Desnaturalización y ADN Recombinante

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Questions and Answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones describe mejor el proceso de desnaturalización del ADN?

La desnaturalización se produce cuando se baja la temperatura.

Las dos cadenas de ADN se mantienen unidas a altas temperaturas.

La desnaturalización no afecta la absorción a 260nm.

El ADN se desnaturaliza a medida que se aumenta la energía calórica. (correct)

¿Qué ocurre cuando se baja la temperatura del ADN desnaturalizado?

El ADN se renaturaliza al interaccionar por complementariedad. (correct)

Se forma ADN recombinante sin necesidad de complementos.

Las cadenas se separan aún más.

Las bases permanecen expuestas y no interactúan.

¿Qué son las enzimas de restricción y su función principal?

Son proteínas que ensamblan ADN.

Son enzimas que degradan proteínas en la célula.

Son responsables de la replicación del ADN.

Son endonucleasas que cortan el ADN en el interior de la molécula. (correct)

¿Cómo evitan las enzimas de restricción degradar el ADN de la bacteria que las produce?

Por modificación química que incluye grupos metilo en su ADN. Signup and view all the answers

¿Qué se entiende por ADN recombinante?

Es un ADN que se forma a partir de materiales genéticos de distintos orígenes. Signup and view all the answers

¿Qué son las secuencias palindrómicas en el contexto del ADN?

Secuencias que se leen igual de 5' a 3' en ambas hebras. Signup and view all the answers

¿Cuál es la máxima absorción de ADN que se observa a altas temperaturas?

A 90°C. Signup and view all the answers

¿Qué ocurre durante el proceso de hibridación del ADN?

Se pueden unir secuencias complementarias al ADN desnaturalizado. Signup and view all the answers

¿Qué hace la enzima de restricción HAE III?

Corta de manera lineal entre las uniones CG Signup and view all the answers

¿Qué se necesita para que el ADN1 y ADN2 se unan correctamente?

Deben ser cortados por la misma enzima de restricción Signup and view all the answers

¿Qué función cumple la ADN T4 LIGASA en el proceso descrito?

Genera una unión covalente entre fragmentos de ADN Signup and view all the answers

¿Qué ocurre durante la electroforesis en gel de agarosa?

Se separan de acuerdo a su tamaño Signup and view all the answers

¿Por qué no se necesita SDS durante la electroforesis en gel de agarosa en este proceso?

Porque los ácidos nucleicos ya están cargados negativamente Signup and view all the answers

¿Qué ocurre con el fragmento recombinado durante la electroforesis?

Se sitúa más arriba que los fragmentos individuales Signup and view all the answers

¿Qué sustancia se utiliza para visualizar los fragmentos de ADN en el gel?

Bromuro de etidio Signup and view all the answers

En el proceso de obtención de ADN recombinante, ¿qué es lo que interacciona entre sí?

Los fragmentos de ADN1 y ADN2 Signup and view all the answers

¿Qué es una sonda en el contexto de la hibridación?

Un fragmento de desoxirribonucleótidos con secuencia complementaria al ADN objetivo. Signup and view all the answers

¿Qué método se utiliza para visualizar la banda de ADN tras la hibridación?

Electroforesis y microscopía de fluorescencia. Signup and view all the answers

En un Southern blot, ¿qué se busca identificar?

La presencia de ADN en estudio utilizando sondas. Signup and view all the answers

¿Cuál es la diferencia principal entre hibridación y secuenciación?

La secuenciación permite confirmar secuencias largas de nucleótidos. Signup and view all the answers

¿Qué tipo de mezcla se revela mediante un Northern blot?

Mezcla de ARN. Signup and view all the answers

¿Por qué se considera que una sonda es altamente específica?

Porque solo hibrida cuando todos sus nucleótidos son complementarios a los del ADN objetivo. Signup and view all the answers

¿Qué se debe hacer para identificar una banda en la membrana después de la hibridación?

