Contrôle Qualitatif des Biopharmaceutiques PDF

Chapitre 4 : Contrôle qualitatif et quantitatif des médicaments 4.6. Contrôle qualité des biopharmaceutiques 4.6.1. Principes actifs issus de la biotechnologie Introduction Qu’est-ce qu’un « médicament biologique » ? (définition de l’AFMPS, oct. 2020) Les médicaments biologiques provien...

Chapitre 4 : Contrôle qualitatif et quantitatif des médicaments 4.6. Contrôle qualité des biopharmaceutiques 4.6.1. Principes actifs issus de la biotechnologie Introduction Qu’est-ce qu’un « médicament biologique » ? (définition de l’AFMPS, oct. 2020) Les médicaments biologiques proviennent d’organismes vivants, tels que des cellules ou des tissus vivants, modifiés au moyen de la biotechnologie. Ce processus permet à ces organismes vivants de produire une substance active, comme une protéine par exemple. La substance active du médicament biologique est ensuite « récoltée » à partir des cellules. Ces substances actives sont généralement de taille plus grandes et plus complexes que celles des médicaments non biologiques, mais également plus variables puisqu’il s’agit d’organismes vivants. → Variant = impureté = dérivé de la molécule active de départ qui a subi une modification (soit modification de sa charge, de son caractère hydrophobe ou hydrophile, de sa taille). Production via une cellule hôte (bactérie, cellule d’un mammifère ou d’un insecte) dans laquelle on introduit un plasmide, on lui fait produire une protéine par sa machinerie → la protéine sera soit sécrétée dans le milieu extracellulaire, soit il faudra lyser la cellule si la protéine est intracellulaire pour la récupérer. « Biological medicinal product » (définition de l’EMA, oct. 2020) A biological medicinal product is a medicinal product whose active substance is made by or derived from a living organism (un médicament biologique est un médicament dont la substance active est fabriquée par ou dérivée d'un organisme vivant) → On produit grâce à un processus de génie génétique. - Coagulation factors - Insulin - Monoclonal antibodies (= mAb = Ac monoclonal, retenir car j’ai laissé mAb partout) - Vaccines - Heparin (la définition de l’EMA inclus les molécules médicamenteuses extraites de cellules vivantes, donc plus large que la définition de l’AMPS qui ne considère que les molécules synthétiques) - Cellular therapy (ATMP = thérapie cellulaire, voir 4.6.3) Evolution du marché pharmaceutique : La biopharmaceutique commence à inonder le marché. En 2004 : 1 biopharmaceutique dans les 10 premières molécules les plus vendues. En 2017 : 7 biopharmaceutiques (dont par exemple les anticorps monoclonaux en bleu et les protéines de fusion en vert). Elles sont largement utilisées en hôpital mais aussi de plus en plus en officine. Pourquoi fabriquer des médicaments biologiques ? (AFMPS, oct. 2020) Les médicaments biologiques sont bien établis en pratique clinique et sont souvent indispensables pour le traitement des patients atteints de maladies graves et chroniques, comme le diabète, les maladies auto- immunes et les cancers. Parmi les médicaments biologiques disponibles figurent notamment : - Des hormones, telles que l’insuline et l’hormone de croissance (avant extraites sur des animaux morts mais cela comportait des risques élevés), - Des anticorps pour le traitement des maladies auto-immunes et des cancers. → Utilisation en hôpital pour les pathologie cancéreuses, pathologies inflammatoires chroniques, … Ces molécules sont plus difficiles à conserver : au frigo obligatoirement (protéines en solution qui se gardent 1-2 ans maximum à 4°C). Voie de synthèse d’un médicament chimique et d’un médicament biologique : En chimie : on réalise une synthèse, on obtient un produit final dont on contrôle la qualité (10 à 20 tests le long du processus) pour obtenir un produit final de haute qualité qui sera notre molécule pharmaceutique → prend quelques semaines/mois à produire. En biologie, on introduit le matériel génétique de la substance d’intérêt dans des cellules hôtes, on les fait croitre afin de produire la protéine d’intérêt et il y a ensuite un processus de purification (isoler la molécule thérapeutique du milieu de culture et du matériel génétique de la cellule). Il faut 50 à 100 tests de contrôle le long du parcours de production → prend 6 à 9 mois à produire.  