Struttura degli acidi nucleici PDF

Strutture alternative Forma B Identifica la struttura a doppia elica proposta da Crick e Watson, ottenuta mediante diffrazione dei raggi X di fibre di DNA in condizioni di alta umidità e quindi anche in soluzione acquosa, come è la situazione in vivo. Questa non è l'unica possibile. Sono state descr...

Strutture alternative Forma B Identifica la struttura a doppia elica proposta da Crick e Watson, ottenuta mediante diffrazione dei raggi X di fibre di DNA in condizioni di alta umidità e quindi anche in soluzione acquosa, come è la situazione in vivo. Questa non è l'unica possibile. Sono state descritte varie altre strutture che il DNA può assumere in varie condizioni ambientali (perlopiù presenza di ioni diversi) o per particolari sequenze di basi. Forma A Se si riduce l'umidità in cui si trova la fibra di DNA, assume la forma A. Questa è destrorsa come la forma B, ma se ne differenzia per vari aspetti: - le coppie di basi hanno una > angolatura rispetto al piano all'asse della doppia elica; - 11 coppie di basi per ogni giro di elica; - il passo dell'elica è di 25 Å e il diametro è di 23 Å, ha forma + "ciotta" rispetto alla B. - la forma A la si trova anche in vivo, quindi in soluzione acquosa, per duplex formati da 2 filamenti di RNA o da un filamento di DNA e uno di RNA. Infatti la presenza dell' -OH nella posizione 2' del ribosio impedisce al DNA di assumere la forma B. (la forma B può essere assunta da duplex di DNA solo in condizioni non naturali di bassa umidità) Forma Z È un'elica sinistrorsa. Ha un diametro di 18 Å e un passo di 46 Å. Questa struttura è stata scoperta studiando DNA sintetici in cui G e C si alternano lungo la sequenza. Tuttavia, sono state ottenute prove sperimentali che suggeriscono che una piccola % del DNA nelle cellule è in forma Z, e sono state isolate delle proteine che si legano specificamente a tratti di DNA Z. La causa che lo genera è il cambiamento di orientamento del legame glicosidico tra la guanina e il deossiribosio. Lo zucchero e la base sono presenti nella rara conformazione "syn". La forma a "zig-zag” da cui il nome Z, si spiega con l'alternanza di conformazioni syn e anti di nucleotidi contigui. La figura Tripla elica In casi molto particolari possono formarsi regioni a tripla elica. Benché ne non sia stato dimostrato un ruolo naturale, riscuote un certo interesse perché potrebbe offrire la possibilità di sviluppare degli inibitori specifici x bloccare l'attività di geni bersaglio. Si può dire che un tratto di DNA duplex abbastanza lungo (20-30 coppie di basi), che ha un filamento composto di sole pirimidine e l'altro di purine, può accogliere nel solco maggiore una 3° catena polinucleotidica composta di sole pirimidine, complementare alla sequenza purinica con cui interagisce. Però questa catena polipirimidinica ha polarità 5' → 3' uguale a quella della sequenza di purine, e quindi inversa rispetto alla seq. pirimidinica della doppia elica. In questo tratto le 3 basi (2 pirimidine e 1 purina) si affacceranno verso l'interno formando legami H-H. In particolare, le purine formeranno legami H anche con le pirimidine della molecola extra: questi legami idrogeno non canonici si chiamano appaiamenti di Hoogsteen. Quartetti di G Si può formare tra 4 tratti di DNA o RNA a singolo filamento che contengano ciascuno 3 o + G consecutive. I 4 tratti di DNA si affiancano a formare una struttura a 4 filamenti (quadruplex) tenuti insieme da legami idrogeno tra le G. I legami H che si formano tra le quattro G sono del tipo "appaiamenti di Hoogsteen". I più comuni sono i quartetti di G intramolecolari, in cui i tratti di DNA contenenti le serie di G si trovano tutti su un singolo filamento che, ripiegandosi 3 volte su stesso, forma il quadruplex Esistono varie altre situazioni: quartetti di G intermolecolari in cui le 4 serie di G si possono trovare su 2 filamenti; le 4 serie di G posso trovarsi su 4 filamenti diversi. Anche se in genere gli orientamenti 5' → 3' dei 4 filamenti sono 2 a 2 antiparalleli, in alcuni casi possono avere tutti lo stesso orientamento. Strutture cruciformi e strutture a forcina Quando in un duplex di DNA (o anche di RNA) sono presenti, adiacenti