Tratar la membrana con una solución que contenga la sonda. Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones es correcta respecto a la secuenciación?

Permite conocer la secuencia exacta de nucleótidos en cadenas largas. Signup and view all the answers

¿Cuál es la función principal de la clonación en biología molecular?

Hacer un análisis de secuencia o obtener proteínas recombinantes Signup and view all the answers

En la técnica de PCR, ¿cuál es la fase en la que se separan las cadenas de ADN?

Desnaturalización Signup and view all the answers

¿Qué temperatura se utiliza típicamente para la elongación en la PCR?

72°C Signup and view all the answers

¿Qué se necesita para que la ADN polimerasa inicie la elongación en la PCR?

Cebadores o primers específicos Signup and view all the answers

¿Cuál es la función de la TAQ polimerasa en la PCR?

Resistir altas temperaturas durante la elongación Signup and view all the answers

¿Qué se realiza si se desea separar el gen clonado de la mezcla de reacción en la PCR?

Realizar una electroforesis de gel de agarosa Signup and view all the answers

¿Qué se debe hacer para identificar nucleótido a nucleótido después de la clonación?

Utilizar una secuenciación o hibridación con una sonda específica Signup and view all the answers

¿Cuántas copias de la muestra original se obtienen después del primer ciclo de PCR?

2 copias Signup and view all the answers

¿Cuál es la función de los didesoxinucleótidos en el método Sanger?

Detienen la síntesis de la cadena de ADN en posiciones específicas. Signup and view all the answers

¿Cómo se visualiza la secuencia de nucleótidos en el método Sanger?

Analizando las posiciones de movilidad en un gel de agarosa. Signup and view all the answers

En el contexto del método Sanger, ¿qué ocurre cuando un didesoxinucleótido se incorpora a la cadena de ADN?

La síntesis se detiene. Signup and view all the answers

¿Qué proporciona cada tubo ependorf en el método Sanger durante la secuenciación de ADN?

Una única base de didesoxinucleótido para sintetizar cadenas. Signup and view all the answers

¿Cuál es la diferencia principal entre los métodos avanzados de secuenciación y el método Sanger tradicional?

Los métodos avanzados usan fluorocromos para la detección. Signup and view all the answers

¿Qué técnica se menciona como un método para obtener muchas copias idénticas de secuencias de ADN?

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Signup and view all the answers

Al analizar los resultados de la secuenciación por el método Sanger, ¿qué indica que un fragmento corrió más cerca del frente de corrida?

Que el fragmento tiene menos nucleótidos. Signup and view all the answers

¿Qué característica tiene un didesoxinucleótido que lo diferencia de un nucleótido normal?

No tiene grupo -OH en la posición 3’. Signup and view all the answers

Study Notes

Desnaturalización del ADN

El ADN bicatenario se desnaturaliza al aumentar la temperatura, debilitando los enlaces de hidrógeno que mantienen las hebras unidas.
Las bases nitrogenadas expuestas absorben la luz a 260 nm, con mayor absorción a temperaturas más altas, alcanzando el máximo a 90 °C.
Al disminuir la temperatura, las hebras monocatenarias de ADN se vuelven a unir por complementariedad de bases, formando ADN renaturalizado.
La hibridación implica la unión de ADN desnaturalizado a moléculas de desoxirribonucleótidos complementarias, también a temperaturas más bajas.