Le processus de biologie est plus complexe que celui de chimie. Qu’est-ce qu’un médicament biosimilaire ? (AFMPS, oct. 2020) Un médicament biologique similaire, ou médicament biosimilaire, est un médicament dont on a démontré le caractère très semblable à un médicament biologique déjà autorisé pour la vente (connu sous le nom de médicament biologique de référence). Les médicaments biosimilaires sont approuvés en fonction d’une comparaison approfondie avec un médicament de référence et peuvent faire leur entrée sur le marché une fois que les brevets et les protections des données du médicament biologique de référence sont expirés. → On ne parle pas de générique pour les médicaments biologiques car on n’est pas capable de faire une copie conforme de la molécule originale (procédé trop long que pour que la molécule soit 100% identique, chaque petite variation lors du processus de production aura un impact sur la structure du médicament). - On obtient donc un biosimilaire = équivalent d’un médicament générique pour une petite molécule. Pour mettre sur le marché un biosimilaire : on doit prouver que la molécule aura les mêmes propriétés pharmacologiques, la même efficacité et la même sureté que la molécule copiée (beaucoup plus de tests que pour un générique). - Générique = copie d’une spécialité → seuls les excipients peuvent varier. Le but du développement de ces molécules reste la diminution de leur coût. Complexité des médicaments biologiques : Les médicaments biologiques sont donc très complexes à développer. Plus la molécule est grande (protéines) et plus elle est complexe par rapports aux moyennes molécules (peptides) et aux petites molécules. Par exemple, un anticorps monoclonal est une grosse protéine. Complexité de production et de contrôle de qualité → ça n’a rien à voir avec une petite molécule. Les protéines : Protéines = enchainements d’AA. Certains acides aminés ont des propriétés physico-chimiques très différentes : certains sont lipophiles, certains hydrophiles, certains ont des chaines latérales chargées et d’autres non, certains sont + polaires que d’autres, certains sont basiques/acides, … On a : - Ceux qui contiennent des cycles aromatiques → absorbent dans l’UV. 3 AA absorbent bien dans l’UV : tryptophane, phénylalanine et tyrosine. Si on a une séquence protéique contenant ces AA, on peut utiliser un détecteur UV. - Ceux qui ont des chaines latérales qui leur donnent un caractère acide : c’est le cas de l’acide aspartique et l’acide glutamique. - Ceux qui ont des chaines latérales qui leur donnent un caractère basique : c’est le cas de la lysine, l’arginine et l’histidine. Ces acides aminés sont liés entre eux par des chaines peptiques. Composition typique en AA d’un mAb : Sur une même molécule, on peut avoir des charges positives (AA basiques par ex : histidine, lysine – en rouge) et des charges négatives (AA acides – en bleu). - Pour charger positivement une protéine, on se place à pH acide (les AA basiques s’ionisent). - Pour charger négativement une protéine, on se place à pH basique (les AA acides s’ionisent). Fonctions réactives = groupements qui ont tendance à réagir avec le milieu. Plus il y a de groupements réactifs et plus la molécule est instable. Il faut donc contrôler les points d’instabilité de la molécule et savoir comment conserver ces molécules. Rappel : le point isoélectrique est la moyenne des pKa des acides aminés d’une protéine = pH auquel la molécule est globalement neutre (contient autant de charges + que de charges -). → Les propriétés physico-chimiques des molécules doivent être claires afin de faire les bonnes recherches lors du contrôle de qualité effectué au moment de la production de ces biopharmaceutiques. Plus les protéines ont une grande structure et plus elles sont complexes (différentes liaisons selon le niveau de structure comme les ponts disulfures, les liaisons hydrogènes, …). Il existe plusieurs niveaux de contrôle de qualité et des tests permettent de vérifier toutes ces structures : - Structure primaire (chaine linéaire d’AA) : on s’assure que tous les acides aminés attendus sont bien présents et sont présents dans le bon ordre. - Structure secondaire : on vérifie les liens hydrogènes. - Structure tertiaire : on vérifie les interactions hydrophobes et les ponts disulfures. L’état tridimensionnel d’une molécule est important car l’activité des molécules se passe à l’état tridimensionnel (les interactions dans l’organisme se font dans la conformation 3D) → si la conformation n’est pas celle attendue, l’effet ne sera pas non plus celui