o a breve distanza, 2 copie della stessa sequenza in orientamento opposto, esse vengono chiamate ripetizioni invertite. Se le 2 ripetizioni invertite sono adiacenti formano una sequenza palindromica (seq. di DNA duplex identica su entrambi i filamenti se letti nella stessa direzione 5' → 3). Le sequenze palindromiche, e ripetute invertite, presentano interessanti proprietà strutturali e funzionali. Struttura cruciforme Può essere assunta da DNA duplex contenenti una sequenza ripetuta e invertita: ciascun filamento di 1 delle 2 sequenze ripetute trova una regione complementare adiacente a cui appaiarsi nello stesso filamento. In questo modo costituiscono due "steli", mentre le basi che separano le due sequenze ripetute non hanno modo di appaiarsi e formano 2 "anse". Struttura a forcina Se prendiamo in considerazione un acido nucleico (DNA o RNA) a singolo filamento avente la stessa sequenza di 1 dei 2 filamenti del duplex appena descritto, potrà assumere una struttura con uno stelo a doppia elica e un'ansa detta “a forcina”. Queste strutture sono molto importanti, soprattutto per l’RNA. Infatti, il DNA si trova in genere come duplex coi 2 filamenti complementari e appaiati tra loro. L'RNA invece è solitamente costituito da un singolo filamento, prodotto della trascrizione di 1 dei 2 filamenti di DNA: è facile che brevi tratti di seq. possano trovare adiacenti seq. complementari con cui appaiarsi per formare forcine. DNA curvo A causa delle interazioni di impilamento lungo la molecola del DNA ci sono variazioni strutturali locali che possono influenzare la struttura complessiva. Se consideriamo 2 coppie di basi che si susseguono nel duplex, spesso non sono // tra loro ma formano piccoli angoli, ≠ a seconda delle particolari bp considerate. Esempi: A) 2 paia di basi A-T adiacenti hanno un'intrinseca tendenza a piegarsi dalla parte del solco minore, mentre 2 paia G-C hanno una tendenza inversa. → Duplex non perfettamente dritta, ma presenta piccoli piegamenti che tendono ad elidersi a vicenda dato che la seq. di nucleotidi è casuale, cosicché nell'insieme la struttura presenti solo delle deformazioni. B) Se un tratto di DNA contiene, 2 o 3 (esempio) paia di basi A-T consecutive, con una periodicità di ≈ 10 paia di basi (cioè ripetute a ogni giro di elica), i piccoli angoli formatosi si sommeranno tra loro producendo una curva dell'asse della molecola di DNA. L'accumulo di modificazioni sia del Tilt che del Roll nel DNA curvo possono risultare in strutture molto rigide.  Topologia del DNA e DNA topoisomerasi La struttura di 2 filamenti avvolti in una doppia elica pone dei problemi durante i processi che richiedono apertura dell'elica e la separazione dei filamenti (es. trascrizione e replicazione), dove il DNA si attorciglia su se stesso a formare strutture complesse, dette superavvolgimenti. Se non controllate, possono interferire con espressione dei geni, duplicazione del DNA e segregazione dei cromosomi. Lo stato superavvolto del DNA contiene energia utilizzata per aprire i 2 filamenti o alle origini di replicazione o nelle regioni dei promotori. Queste alterazioni topologiche avvengono sul DNA circolare covalentemente chiuso (plasmidi) o tratti di DNA lineari le cui estremità siano ancorate a strutture del cromosoma. Per controllare il grado di superavvolgimento del DNA è necessario che il DNA venga tagliato, su 1 o entrambi i filamenti, fatto ruotare e infine rilegato. Per svolgere al questo compito, gli organismi hanno selezionato una classe di enzimi chiamati TOPOISOMERASI, che hanno tagliano in maniera transiente filamenti del DNA. Consideriamo 2 filamenti circolari chiusi che si avvolgono l'uno intorno all'altro nello spazio e immaginiamo che i 2 filamenti possano passare l'uno attraverso l'altro ed essere così separati. Linking number (Lk) - il n° di volte che un filamento dovrebbe passare attraverso l'altro, in modo che essi possano essere completamente separati generando 2 circoli a singolo filamento La frequenza (quante volte un filamento si avvolge sull'altro) e la posizione di entrambi nello spazio possono essere descritte da due grandezze: - il twist (Tw, "torsione"): n° di avvolgimenti di tipo Watson e Crick tra i 