These a5ributes make tobacco an ideal bioreactor for the large-scale produc3on of biopharmaceu3cal recombinant proteins. As a consequence, a wide variety of the recombinant proteins, from simple pep3des to complicated mul3meric molecules like hemoglobin or secretory an3bodies, have been produced successfully in tobacco. Many of these proteins have therapeu3c or industrial uses.“ R. T. Rymerson, R. Menassa, J. E. Brandle Příprava rekombinantních proteinů exkurze do laboratoře Zásobní buňky (obsahující vektor s naším genem) se uchovávají zamražené. Při slušném zacházení vydrží roky…  Živné medium Úprava pH nutná! Buňky (v našem případě bakterie) se pěstují ve vhodném živném mediu, které je komerčně dostupné. Kupuje se po kilogramech…  Kulovační lahve Při kultivaci buněk je kritické provzdušňování: 1/4 lahve se plní pouze do 1/4 objemu.  Malý autokláv Media je nutné před použipm sterilizovat. Velký autokláv Střední autokláv  Držáky na lahve. Vlastní kultivace bakterií probíhá v temperovaných třepačkách.  Proč lahve nespadnou, když tady není žádný držák? Vlastní kultivace bakterií probíhá v temperovaných třepačkách.  Malé třepačky Na malé Na zkumavky lahve Veškerý zákal tvoří buňky. Toto je pěkně „narostlá“ kultura. Někdy potřebujete Po kultivaci je nutné buňky lahví opravdu hodně… oddělit od živného media. Používá se filtrace nebo centrifugace. Centrifugační kyvety  Buňky jsou rozmíchány ve vhodném pufru a zpracovány. Nebo zamraženy a uskladněny pro pozdější využip. Buňky po centrifugaci Příběhy z labu: Hrdý student se svými milášky… Příběhy z labu: Kam s nima? A takhle končí jedna kultivace a začíná další…