Rekombinantní Proteiny a Mutageneze

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Jaké jsou možnosti zisku proteinů?

Produkce rekombinantních proteinů (correct)

Izolace z přírodního zdroje (correct)

Komerčně dostupné proteiny (correct)

Popis chemických vlastností

Jaké jsou problémy spojené s hostitelskou buňkou při exprese genů?

Snížená aktivita enzymů (correct)

Využití nekodujících oblastí (correct)

Omezené podmínky pro růst (correct)

Indukce exprese

Jaké jsou výhody výroby rekombinantních proteinů oproti izolaci z přírodního zdroje?

Nižší náklady na produkci

Bezpečná výroba bez virů (correct)

Snadnější manipulace s proteinem (correct)

Možnost získání velkého množství proteinu (correct)

Jaké postupy jsou používány při selekci klonů rekombinantní DNA?

Hodnocení buněčné viability Signup and view all the answers

Jaké jsou hlavní výhody a nevýhody izolace proteinů z přírodního zdroje?

Obtížná kultivace organismů Signup and view all the answers

Co se rozumí pojmem inkluzní tělíska v kontextu exprese proteinů?

Odstranění chybně sbalených proteinů Signup and view all the answers

Jaké metody jsou zapotřebí pro purifikaci a separaci proteinů?

Elektroforéza Signup and view all the answers

Jaká z následujících modifikací je charakteristická pro Leishmania tarentolae?

Posttranslační modifikace podobné lidským Signup and view all the answers

Co je hlavním cílem in vitro mutageneze?

Získat proteiny s novými vlastnostmi Signup and view all the answers

Jaký je proces, kterým se mění sekvence známého proteinu za účelem zlepšení jeho vlastností?

Proteinové inženýrství Signup and view all the answers

Jaká jsou hlavní zaměření mutageneze in vitro?

Studovat strukturální funkce proteinu Signup and view all the answers

Jaké typy mutageneze existují podle metody provedení?

In vitro a in vivo Signup and view all the answers

Jaké vlastnosti se obvykle snaží zlepšit pomocí proteinového inženýrství?

Odolnost vůči vysokým teplotám a chemickým látkám Signup and view all the answers

Jaký je hlavní důvod pro použití mutageneze v biologických studiích?

Pochopit evoluční procesy Signup and view all the answers

Jakým způsobem může mutageneze přispět k proteinovému inženýrství?

Vytvářením nových enzymatických funkcí Signup and view all the answers

Jaké typy molekul DNA se nejčastěji používají jako klonovací vektory?

Kružnicové molekuly DNA schopné replikace Signup and view all the answers

Jaká je hlavní výhoda použití kosmidu jako vektoru?

Umožňuje sbalení do kapsidů a replikaci jako plazmid Signup and view all the answers

Jakou funkci mají afinitní tagy při purifikaci proteinů?

Izolují proteiny ze směsi ostatních proteinů Signup and view all the answers

Která z následujících značek se používá při afinitní chromatografii?

Staphylococcal protein A Signup and view all the answers

Jaký problém může nastat při produkci proteinů s hydrofobními oblastmi?

Můžou se vázat na membrány Signup and view all the answers

Jaký přístup může pomoci v případě nadprodukce netoxického proteinu, který narušuje metabolické dráhy?

Použití genetických kmenů s regulovanou expresí Signup and view all the answers

Která metoda se používá ke snížení interakce mezi matrice a proteinem v afinitní chromatografii?

Volba vhodné matrice Signup and view all the answers

Co je cílem použití umělých kvasinkových chromozomů?

Replikace jak v bakteriích, tak v kvasinkách Signup and view all the answers

Kdo se zasloužil o vývoj metody pro úpravu genomu?

Jennifer Doudna Signup and view all the answers

Který z následujících roků se váže k produkci lidského inzulínu v bakteriích?

1978 Signup and view all the answers

Jaké výhody má tabák pro produkci rekombinantních proteinů?

Vysoká úroveň okenních bílkovin Signup and view all the answers

Jaké médium je nutné pro kultivaci bakterií?

Kompozitní živné medium Signup and view all the answers

Jaká zařízení jsou použita k provzdušňování buněčných kultur?

Kuličkové lahve Signup and view all the answers

Proč je důležité sterilizovat média před použitím?

Zaručuje, že buňky se nezkazí Signup and view all the answers

Který z následujících produktů nebyl vyvinut v roce 2003?