attendu. - Structure quaternaire : on vérifie la formation de complexes. Guidelines en matière de contrôle de qualité des biopharmaceutiques : Les mAb comme exemple de protéine : Structure : Hétérogénéité : Les isoformes d'une protéine sont les différentes formes qu'elle prend lorsqu'elle est issue d'un même gène. Plusieurs phénomènes peuvent avoir un impact sur l’activité médicamenteuse d’un isoforme. Le phénomène d’agrégation n’est pas observé avec les petites molécules. On ne parle jamais d’agrégat mais d’insoluble. Par contre, une protéine peut interagir avec une autre protéine pour former un dimère (même en solution). Ensuite elle peut avoir une interaction avec une autre pour former trimère et ainsi de suite. A la fin, la structure devient tellement grosse qu’elle peut précipiter. Les agrégats sont toxiques → ils peuvent provoquer des chocs anaphylactiques importants donc nécessité de les contrôler ! Il faut aussi contrôler aussi la fragmentation : par exemple une partie du bras de l’anticorps qui se détache (troncatures de la lysine : aux extrémités de l’anticorps) suite à une T° élevée ou une agitation trop forte. Contrôle de la désamidation, de l’oxydation (notamment si la structure contient des méthionines), … Les modifications qui n’ont pas d’impact sur l’efficacité et la toxicité du médicament ne sont pas recherchées. Caractérisation des protéines ? Il y a plusieurs caractéristiques inhérentes aux protéines qui doivent être considérés pour fournir une caractérisation suffisamment détaillée de la molécule : - Composition en acides aminés - Séquence d’acides aminés - Variants de charge - Désamidation / isomérisation - Oxydation - Glycation - Séquence N- et C-terminale - Glycosylation N et O - Ponts disulfures - Agrégation - Structures d’ordre supérieur (secondaire, tertiaire, quaternaire) → De nombreuses modifications chimiques, qui sont généralement indésirables et qui doivent être caractérisées, sont introduits lors de la fabrication et du stockage. Principales variantes de protéines/mAbs à caractériser : 1. Désamidation, isomérisation d’Asp, succinimide 2. Acide pyroglutamique N-terminal Variants de charge 3. Lysine C-terminale 4. Glycation 5. Oxydation 6. « Brouillage » de la liaison disulfure Variants d’hydrophobicité 7. Glycosylation Variant d’hydrophilie TUYAU : comment séparer différents variants et sur quelles bases ? Variants de charge : impactent la charge de la protéine. → Techniques utilisées : électrophorèse capillaire, chromatographie ionique (peu utilisée pour les petites molécules de synthèse mais bien pour les protéines). Variant d’hydrophobicité : mAb oxydé ou ayant subi une modification de ses ponts disulfures. → Techniques utilisées : HPLC en phase inverse. Variant d’hydrophilie : modification de la structure de sucres. → Techniques utilisées : chromatographie HILIC (séparation sur base de la polarité mais travail avec des phases mobiles hydro-alcooliques). Approches analytiques pour les protéines : Identité, hétérogénéité, contenu d’impureté et activité de chacun des nouveaux lots de mAbs devrait être étudié en profondeur avant libération. En raison de la complexité des protéines, on a besoin d’avoir un arsenal de techniques, plutôt qu’un outil analytique unique. → Méthodes chromatographiques RPLC, SEC, IEX, HIC,... → Méthodes électrophorétiques CZE, cIEF, CGE, SDS-PAGE,... → Méthodes de spectrométrie de masse ESI, MALDI, native-MS,... → Méthodes spectroscopiques CD, FT-IR, FL,... Savoir expliquer : Le type de méthode analytique utilisée pour mettre en évidence certaines modifications. Le type d’impureté recherchée par chaque technique (ou chaque combinaison) analytique. Analyse des variants de charges (IEX, cIEF) On se base sur le point isoélectrique de la protéine, on va essayer d’identifier les impuretés qui ont un point isoélectrique différent. Par exemple si la molécule perd un AA, on aura une impureté plus ou moins acide/basique par rapport au produit de départ et le point isoélectrique sera donc différent. La plupart des anticorps monoclonaux ont un PI aux alentours de 8-9. Le PI peut être exploité pour faciliter la séparation. Les variants de charge des mAbs sont généralement désignés comme étant des espèces acides ou basiques par rapport à l’isoforme principal. Les espèces acides sont des variants avec un PI apparent plus faible, tandis que les espèces basiques sont des variants avec un PI apparent plus élevé. → On impacte la charge par