Méthodes d’études de la cellule II - Cours - PDF

Méthodes d’études de la cellule II UNIVERSITE D’ALGER -FACULTE DE MEDECINE ZIANIA CHATEAUNEUF –DEPARTEMENT DE MEDECINE. PREMIERE ANNEE DE MEDECINE ANNEE UNIVERSITAIRE 2024/2025...

Méthodes d’études de la cellule II UNIVERSITE D’ALGER -FACULTE DE MEDECINE ZIANIA CHATEAUNEUF –DEPARTEMENT DE MEDECINE. PREMIERE ANNEE DE MEDECINE ANNEE UNIVERSITAIRE 2024/2025 MODULE DE CYTOLOGIE. PR YAHIA/DR FOUKRACHE/DR DEKAR  La technique de coloration négative Principe : Le contraste négatif permet d'assombrir le fond sans colorer l'objet lui-même. Les structures apparaissent en « négatif » / en clair sur fond sombre.  Intérêt Description morphologique (morphologie externe ) de macromolécules(ATP osomes ) ou d’organites (ex :les ribosomes ), de virus , bactérie, mais après isolement Bactériophage Virus Ebola Ces différentes structures apparaissent en clair sur un fond sombre ATP osomes mitochondriales Architecture moléculaire des éléments du cytosquelette (microtubules , microfilament d’actine..),de la chromatine, des pores nucléaires ,mais après isolement par UCD -UGD. Architecture moléculaire des microfilaments d’actine =arrangement hélicoidal des éléments de base( voir cours cytosquelette )  9ique Principe : Consiste à vaporiser sous vide et sous un angle donné une très fine couche métallique (platine.. ) se déposant sur la surface de petites particules isolées , créant un effet d’ombre But : obtenir un effet d’ombre de la surface des petites particules isolées ; bactéries , virus , ADN ou protéines… Aspect morphologique Observation de surfaces externes d’échantillons entiers Après ombrage métallique Aspect en 3 D( en relief) Levures de bière Aspect biconcave des globules rouges Bactérie E. COLI Chromosomes humains  2 - Le microscope électronique à balayage MEB Principe de fonctionnement du MEB: observation par réflexion Colonne électronique sous vide Déflectrices du faisceau d’é L’ observation par réflexion grâce à un système de balayage Pouvoir de résolution = 22 nm Canon à électrons MEB condenseur Déflecteur du faisceau objectif Spécimen massif  Les domaines d’utilisation du MEB MEB Etude morphologique en 3D Ombrage Technique de répliques / Cryodécapage + métallique ombrage métallique échantillon entier Pour obtenir une métallisé réplique Etude des surfaces Etude des surfaces externes internes  1 - Observation de réplique après cryodécapage Réplique de la membrane plasmique (surface interne) et mise en évidence de particules membranaires = protéines transmembranaires Particules membranaires La technique de cryodécapage = étapes préparatoires d’un échantillon en vue de son analyse tridimensionnelle La technique de cryodécapage ou de réplique (surfaces internes) : La technique de cryodécapage est généralement applicable au MEB et s’effectue comme suit : La congélation de l’échantillon dans l’azote liquide (à-192°) La cryofracture à froid Le décapage par sublimation L’ ombrage métallique (platine + carbone) L’ obtention d’une réplique (moule) de la structure à étudier  Principe de l’Obtention d’une réplique(moule) d’une surface interne G L’ ombrage métallique MEB C- les procédés d’isolement des composants cellulaires (UCD, UGD). La Technique d’isolement 2 Homogénéisation Ultracentrifugation du tissu Ultracentrifugation Ultracentrifugation sur Homogénat différentielle UCD gradient de densité de cellulaire saccharose UGD Fractions/ Surnageants Bandes Culots Remarque : les résultats de chaque étape sont représentés en rouge 1-Principe de fractionnement / homogénéisation cellulaire Homogénat cellulaire Les méthodes de fractionnement consistent à séparer les différents composants cellulaires par destruction de la membrane plasmique, puis par désorganisation de la cellule. On obtient un homogénat avec tous les constituants de la cellule. La plupart des organites restent intactes, l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique vont être fragmentés sous forme de vésicules appelées microsomes(microsomes lisses et rugueux).  2 – L ’Ultracentrifugation cellulaire La centrifugation différentielle est un procédé de séparation des composés de l’homogénat en fonction de leur différence de densité en les soumettant à une force centrifuge Pour cela on centrifuge l’homogénat à différentes vitesses ; à chaque vitesse, différents organites se déposent dans le culot. L’appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse nommée centrifugeuse La vitesse de sédimentation est définie par le coefficient de sédimentation en unité Svedberg (S).  La macromolécule est Principe de la centrifugation soumise à une force centrifuge F Rotor à bras mobile Sous l ’effet de cette force , les molécules se déplacent vers le fond du tube tournant surnageant 2 -1 - La centrifugation différentielle Les constituants de l’homogénat se déposent selon leur densité à des vitesses de centrifugation différentes (croissantes )  Principe de l’UCD Les éléments se déposent selon leur poids et leur taille 2- 2 - La centrifugation sur gradient de densité de saccharose ou UGD : La centrifugation ( étape 4) entraine le déplacement des composants du culot ( récupéré à l’UCD ) à travers le gradient de densité de saccharose et s’arrêtent en une bande à leur densité (étape 5). Technique d’UGD Purification de chaque culot obtenu par UCD  Culot d’UCD Gradient de densité de saccharose Récupération des bandes  L’ UCD consiste à récupérer en plusieurs centrifugation des culots à contenus hétérogènes S 4 =solution aqueuse du hyaloplasme S4 Homogénat Culot 1 Culot 2 Culot 3 Culot 4 Fraction noyaux mitochondries Grands Sous unités soluble cytosquelette lysosomes polysomes ribosomales peroxysomes Microsomes Petits polysomes S = surnageant lisses Macromolécules M. rugueux  Contenu de chaque culot après UGD Culot 1 = noyaux + éléments du cytosquelette Culot 2 = mitochondries + lysosomes + peroxysomes Culot 3 = grands polysomes +microsomes rugueux ( REG) + microsomes lisses ( REL , Appareil de golgi , membrane plasmique) Culot 4 = petits polysomes + sous unités ribosomales + macromolécules (glycogène ,triglycéride..)+ virus (si la cellule fractionné est infectée ) Le surnageant 4 correspond à la solution aqueuse du hyaloplasme  L’interét de la technique d’isolement Il est nécessaire d’isoler des structures cellulaires dans le but d’étudier :  leur composition chimique  leur morphologie externe (comme le cas :des ATP osomes mitochondriales , des ribosomes …..) par contraste négatif