Humulin Signup and view all the answers

Jaký typ protilátek byl vyvinut pro léčbu Eboly v roce 2011?

Monoklonální protilátky Signup and view all the answers

Jaká je hlavní změna v poměru rozpuštěné soli MgCl2 mezi standardní PCR a error-prone PCR?

Zvýší se na 7 mmol/l Signup and view all the answers

Jaký je účel DNA shufflingu?

Kombinace různých úseků DNA Signup and view all the answers

Co se používá k in silico predikci v cíleně-náhodné mutagenezi?

Počítačové modelování Signup and view all the answers

Jak vysoká je koncentrace templátové DNA v error-prone PCR?

20 pg/µl Signup and view all the answers

Jaké byly první restrikční endonukleázy objeveny?

Bakteriální restrikční enzymy Signup and view all the answers

Jaká je role MnCl2 v error-prone PCR?

Nenachází se v této směsi Signup and view all the answers

Jaké příklady vícenásobných mutací je uvedeno v cíleně-náhodné mutagenezi?

ATGCATGCTNNNAGG Signup and view all the answers

Která z uvedených metod není součástí cíleně-náhodné mutageneze?

Zaměření na náhodné mutace celého genomu Signup and view all the answers

Kdo získal Nobelovu cenu za chemii v roce 2020?

Emmanuelle Charpentier a Jennifer A. Doudna Signup and view all the answers

Jaký je význam dNTP směsi v error-prone PCR?

Zvyšuje počet chyb v syntéze Signup and view all the answers

Jaký je hlavní rozdíl mezi místně cílenou a náhodnou mutagenezí?

Místně cílená mutageneze se zaměřuje na známé sekvence DNA. Signup and view all the answers

Co je cílem náhodné mutageneze in vitro?

Najít protein s vylepšenými vlastnostmi. Signup and view all the answers

Jaký proces je realizován během klasické PCR?

Cyklické střídání tří různých teplot. Signup and view all the answers

Jaký je hlavní účel použití DpnI v kazetové mutagenezi?

Odstranit methylovanou DNA. Signup and view all the answers

Co zahrnuje error-prone PCR?

Zaměnu bazí v průběhu amplikace. Signup and view all the answers

Co je charakteristické pro kazetovou mutagenezi?

Zahrnuje delší úseky DNA než běžné primery. Signup and view all the answers

Jaké metody se používají pro náhodnou mutagenezi?

DNA shuffling a error-prone PCR. Signup and view all the answers

Jaký pufr se používá při error-prone PCR pro zajištění chyb?

Pufr s zvýšeným obsahem MgCl2 a MnCl2. Signup and view all the answers

Jaký je význam primerů při PCR?

Primery jsou nezbytné pro annealing a iniciaci syntézy. Signup and view all the answers

Jaká je role Taq polymerasy při error-prone PCR?

Způsobuje vznik chyb v průběhu amplifikace. Signup and view all the answers

Study Notes

Příprava rekombinantních proteinů

Cílem je příprava rekombinantních proteinů.
Existují různé metody izolace proteinů z přírodních zdrojů, chemická syntéza a produkce rekombinantních proteinů.
Klíčovými kroky v produkci rekombinantních proteinů jsou: určení principu, výběr hostitelského organismu, příprava rekombinantní DNA, přenos do hostitelské buňky, selekce klonů a výběr konkrétního postupu.
Problémy pro hostitelskou buňku zahrnují indukci exprese, kodony, eukaryotické geny a inkluzní tělíska. Využívají se expresní systémy pro řešení těchto problémů.
Mutageneze proteinů je nástrojem k pochopení funkce proteinů a jejich optimalizace. Metody zahrnují různé přístupy ke změnám (mutacím) v sekvenci proteinů.
Izolace nativních proteinů probíhá z přirozených zdrojů.
Komerčně dostupné proteiny jsou k dispozici a snadno použitelné, ale jsou omezené v množství a dostupnosti.
Chemická syntéza je použitelná pro kratší proteinové sekvence.

Klonování DNA

Příprava rekombinantních molekul DNA zahrnuje izolaci DNA z donorového organismu, použití komplementární DNA, a chemickou syntézu.
DNA má být upravena pro vložení do klonovacího vektoru.
Restrikční endonukleasy hrají klíčovou roli v štěpení DNA na specifických sekvencích (palindromatických).
Klonování DNA zahrnuje izolaci, purifikaci a modifikaci proteinů.