modification de la structure primaire (on apporte ou on enlève de l’acidité/basicité). Par exemple si on perd un NH2, on perd de la basicité donc on devient acide. Remarque : la quantité d'impuretés qu'on retrouve dans les produits sont énormes par rapport à une molécule de synthèse → études de toxicité et d'efficacité pour définir une limite (en %). Les pourcentages tolérés d’impuretés sont donc parfois très élevés ! Pic principal (main peak) = particule de départ. (1) Principe général de l’IEX (échange cations) : Les séparations IEX sont réalisées avec des colonnes constituées de groupes ionisés ou ionisables à leur surface. - La rétention est régie par des interactions électrostatiques entre les charges opposées sur la surface de la particule et la protéine - La sélectivité est dictée par la différence de charges protéiques - L’élution est réalisée en exécutant un gradient de sel Phase stationnaire en IEX : Phase mobile en IEX : Sélection du pH de la phase mobile : En changeant le pH de la phase mobile, on modifie la charge des espèces de mAb. Les conditions de pH doivent être sélectionnées pour avoir des mAbs et une phase stationnaire sous forme chargée. Leurs charges devraient être opposées. Les mAbs possèdent généralement un PI basique et CEX domine. Augmenter le pH pour les espèces basiques de mAb réduit la rétention (réduction du nombre de charges). → Pour les mAbs, l’IEX est souvent effectuée avec un tampon à pH autour de 6. L’échange de cations est le plus utilisé pour l’analyse des mAbs (avec pI > 8). Choix du sel : La concentration en sel permet un ajustement de la rétention du composé. Une augmentation de la concentration en sel permet une réduction de la rétention. Un gradient de sel est généralement effectué pour ajuster la sélectivité et la rétention. → Pour les mAbs, on utilise souvent un gradient NaCl de 0 à 500 mM → Résumé : on s’arrange pour travailler à pH 6, les anticorps monoclonaux seront chargés positivement (car PI aux alentours de 8-9). Il nous faut donc un support anionique (pour avoir charges opposés). On essaie de ne pas trop changer le pH sinon la protéine risque de précipiter dans la colonne (on reste au pH de départ) et on augmente la quantité en sel dans la phase mobile pour former un gradient de sel qui va permettre d’éluer. Analyse typique de mAbs en IEX (= technique clé pour la détermination des variants de charge) : Le pic majoritaire est en bleu, il y a des impuretés à caractère acide en rouge (sortent en premier) et il y a les variants basique (chargés +) en vert (sont retenus sur la colonne et seront élus en derniers. Un Ac pur a un seul pic, mais certains Ac ont beaucoup de variants de charge : si ces variants de charges ont un impact sur la santé, ils doivent être purifiés jusqu’à leur disparition, mais s’ils n’ont pas d’impact sur la santé ni sur l’efficacité du médicament, alors ils peuvent être tolérés.  → On somme tous les variants acides/basiques et on regarde par rapport aux limites autorisées si on est dans les normes. Remarque : souvent, il est difficile de séparer le pic principal des impuretés car il y a co-élution. Peut-on développer une méthode générique en IEX L’IEX pour caractériser la désamidation des mAbs : pour les mAbs ? Lors du contrôle de qualité, on recherche par exemple Chaque anticorps monoclonal à un pI différent. des réactions de désamidation. Désamidation = Élution de tous les mAbs (pI entre 6,7 et 9,1), en transformation, avec le temps, de l’amide en acide utilisant des conditions génériques de gradient salin carboxylique (car instable en solution). IEX. Possibilité de quantifier l’hétérogénéité des mAbs et la quantité de variants acides/basiques. (2) Principe de la focalisation isoélectrique (cIEF) Capillaire Isoélectrique Focusing (cIEF) : technique électrophorétique sur gel (sans EOF = flux électroosmotique) utilisée pour séparer les peptides et les protéines en fonction des valeurs de point isoélectrique (pI). La résolution du pI peut atteindre 0,01 unité de pI. Dans cette technique, un gradient de pH est formé dans le capillaire à l’aide d’ampholytes. Avec une solution basique à la cathode et une solution acide à l’anode, après application du champ électrique, les ampholytes et protéines chargées migrent dans le milieu jusqu’à ce qu’elles atteignent une région où elles deviennent non chargées (à leur pI). → On a un capillaire creux rempli d’un tampon avec un gradient de pH (acide à gauche et basique à droite). On injecte l’analyte puis on applique un champ électrique. Les protéines s’arrêtent à leur point isoélectrique (chacune à un endroit différent du capillaire). En poussant mécaniquement, on les fait sortir et passer au niveau du détecteur. On obtient un électrophorégramme sur lequel sont repris les différents variants (d’abord les basiques puis les acides). La séparation est incomplète donc on fait souvent 2 méthodes pour vérifier qu’on a pris en compte toutes les impuretés : électrophorèse (cIEF) et échange d’ions (IEX) → comparaison des résultats (on vérifie que 2 méthodes orthogonales donnent le même résultat).  