2 filamenti. - il writhe (Wr,"contorsione"): n° di giri di superelica (volte che l'asse centrale incontra se stesso, formando superavvolgimenti) La somma di queste due grandezze indica il n° di volte che un filamento si avvolge sull'altro ed è appunto il Lk. Lk non può cambiare se non si taglia almeno 1 dei filamenti della doppia elica Lk resta costante se ci sono variazioni complementari nel Tw e Wr: se si forza il DNA circolare a cambiare il suo Wr, senza tagliare la doppia elica, per compenso cambierà il Tw, ma il Lk sarà lo stesso. Esistono due tipi di superavvolgimenti: Avvolgimento plectonemico: quello che vediamo nel DNA nudo, come nelle immagini in ME; Avvolgimento toroidale: si ha quando il DNA è avvolto intorno all'ottamero istonico Molecole di DNA circolari covalentemente chiuse di uguale lunghezza, che differiscono solo per il Lk, sono definite topoisomeri. I topoisomeri che differiscono anche per un solo Lk possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio. Il superavvolgimento contiene energia libera perché il DNA tende a ritornare al suo stato di quiete: il DNA negativamente superavvolto faciliterà fenomeni biologici dove i filamenti devono essere parzialmente denaturati. Una molecola di DNA duplex chiusa in cui introduciamo superavvolgimenti negativi tende a scaricare questa tensione torsionale (energia libera) arrotolandosi in senso opposto: così contiene un eccesso di energia libera che può permettere al DNA di subire delle transizioni strutturali che non sarebbero possibili nel DNA rilassato: - Separazione (denaturazione) dei filamenti per un breve tratto: ogni giro di superelica può essere "riassorbito" dalla denaturazione di una seq. di ≈ 10 bp. Avviene + facilmente in tratti ricchi di A-T. - Formazione di strutture cruciformi: se nella molecola esiste una seq. palindromica, si possono così sottrarre giri di superavvolgimento dalla molecola nel suo insieme. - Transizione da forma B a forma Z di un tratto di DNA sia propenso alla transizione, cioè in una regione in cui ci sia un'alternanza regolare di pirimidine e purine. DNA TOPOISOMERASI Lo stato topologico del DNA deve essere tenuto sotto controllo: uno o entrambi i filamenti del DNA devono essere tagliati, manipolati e rilegati. Per catalizzare queste reazioni gli organismi contengono una classe di enzimi, chiamati DNA topoisomerasi: creano un taglio transiente sul DNA, mediante una tirosina che si lega covalentemente allo scheletro fosfato, con una reazione di transesterificazione fatta dal suo gruppo OH. Dopo la manipolazione topologica che riduce o aumenta il Lk, attraverso una reazione inversa, il gruppo OH libero del filamento tagliato attacca il legame tra tirosina e DNA, ripristinando la continuità della doppia elica. Il processo utilizza l'energia libera contenuta nel DNA superavvolto. Le DNA topoisomerasi si differenziano per il meccanismo d'azione con cui cambiano la topologia del DNA: 1) Rotazione controllata: enzima induce singola rottura su un filamento e gli permette la rotazione su sé stesso fino a che l'attrito tra DNA e enzima induce la rilegazione (saldatura) del filamento tagliato. 2) Strand passage (passaggio del filamento): consiste nel creare una rottura singola o a doppio filamento sul DNA, allargare l'interruzione prodotta e far passare l'altro filamento o la doppia elica attraverso la rottura che successivamente verrà risaldata. Classificazione enzimi: in base al meccanismo d’azione. Topoisomerasi di tipo I Tagliano 1 singolo filamento di DNA al 5', creando un'apertura mediata da interazioni di ≠ domini dell'enzima con la doppia elica, attraverso cui può passare l'altro filamento o una doppia elica (strand passage): permette di eliminare strutture annodate sul DNA, e di decatenare i 2 filamenti di cui 1 contenga una rottura a singolo filamento e di rilassare superavvolgimenti negativi. Struttura cristallografica della topoisomerasi IB: avvolge la duplex come una tenaglia, e le interazioni tra i vari domini dell'enzima con il DNA contribuiscono all'attrito necessario a controllare la rotazione del filamento intatto su se stesso. Topoisomerasi di tipo II Tagliano entrambi i filamenti del DNA con le 2 tirosine covalentemente