ADN Recombinante

Es una molécula de ADN creada in vitro combinando fragmentos de ADN de diferentes orígenes (por ejemplo, de bacterias y humanos).
Los enlaces covalentes mantienen unidos los fragmentos de ADN.
Las enzimas de restricción son endonucleasas bacterianas que cortan el ADN dentro de la molécula.
Estas enzimas protegen a las bacterias del ADN viral al restringir su entrada al citoplasma.
Las enzimas de restricción no degradan el ADN bacteriano porque modifican el ADN introduciendo un grupo metilo (CH3) en sus propios sitios de corte.
Reconocen secuencias palindrómicas de 4 a 8 pares de bases.
El sitio de restricción es la secuencia palindrómica donde la enzima corta el ADN.
Cada enzima de restricción corta un sitio específico, según la forma de su sitio activo.
Algunas enzimas, como Hae III, cortan linealmente, mientras que otras, como EcoRI y Hind III, cortan de forma escalonada, generando extremos cohesivos.
La unión de fragmentos de ADN de diferentes orígenes requiere el uso de la misma enzima de restricción para que los extremos coincidan.
La ADN ligasa T4 une covalentemente los fragmentos de ADN.
La electroforesis en gel de agarosa separa los fragmentos de ADN por tamaño, permitiendo identificar el ADN recombinante.
La banda correspondiente al fragmento recombinante se detecta utilizando bromuro de etidio, que se visualiza bajo luz ultravioleta.
La hibridación o la secuenciación se utilizan para identificar fragmentos de ADN específicos.

Hibridación

Implica el uso de una sonda o probe, un fragmento pequeño de desoxirribonucleótidos con secuencia complementaria al ADN o ARN a identificar.
Las sondas son altamente específicas, uniéndose solo cuando todos sus nucleótidos encuentran sus complementarios.
La membrana recibe los fragmentos de ADN del gel y luego se pone en contacto con una solución que contiene la sonda.
Si la sonda se une al ADN, la banda se puede visualizar utilizando marcadores radiactivos o fluorescentes.
El Southern Blot es el resultado de la hibridación de una mezcla de ADN con sondas correspondientes.
El Northern Blot es el resultado de la hibridación de una mezcla de ARN con sondas correspondientes.

Secuenciación

Determina la secuencia de nucleótidos en una cadena de ADN.
Se utiliza para corroborar secuencias largas de pares de bases, a diferencia de las sondas que solo pueden analizar unas 50 pares de bases.
El método Sanger utiliza didesoxinucleótidos, que carecen del grupo OH en la posición 3' y detienen la síntesis de ADN en el punto donde se incorporan.
Se realizan cuatro reacciones separadas, cada una con un didesoxinucleótido diferente (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).
La electroforesis permite separar los fragmentos de ADN por tamaño, permitiendo deducir la secuencia del fragmento.
Los métodos avanzados de secuenciación utilizan didesoxinucleótidos unidos a fluorescencia, que se detectan por un detector para determinar la secuencia.

Clonación

La clonación consiste en obtener múltiples copias idénticas de secuencias de ADN in vitro.
La técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y la tecnología de ADN recombinante son instrumentos esenciales para la clonación.
La clonación se utiliza para análisis de secuencia, diagnóstico, estudio de la función de genes, obtención de proteínas recombinantes y producción de organismos genéticamente modificados.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

La PCR se basa en la repetición cíclica de tres etapas: desnaturalización, hibridación y elongación.
La desnaturalización separa las hebras de ADN a altas temperaturas.
La hibridación permite a los cebadores o primers unirse al ADN a una temperatura más baja.
La elongación implica la adición de ADN polimerasa y una mezcla de desoxirribonucleótidos para extender la cadena de ADN a partir de los cebadores.
Se utiliza ADN polimerasa Taq, proveniente de bacterias, ya que es resistente a altas temperaturas, como las necesarias para la elongación (72 °C).
Cada ciclo de PCR duplica el número de copias de ADN, permitiendo una rápida amplificación.
La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para separar el gen clonado del resto de la mezcla de reacción.
La secuenciación o la hibridación con una sonda específica para la secuencia se utilizan para identificar el gen clonado.

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Description

Este cuestionario abarca conceptos clave sobre la desnaturalización del ADN y la creación de ADN recombinante. Explora cómo las temperaturas afectan las hebras de ADN y el papel de las enzimas de restricción en la ingeniería genética. Al final, podrás ver cuán interconectados están estos procesos en biología molecular.