Analyse des variants hydrophobes (RP-LC, CZE, MEKC) → On travaille en phase inverse Principe de la RPLC (chromatographie de phase inverse) : - Phase mobile polaire, hydroalcoolique (eau, acétonitrile, méthanol...) - Phase stationnaire apolaire (C18, C8, C4, phényl...) - Interaction hydrophobe entre les chaînes latérales non polaires et la surface non polaire - Interaction électrostatique entre les chaînes latérales chargées et les silanols de la phase stationnaire - Élution : augmentation de la concentration du solvant organique RPLC de mAbs : problèmes techniques : Problèmes Raisons Solutions Cinétique d’interaction ionique Phase stationnaire avec accès secondaire lente limité aux silanols résiduels Jusqu’à > 100 charges positives sur les Réactif d’appariement ionique protéines (TFA) Température élevée (> 60° C) Faible Dm des grandes molécules Phases avec pores + larges Accès limité aux pores Température élevée (> 60° C) Phase stationnaire efficace (particules sub-2μm, core-shell) Donneur / accepteur d’hydrogène fort Phase stationnaire moins Nombreuses charges positives et hydrophobe (C4 vs. C18) négatives Température élevée (> 60° C) Système LC dédié (bioinerte) On remarque qu’une haute température diminue ces 3 problèmes.  On doit faire attention : - À ne pas précipiter sa protéine au contact de solvant organique (se renseigner sur la tolérance de sa molécule au solvant organique). - À la nature de la phase stationnaire : plus la protéine est grosse, plus elle s’adsorbe de manière « définitive » sur une phase stationnaire trop hydrophobe (à partir de C8) : - Si grosses molécules : on utilise une phase stationnaire C4 - Si petites molécules : on utilise une phase stationnaire C18 - Phénomène de tailing : interactions hydrophobes (on les souhaite avec la phase stationnaire). L’anticorps interagit avec la phase stationnaire via ses poches hydrophobes mais ses charges + peuvent rencontrer des silanols résiduels chargés – et former une interaction ionique plus forte → provoque des pics qui trainent à l’arrière. Concerne surtout les médicaments à caractère basique (qui s’ionisent positivement). Pour lutter contre le tailing, on peut : - End-capping : on achète une colonne « end-capped » c’est-à-dire que des groupements sont attachés de manière covalente sur les silanols résiduels. - Amines compétitrices : on ajoute une amine dans la phase mobile qui se fixe préférentiellement au « - » des silanols et va donc empêcher l’interaction silanol-mAb (agents qui masquent la charge des silanols). - Agent de paire d’ions : petite molécule acide qui forme une paire d’ion avec le mAb (devient globalement neutre et ne réagit plus avec les silanols résiduels). - Travail à pH très acides (pH 2) qui empêche l’ionisation du silanol. Attention : pas utilisé ici car les protéines précipitent à ce pH !!! Analyse de variants d’oxydation en RPLC : Analyse de mAb intacts en RPLC : → On a des formes de pics impressionnantes pour la RPLC d’un mAb intact de 150 kDa. Les informations obtenues à partir de ces expériences sont trop limitées (MS ?). Rappel : particules petites (jusqu’à UHPLC) → pics fins et bien résolus. Importance de la haute température pour les mAbs : On injecte 5x la même solution : - A 40°C on n’a quasi pas de pic (molécule non sortie). - En augmentant la température (40 → 80°), on diminue son attache à la phase stationnaire (son temps de rétention devient plus court). On récupère toute notre protéine (= pic haut) et on améliore la séparation (= pic plus fin). → Le pic s'affine très fort et est plus intense ce qui permet de faire de la quantification plus fiable, on sépare mieux les impuretés les unes des autres. On s’arrange pour ne pas avoir des analyses trop longues à haute température car la protéine peut se dégrader (elle n’a pas le temps de se dégrader