legate all'estremità 5', e portano avanti le modificazioni topologiche facendo passare un 2° tratto a doppia elica attraverso la rottura. Il filamento tagliato si chiama segmento G (gate, cancello), il segmento che passa attraverso l'apertura si chiama segmento T (transport.) Meccanismo di azione a doppio cancello: il segmento T entra nella parte superiore dell'enzima, che si apre per accoglierlo; dopo l'apertura della doppia elica del segmento G, il segmento di T attraversa tutto l'enzima, che si apre nellaparte inferiore, rimuovendo in questa maniera due superavvolgimenti alla volta. L'idrolisi dell'ATP è necessaria per promuovere i meccanismi che permettono al DNA di entrare e passare attraverso l'enzima. Tutti quei processi cellulari che consistono nell'apertura della doppia elica e nello scorrimento lungo il DNA di grossi apparati (es replicazione o trascrizione) generano superavvolgimenti sulla doppia elica Il DNA non è libero di ruotare facilmente per varie ragioni (lunghezza, presenza di siti di ancoraggio a strutture cellulari come la memb. nucleare). → Superavvolgimenti positivi nella direzione della sintesi davanti al complesso che avanza, e superavvolgimenti negativi a monte. Queste regioni di DNA possono diventare superavvolte fino al punto che l'apparato non è più in grado di procedere: le DNA topoisomerasi sono quindi essenziali per tenere sotto controllo il grado di superavvolgimento.  Struttura dell'RNA - Chimicamente è simile al DNA, con la differenza che lo zucchero che fa la sua impalcatura è il ribosio, che in posizione 2' ha un gruppo ossidrilico (OH). La presenza di questo gruppo crea ingombro sterico, e impedisce all'RNA di assumere una conformazione stabile a doppia elica - È generalmente una catena a singolo filamento, ma è in grado di formare tratti a doppia elica con una conformazione ≈ al DNA A. - Contiene l'uracile al posto della timina - Ha un ruolo fondamentale nel trasmettere l'informazione genetica (trascrizione e sintesi delle proteine. il La sua struttura può assumere conformazioni diverse che permettono diverse funzioni biologiche. strutture costituite da anse, forcine, gemme 2 ragioni: le basi possono ruotare e ripiegarsi intorno ai legami fosfodiesterici e legami col ribosio; le basi possono fare ≠ tipi di appaiamenti (Watson-Crick A-U, G-C, Hoogsteen) Classificazione appaiamenti delle basi considerando: la loro parte esterna che partecipa all'interazione l'orientamento dei legami glicosidici rispetto ai legami idrogeno (cis o trans). I bordi esterni delle basi sono le 3 possibili superfici di interazione di un singolo nucleotide, che faranno: legami idrogeno di tipo Watson-Crick, Hoogsteen o con gli zuccheri. In genere sono tanto più stabili quanto più lunghi sono i tratti di sequenza complementari appaiati. Data una sequenza nucleotidica relativamente lunga, può essere ripiegata in più possibili strutture secondarie alternative. Quale di queste strutture è favorita rispetto alle altre, e quindi effettivamente assunta dalla molecola? Calcolo dell'energia libera: G permette di prevedere la spontaneità di una reazione chimica a una certa T e p, definisce la quantità di energia richiesta o rilasciata da una reazione. Reazione esoerfonica (rilascia energia): avviene spontaneamente e ha G < 0; Reazione endoergonica (richiede energia): ha G > 0; Reazione all'equilibrio termodinamico: G = 0. La stabilità complessiva di una data struttura è descritta dal suo G totale: una struttura G negativo elevato è termodinamicamente più stabile; una struttura con un G positivo sarà fortemente instabile e le sue probabilità di formarsi sono scarse. Come si calcola la stabilità di questa particolare struttura? Ci si avvale di apposite tabelle che riportano i dati di per i vari tipi di appaiamenti di basi. Alla stabilità della struttura contribuiscono: legami idrogeno tra le basi appaiate e interazioni idrofobiche (impilamento basi) che dipendono dalle particolari coppie di basi nella sequenza. positiva: richiede lavoro per assumere una certa configurazione, negativa: rilascia lavoro immagazzinato nel sistema. L'energia libera totale di una struttura secondaria si calcola sommando tutte le componenti di energia