Produkce rekombinantních proteinů

Produkt vzniká spojení genu a vektoru.
Dále následuje izolace a purifikace proteinu.
Geneticky modifikovaný organismus slouží k produkci proteinu.

Hostitelský organismus

Vybraný organismus by měl být známý, nepatogenní, se snadno kultivujícím/pěstujícím procesem a měl by mít krátkou generační dobu.
Escherichia coli je jedním z nejčastěji používaných hostitelských organismů.

Vektory

Klonovací vektory jsou kruhové molekuly DNA schopné autonomní replikace.
Nejčastěji se používají plazmidové vektory a vektory odvozené z bakteriofága lambda.
Kosmidy kombinují vlastnosti plazmidů a fága lambda.
Umělé kvasinkové chromozomy a umělé bakteriální chromozomy slouží jako kyvadlové vektory umožňující replikaci v různých typech buněk.

Značky, tagy

Značky se používají pro purifikaci proteinů.
Staphylococcal protein A a oligohistidinová kotva se váže na protilátky a metaly.
Glutathion-S-transferáza a MBP se používají při purifikaci a foldingu.

Problématická produkce proteinů

Nadprodukce toxických proteinů může narušit metabolické dráhy v hostitelských buňkách, mění se jejich metabolické procesy.
Produkce proteinů s hydrofobními oblastmi může vést k jejich vazbě na membrány.

Kontrola/indukce exprese

Geny se vkládají do vektorů s silnými promotory pro efektivní expresi.
Promotory lze regulovat induktory (např. IPTG).
Indukce exprese je dosažena po dosažení požadované optické hustoty - vhodné pro optimalizaci exprese.

Využití kodonů

Využívání kodonů odráží dostupnost tRNA, ale eukaryotické buňky použijí více vzácné kodony.
K dispozici jsou speciální kmeny buněk (extra kopie genu) pro vzácné kodony.

Produkce eukaryotických genů – problémy s introny

Prokaryotické buňky nemohou sestřihnout introny, takže je potřeba použití cDNA z mRNA.
Používání cDNA umožňuje vybudovat eukaryotický gen v prokaryotickém organismu.

Problém inkluzních tělísek

Nerozpustné proteinové agregáty, které vznikají kvůli nesprávnému sbalení proteinů - problém.
Příčiny vzniku inkluzní tělísek zahrnují nesprávně složené disulfidické můstky, hydrofobní proteiny a posttranslační modifikaci.

Nevýhody E. coli jako expresního systému

Rozdílné kodony, problematiku vytváření disulfidických můstků, posttranslačních modifikací a inkluzních tělísek v hostitelských buňkách.

Další expresní systémy

Kvasinky, rostliny, houby, savčí buňky, hmyzí - nabízí posttranslační modifikace.
Vyšší pravděpodobnost funkčního produktu, ale jsou náročnější na kultivaci.

Mutageneze jako nástroj pochopení funkce proteinů

Mutageneze se používá k pochopení funkce proteinů, zahrnuje strukturně-funkční a proteinové inženýrství studie.

Mutageneze in vitro

Strategie zahrnují řízenou evoluci (náhodná mutageneze) a racionální design (cílená mutageneze).

Klasická PCR

Polymerázová řetězová reakce (PCR) – in vitro metody pro zvětšení počtu kopií klonovaného genu.

Error-prone PCR

Varianty klasické PCR, které záměrně introdukují chyby do sekvence DNA, jsou používané v rámci mutageneze.

DNA shuffling

Metoda pro kombinování DNA fragmentů s částečnou podobností sekvence.

Cíleně-náhodná mutageneze

Kombinace cílená a náhodná mutageneze.
Indikuje určité pozice pro více náhodné mutace.

Historie

Werner Arber a Kary Mullis, jsou známí objevy v DNA výzkumu, objev restrikčních endonukleas a polymerázové řetězové reakce,

Další

Existují další metody pro kultivaci buněk a i přípravu/zpracování proteinů, které byly uvedeny v prezentaci.
Informace o použitelných nástrojích a metodách pro produkci proteinů.

Studying That Suits You

Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

Description

Tento kvíz se zaměřuje na zisky proteinů, výhody rekombinantních proteinů a mutagenezi in vitro. Prozkoumejte, jaké jsou problémy při exprese genů a jaké metody jsou využívány pro purifikaci proteinů. Zjistěte, jak může mutageneze přispět k proteinovému inženýrství.