si les analyses sont plus courtes). Donc en résumé : avec les protéines → T° = 70-80°C (four, colonne) + analyses pas trop longues car à cette T° le mAb va commencer à se dégrader. Peptide mapping (cartographie peptidique) Le « peptide mapping » est retrouvé dans toutes les monographies de la Ph.Eur pour identifier une protéine. Quand on analyse des grosses protéines, on peut les analyser intactes ou en petits morceaux. Ce sont 2 approches intéressantes mais chacune avec leurs limitations. On peut analyser la protéine complète dite « intacte » : - Un pic principal correspond à la molécule active - Des plus petits pics correspondent aux impuretés → Limitation : la spécificité. - PM de l’Ac monoclonal = 1500 Da - PM de sa forme oxydée = 1516 Da On ne pourra pas différencier l’Ac monoclonal de l’impureté oxydée par exemple. Il est donc difficile de séparer, sur base de la protéine intacte, l'Ac monoclonal et sa forme oxydée. Si on a une grosse protéine, on peut aussi l’analyser après l’avoir coupée en petits morceaux (digestion par la trypsine = une enzyme caractéristique qui coupe derrière les lysines et arginines). On forme alors des peptides et on peut travailler sur ce mélange de peptides → on obtient des informations différentes. On a donc un mélange de peptides : on aura une meilleure sensibilité car chaque peptide fait +- 100 Da donc si le peptide oxydé fait 116 Da → plus facilement séparables. → Limitation : perte de la structure 3D (les tests associés à la structure ne sont plus faisables) et on ne sait pas mettre en évidence des produits d'agrégation si la protéine est digérée. Perte de structure 3D = perte d’informations. Exemples : Peptide mapping par RPLC Chaque pic = 1 peptide On digère notre Ac monoclonal d’intérêt et la substance chimique de référence (SCR) en parallèle. On analyse les deux solutions qui contiennent des peptides puis on les compare. Peptide mapping par RPLC Comparaison des 2 spectres : c’est plus fiable de faire la comparaison de plusieurs pics (en termes de temps de rétention et d’intensité) ! Il ne faut pas se baser sur un seul pic et donc un seul temps de rétention. Si on a des pics aux mêmes temps de rétention et mêmes intensités que ceux du peptide de la SCR digérée, c’est bcp plus précis, le degré de confiance est supérieur qu’en se basant sur un seul temps de rétention (surtout pour des protéines recombinantes). Bien comprendre : s’il y a mutation ou dégradation (par ex un AA remplacé par un autre dans le peptide), ça va se marquer assez fort sur ce peptide et il va se décaler par rapport à son peptide de référence → pic du peptide muté sera décalé par rapport à celui qui devait correspondre dans la SCR. Peptide mapping par CZE = électrophorèse capillaire de zone. On fait une séparation sur base de la charge et de la masse. On couple au spectromètre de masse MS, qui permet l’identification des peptides. Séparation des peptides en fonction de leur migration dans un champ électrique. On peut comparer les temps de migration → même chose mais on compare les temps de migration. C’est intéressant d’avoir les deux types d’approches dans le laboratoire. → La LC et l’électrophorèse capillaires sont des méthodes orthogonales donc on peut espérer couvrir toute la séquence de la protéine en comparant les deux approches et en combinant les résultats (on peut mettre en évidence des profils de peptides différents avec 2 mises en évidence différentes). Peptide mapping par MEKC = chromatographie d’électrophorèse micellaire. Séparation du produit de désamidation de l’insuline (impureté majeure) par rapport à la forme intact de l’insuline. Séparation en fonction de la charge, la masse et de l’affinité pour les micelles. Permet de séparer l’insuline de son impureté principale en peu de temps (méthode utilisée en industrie).  