Méthodes d'études de la cellule II

Méthodes d'études de la cellule II

• Cours de Cytologie : Première année de médecine, Année universitaire 2024-2025, Université d'Alger, Faculté de Médecine Ziania Chateauneuf, Département de Médecine.
• Enseignants : Pr Yahia, Dr Foukrache, Dr Dekar.

Technique de coloration négative

• Principe : Assombrir le fond sans colorer l'objet. Les structures apparaissent en clair sur fond sombre.
• Utilisation : Observation de bactéries, virus, ADN ou protéines. Permet d'obtenir une description morphologique externe des macromolécules, des ribosomes, ou des organites après isolement.

Intérêt de la technique

• Bacteriophages : Observation des structures cellulaires en clair sur fond sombre.
• Virus Ebola : Observation des structures cellulaires en clair sur fond sombre.
• ATP osomes mitochondriales : Visualisation des macromolécules ou organites.

Architecture moléculaire du cytosquelette

• Eléments étudiés : Microtubules, microfilaments d'actine, chromatine, pores nucléaires.
• Condition : Isolé par UCD-UGD.

La technique 9ique (effet d'ombrage)

• Principe : Vaporisation sous vide, sous un angle donné, d'une très fine couche métallique (platine) sur la surface de petites particules isolées.
• But : Obtenir un effet d'ombre de la surface des petites particules isolées (bactéries, virus, ADN ou protéines).
• Résultat : Aspect morphologique.

Observation de surfaces externes d'échantillons entiers (après ombrage métallique)

• Exemples : Levures de bière, Bactérie E. coli, Chromosomes humains, globules rouges.

Acariens

• MEB (Microscope Electronique à Balayage) : Taille environ 1mm.
• Exemples : Images d'acariens (image différents types).

Le microscope électronique à balayage (MEB)

• Principe : Observation par réflexion grâce à un faisceau d'électrons et un système de balayage.
• Pouvoir de résolution : 22 nm.
• Fonctionnement : Colone électronique sous vide, faisceau d'électrons, électro-aimants, détecteurs, écran de télévision.
• Différentes parties du Microscope : Le canon à électrons, le générateur de balayage, le condenseur, le déflecteur, l'objectif, le détecteur, l'écran vidéo.

Domaines d'utilisation du MEB

• Etude morphologique en 3D
• Technique de répliques/Cryodécapage + ombrage métallique : Pour obtenir une réplique
• Etude des surfaces externes et internes d'échantillons entiers métalisés.

Observation de réplique après cryodécapage

• Réplique de la membrane plasmique (surface interne).
• Mise en évidence de particules membranaires (protéines transmembranaires).

Technique de cryodécapage

• Préparation d'échantillons pour analyse tridimensionnelle.
• Processus : Congélation de l'échantillon dans l'azote liquide (-192°), cryofracture à froid, décapage par sublimation, ombrage métallique (platine + carbone),obtention d'une réplique (moule) de la structure à étudier.

Principe de l'obtention d'une réplique (moule) d'une surface interne

• Processus : Cryofracture, cryodécapage, ombrage métallique, dissolution du matériel biologique, observation de la réplique.

Les procédés d’isolement des composants cellulaires (UCD, UGD)

• Technique d'isolement : Utilisation de l'homogénéisation, l'ultracentrifugation différentielle (UCD), et l'ultracentrifugation sur gradient de densité de saccharose (UGD).
• Homogénéisation du tissu : Obtenir un homogénat cellulaire (mélange cellulaire avec tous les composants).
• Ultracentrifugation différentielle (UCD) : Séparation des composants cellulaires en fonction de leur différence de densité à différentes vitesses de centrifugation.
• Ultracentrifugation sur gradient de densité de saccharose (UGD) : Séparation des composants, selon leur densité, dans le gradient. Récupération des bandes à différentes densités.

Principe de fractionnement/homogénéisation cellulaire

• Méthodes utilisées : Fractionnement, Homogénéisation, destruction de la membrane plasmique et désorganisation de la cellule.
• Résultat : Obtention d'un homogénat cellulaire contenant les composants de la cellule. La plupart des organites restent intactes, sauf certains comme l'appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique qui sont fragmentés sous forme de microsomes (lisses ou rugueux).

L’Ultracentrifugation cellulaire

• Principe : Séparation des composants de l'homogénat selon leur différence de densité par centrifugation à différentes vitesses.
• Matériel utilisé : Machine tournante à grande vitesse nommée centrifugeuse.
• Définition de la vitesse de sédimentation : Coefficient de sédimentation en unité Svedberg (S).

Principe de la centrifugation

• Rotor à bras mobile : La macromolécule est soumise à une force centrifuge.
• Composants : Homogénat cellulaire, tube à centrifuger, Rotor à bras mobile, surnageant, culot
• Fonctionnement : La force centrifuge fait déplacer les molécules vers le fond du tube. Les composants de tailles et densités différentes se séparent.

La centrifugation différentielle

• Processus : Centrifugation de l'homogenat à différentes vitesses pour séparer les composants en plusieurs culots.
• Détermination : Selon la densité et poids des particules.

Principe de l’UCD

• Séparation : Dépend du poids et de la taille des particules à séparer.
• Processus : Prélèvement successifs des surnageants, séparations des éléments selon leur poids et taille.

La centrifugation sur gradient de densité de saccharose (UGD)

• Séparation : Composant du culot récupéré par UCD sépare à travers le gradient de densité de saccharose.
• But : Purification de chaque culot obtenu par UCD. séparation en bandes.

L'intérêt de la technique d'isolement

• Objectif : Étudier la composition chimique et la morphologie externe des structures cellulaires (ATP osomes mitochondriales, ribosomes) par contraste négatif.