libera positive e negative. Più sarà negativa, più probabile sarà la formazione di quella struttura. Alcune anse possono essere molto stabili grazie alle interazioni idrofobiche di impilamento tra le basi, e che hanno un contenuto energetico molto vantaggioso (es.: tetraloop formato dalla sequenza GC-UGUU-GU). Gli appaiamenti tra le basi possono essere formati anche in posizioni non contigue: Pseudonodi - si formano quando un segmento di RNA che già ha formato un'ansa in una regione si ripiega, e i nucleotidi dell'ansa interagiscono con i nucleotidi di una regione vicina del filamento. Si forma una 2° regione a doppia elica che dopo una torsione si impila sull’altra. Questo tratto a doppia elica può impegnarsi in legami idrogeno con altre regioni della molecola, formando dei tratti a tripla elica. Motivo A-minore - adenosine della catena dell'RNA possono interagire specificamente con il solco minore di strutture di RNA a doppia elica mediante legami di van der Waals. Stabilizza i contatti tra eliche di RNA, interazioni tra anse ed eliche, e la conformazione di giunzioni e ripiegamenti molto stretti. È la struttura più abbondante nelle interazioni che si formano nella subunità grande del ribosoma. La 1° struttura tridimensionale di un RNA a essere risolta con la cristallografia fu quella del tRNA. Struttura a trifoglio: ha ulteriori ripiegamenti dati da appaiamenti tra loro di anse distanti, che formano una struttura a L. Tutti i tRNA maturi sono mediamente lunghi 73-92 nucleotidi e contengono molte basi modificate. Motivi strutturali comuni: anse che contengono le basi modificate, (come l'ansa D che contiene la diidrouridina, l'ansa T-Ф-C che contiene pseudouridina, la sequenza CCA all'estremità 3' della molecola). In tutti i tRNA avviene una rotazione dei nucleotidi della regione dell'anticodone, che sono così esposti all'esterno, mantenendo tra loro contatti dovuti alle interazioni di impilamento. Impilamento coassiale dei bracci che si impegnano in interazioni con regioni non direttamente contigue: Il braccio accettore (dove si lega l’aa, 7 bp) si impila con il braccio T-4-C (5 bp) per formare una regione a doppia elica di tipo A (lunga 12 nucleotidi) che rappresenta uno dei bracci della struttura a L. Le eliche del braccio dell'anticodone e del braccio D interagiscono tra loro in maniera coassiale per formare l'altro braccio della L. L'RNA si ripiega e assume strutture terziarie in base agli accoppiamenti possibili e ai livelli energetici che esse contengono. Non sempre le conformazioni che esistono in vivo e che hanno una funzione biologica sono le più vantaggiose energeticamente: può verificarsi che per un dato RNA la struttura che si forma com più facilità sia un oggetto inutile da un punto di vista funzionale. Per evitare ciò, l'RNA spesso è associato a proteine della famiglia delle hnRNP (ribonucleoproteine nucleari eterogenee), che "guidarno" un RNA verso il suo ripiegamento funzionale. - Alcune proteine stabilizzino strutture che devono essere mantenute nella conformazione funzionale; - Altre, legandosi all'RNA non ancora ripiegato, impediscono l'originarsi di strutture non utili alla formazione della molecola funzionale, e si staccano solo quando le regioni che devono interagire sono pronte a farlo; stabiliscono la sequenza temporale degli stadi di ripiegamento dell'RNA nella formazione delle due subunità del ribosoma, Presenza di ioni che stabilizzano I'RNA, come il Mg. Nel caso del ribozima a testa di martello, questo ione bivalente è necessario per la formazione della sua struttura terziaria stabile. Ci sono anche casi in cui da 1 stessa sequenza di RNA si formano 2 strutture ≠ entrambe funzionali, come nel caso del genoma a RNA del virus dell'epatite delta. Questo genoma si replica con il meccanismo del cerchio rotante, che genera lunghe molecole di RNA in cui il genoma virale è ripetuto molte volte in tandem. Contiene un. tratto di RNA di 85 nt che può assumere 2 strutture alternative funzionalmente ≠. Una conferisce all'RNA un'attività di ribozima per il taglio dei precursori multimerici in genomi virali singoli; L’altra conferisce all'RNA un'attività ligasica per la circolarizzazione dei singoli genomi virali.