Analyse des variants hydrophiles (glycovariants par HILIC ou CGE) Importance des glycovariants : des études récentes de la glycosylation d’anticorps ont confirmé que cette modification post-traductionnelle est essentielle. En effet, les mAbs aglycosylés sont largement non fonctionnels. Les propriétés du glycane attaché au mAb jouent un rôle essentiel dans sa spécificité et sa sélectivité. Il existe une grande hétérogénéité entre les oligosaccharides impliqués dans la glycosylation de mAb, ce qui donne > 100 glycoformes différentes. → Les mAb peuvent contenir différentes formes de sucres et on a souvent des combinaisons de sucres. Il y a deux grands types de glycans analysés en contrôle de qualité : N-glycan : sucres liés au groupe amide sur la O-glycan : sucrés liés au groupe hydroxyle de la chaine latérale de l’asparagine sérine ou de la thréonine  Les N-glycanes sont beaucoup plus importants que les O-glycanes pour l’innocuité et l’efficacité des médicaments → ce sont les plus critiques en termes d’efficacité et de sécurité (les + surs). Les glycovariants des mAbs : - Les glycans des IgG représentent en moyenne seulement 2 à 3 % de la masse totale du mAb. - Un site principal de N-glycosilation situé sur chaque CH, quelques sites de glycosilation d’O - Le système de production utilisé pour la fabrication d’IgG recombinées (CHO, NS0, SP2/0) affecte fortement leur profil glycane. Pour analyser ces sucres : on utilise une enzyme qui clive les sucres (qui libère les sucres de l’anticorps) pour les analyser séparément sinon la partie protéique prend le dessus dans l'analyse (en termes de taille). Les sucres n’ont pas de chromophore (pas d’absorption en UV possible) donc dérivatisation à l’aide d’un fluorophore pour faire de la détection en fluorescence, puis chromatographie en mode HILIC car molécules très très polaires (elles ne vont pas s'accrocher en phase inverse). (1) HILIC-FD des glycanes libérés/marqués : La chromatographie HILIC combine les caractéristiques des trois principales méthodes de LC et permet l’analyse de composés hautement polaires. - La phase stationnaire est polaire (silice, amide, amine...) - La phase mobile est hautement organique (70 - 95% ACN) - L’eau a la plus haute force éluante en HILIC Les glycanes dérivatisés sont analysés dans des conditions HILIC en utilisant une phase stationnaire amide et une phase mobile contenant une proportion élevée d’ACN. (2) HILIC-MS du Trastuzumab - 6 principaux glycoformes séparés en HILIC - La chromatographie HILIC couplée au MS permet une comparaison directe et immédiate des profils de glycosylation (3) CGE-LIF des glycanes libérés/marqués : - EC en gel car permet de faire de belles séparations. - Possibilité de coupler à la fluorescence → Image différente mais complémentaire de celle obtenue en HILIC avec fluorescence - Avantages : différenciation des isomères et des glycoformes + hétérogénéité de la sialylation - Inconvénients : instrument dédié nécessaire (LIF) et long processus (24h pour 6 échantillons)  Analyse de variants de taille (agrégats par SEC ou CGE) L’agrégation de protéines désigne le processus par lequel les molécules protéiques s’assemblent en complexes stables composés de deux ou plusieurs protéines, les protéines individuelles étant désignées comme monomères. L’agrégation des protéines représente un défi majeur dans la fabrication de produits biopharmaceutiques protéiques. L’agrégation a un effet délétère sur l’efficacité et la sécurité (réponse immunogène). → Défi très important car c’est très compliqué de séparer un monomère d’un dimère → La liaison entre 2 mAbs n’est pas covalente (liaisons faibles entre les morceaux). Le système analytique ne doit pas modifier la quantité de dimère vue au détecteur, il faut donc trouver des conditions qui ne perturbent pas l'équilibre des différentes formes dans l'échantillon. (1) Size exclusion chromatography = chromatographie d’exclusion stérique (SEC) Principe : particules avec pores +- larges → les petites molécules rentrent dans les pores et sont retardées contrairement aux grosses molécules. Plus les particules sont larges plus elles vont sortir rapidement de la colonne. Pour autant qu'il n'y ait pas de solvant organique dans la phase mobile, cette chromatographie peut être utilisée pour séparer des monomères, dimères etc. Si présence d’un solvant organique dans la phase mobile → on forme des monomères à partir des dimères (ce qu’on ne veut pas). La phase mobile a un pH proche du pH physiologique et elle contient des sels. → Aucune interaction chimique avec la surface de la phase stationnaire → Séparation physique au moyen de pores ayant une accessibilité différente pour des molécules de différentes tailles SEC pour les mAbs : La SEC est une technique clé pour la mesure des agrégats de protéines. Avantage : technique largement acceptée par les organismes de réglementation. Des méthodes SEC quantitatives peuvent être validées. Inconvénients : la SEC a une résolution limitée et n’est pas capable de discriminer les poids moléculaires proches. Les colonnes sont coûteuses et de courte durée de vie.  Colonne : Thermo MAbPac SEC-1 300 x 6,8 mm, 5 μm Phase mobile : 0,3 M NaCl dans 50 mM phosphate pH 6,8 - La phase stationnaire doit être aussi inerte que possible (p. ex., silice liée au diol). - La phase mobile doit limiter autant que possible - La taille des pores doit être définie avec précision les interactions entre les protéines et la phase (dans l’intervalle de 100 à 2000 Å). stationnaire et son pH doit être proche des - Une colonne de grand volume doit être utilisée conditions physiologiques. avec un débit faible, afin d’avoir une fenêtre de rétention suffisante pour les mesures en SEC (grand T0). SEC moderne ? - Réduction de la taille des particules - Colonnes : plus courtes et de plus faible diamètre → Séparation plus rapide qu’en SEC normale. On ne peut pas trop jouer avec la composition de la phase mobile mais plutôt sur la taille des particules : + les particules sont de faible diamètre, plus on gagne en efficacité de pic et meilleure est la séparation. Remarque : il est difficile d’avoir un contrôle de qualité fiable pour ce type d’impureté (2) Capillary Gel Electrophoresis (CGE) Principe : - La CGE est la version moderne de SDS-PAGE. Elle offre une résolution plus élevée, une meilleure reproductibilité et une analyse plus rapide. - La CGE est réalisée dans une matrice de polymère en gel poreux, où la séparation est effectuée - Dans la CGE, les gels sont contenus dans un capillaire étroit, plutôt que sur une plaque de gel - Dans le capillaire, les espèces sont séparées en fonction de leur taille. → Les plus grosses molécules migrent en dernier (elles sont freinées dans le gel) et les plus petites en premier. - En raison de l’ajout de SDS et du traitement à T° élevé, cette technique est adaptée pour l’analyse des fragments (dénaturation des agrégats). SDS-PAGE vs CGE : Rem : en complément des dias du cours, il vous est recommandé de visualiser les 2 capsules vidéos intitulées : « comment analyser les peptides et les protéines par HPLC ? ». Sur e-campus, accès du cours d’ADM, accès SPOC, SPOC HPLC 2, section 11 partim 1 et 2.  Exemples de monographies de la Ph. Eur Savoir expliquer pourquoi on demande une telle ou une telle analyse (qu’est-ce qu’on espère séparer) + expliquer le principe de l’analyse. À gauche : la monographie et à droite : le résumé. 1) Glucagon Production : - Protéines issues de la cellule hôte - ADN issu de la cellule hôte ou du vecteur Identification : - RP-LC cartographie peptidique - RP-LC sur protéine intacte Essai : - Protéines apparentées et formes désamidées (RP-LC sur protéine intacte) - Teneur en eau - Endotoxines bactériennes Dosage : - RP-LC sur protéine intacte 2) Insuline Production : - Protéines issues de la cellule hôte - Précurseur à chaine unique Identification : - RP-LC sur protéine intacte - RP-LC cartographie peptidique Essai : - Impuretés de masse moléculaire supérieure à celle de l’insuline (SEC) - Protéines apparentées (RP-LC protéines intactes) - Immunoréactivité de type pro-insuline (méthode immunochimique) - Zinc (SAA) - Perte à la dessication - Centres sulfuriques - Endotoxines bactériennes Dosage : - RP-LC sur protéine intacte 3) Interféron beta-1a Production : - Protéines issues de la cellule hôte - ADN issu de la cellule hôte ou du vecteur - Formes à séquence N-terminale tronquée - Dimère et substances apparentées de masse moléculaire supérieure Identification : - Activité biologique - Distribution des isoformes par ESI-MS - RP-LC cartographie peptidique Essai : - Impuretés de masse moléculaire supérieure à celle de l’interféron bêta-1a (SDS-PAGE) - Interféron bêta-1a oxydé (RP-LC de la cartographie peptidique) - Endotoxines bactériennes Dosage : - RP-LC sur protéine intacte (C4) - Activité biologique 4) Infliximab Production : - Protéines issues de la cellule hôte - ADN issu de la cellule hôte ou du vecteur - Protéine A résiduelle - Analyse glycanique (IEX) - Variants chargés (focalisation isoélectrique = cIEF et IEX) Identification : - Activité - RP-LC cartographie peptidique Essai : - pH - Protéines apparentées (CGE en conditions réductrices et non réductrices) - Impuretés de masse moléculaire différente de celle de l’infliximab (SEC) Dosage : - UV - Activité → Une des plus grosses molécules commercialisée  Produits finis Les tests effectués sur les produits finis sont similaires à ceux dédiés aux matières premières. Exemple de tests effectués pour la libération de lots de biopharmaceutiques :