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Biochimica#1 -Prof. De Curtis- Introduzione e Ripasso _______________________________________________________________________________________ Biochimica Lezione 1 Introduzione e Ripasso Prof. De Curtis - 06/12/2023 - Autore: Gemma Gerbino - Reviewer: Francesca Garelli - linea gialla 2029 _______________________________________________________________________________________ Per la vita ci sono macromolecole importanti che sono polimeri costituiti da singole unità, chiamate monomeri. Queste sono: -Polisaccaridi: costituiti da carboidrati -Acidi nucleici: costituiti da nucleotidi, i quali sono costituiti a loro volta da una base azotata, uno zucchero e un gruppo fosfato. -Proteine: costituite da amminoacidi -Lipidi: per la formazione delle membrane, metabolismo… Inoltre ci sono tantissime altre piccole o grandi molecole chiamati metaboliti. ACIDI NUCLEICI Si ha un accoppiamento specifico delle basi azotate: L’adenina si lega con la timina; la citosina con la guanina. Inoltre, la sequenza su un filamento determina la sequenza sull’altro filamento: questi due sono antiparalleli, ognuno fatto da una sequenza monotona di fosfato e zucchero dove le basi si affacciano per formare il ponte a idrogeno, formando a loro volta la doppia elica. Ogni filamento di DNA può funzionare da template, ovvero da stampo, per formare: 1. Il secondo filamento di DNA (replicazione) 2. RNA, acido ribonucleico (trascrizione) Nel caso dell’RNA si ha un accoppiamento di basi differente, ovvero la timina viene sostituita dall’uracile (A-U) e si ha una differenza anche nello zucchero, il quale ha un ossigeno in più. DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE Il dogma centrale della biologia molecolare, si basa proprio sul flusso unidirezionali da DNA a RNA a proteine nelle cellule note. Non può avvenire il contrario, ovvero dall’RNA non si può passare al DNA. Questo avviene nelle cellule procariote ed eucariote. C’è un’eccezione che vale per alcuni virus a RNA: questi sono capaci di trascrivere un filamento di DNA partendo da un filamento di RNA grazie a specifici enzimi. Come viene codificata l’informazione? Le proteine sono le macchine biologiche, portano avanti la funzione nella maggior parte dei casi. Il DNA da le informazioni necessarie per la traduzione e la trascrizione ma non è in grado di svolgere operazioni specifiche all’interno della cellula. L’ RNA deve codificare le proteine, ma esistono diversi tipi di RNA (es. RNA messaggero e RNA transfer…) che hanno delle vere e proprie funzioni come le proteine, ma rimangono comunque una classe molto limitata. Nelle nostre cellule, i cromosomi codificano circa 13/15 mila catene polipeptidiche diverse La sequenza di base lineare del DNA contiene tutte le informazioni, in quanto leggendo un filamento, possiamo sia replicarlo sia trascriverlo. Il DNA ha sempre una forma tridimensionale nello spazio ma l’informazione è disposta in modo lineare. Invece, L’RNA messaggero è una copia un pò modificata di un filamento di DNA, può essere considerato un intermedio che serve successivamente per codificare la proteina, ma anche questo filamento rimane lineare. Dopo la traduzione, non abbiamo più la sequenza di basi, ma la sequenza lineare degli amminoacidi, la quale non è sufficiente a far svolgere la funzione alle proteine perché è necessario un evento complesso chiamato ripiegamento che porta alla formazione di proteine funzionanti. Questo ripiegamento è conosciuto con il termine Folding. Il Folding delle proteine deve seguire delle leggi specifiche ma vista la complessità, ancora oggi non è completamente risolto il passaggio dalla sequenza lineare alla struttura tridimensionale. Se si ha un errore durante il ripiegamento, si ha una mutazione, per cui si manifesta una malattia. Quindi possiamo dire che la struttura terziaria delle proteine, si basa sulla sequenza primaria per cui di conseguenza il Folding, permette il passaggio da un ambito unidimensionale all’ambito tridimensionale. Le proteine che si formano in seguito al Folding sono compatte e globulari e si tratta di molecole stabili e non mobili. Inoltre se utilizziamo un amminoacido che codifica per una determinata proteina, otteniamo la sua struttura tridimensionale, ma se utilizziamo un altro amminoacido che codifica per la stessa proteina, otteniamo due strutture tridimensionali differenti. Quindi se due amminoacidi codificano per la stessa proteina, quest’ultima è uguale per entrambi ma la struttura tridimensionale è differente. Nel nostro organismo abbiamo 4 nucleobasi: combinazioni possibili di triplette e 20 amminoacidi. Ogni amminoacido è codificato da una tripletta di nucleotidi (codone). Alcuni amminoacidi sono codificati da più codoni diversi, per questo motivo il DNA è ridondante. Uniformità biochimica e diversità biologica Nella biosfera esiste un enorme variabilità ma anche un’uniformità biochimica. Tutti gli esseri viventi usano DNA come materiale genetico, è colui che conserva l’informazione in tutte le cellule. Mentre l’RNA serve per codificare proteine e le proteine per svolgere determinate reazioni. Il mondo vivente è diviso in: Eucarioti: cellule con un nucleo ben definito Procarioti: cellula senza nucleo definito, contengono un nucleoide, non è superato da una membrana rispetto il citoplasma Virus: non sono cellule Le macromolecole e i processi metabolici fondamentali sono comuni a organismi diversi. LEGAMI CHIMICI Ci sono legami chimici covalenti che sono dati dalla condivisione di una coppia di elettroni che rende il legame molto forte, per cui per romperlo occorre un’energia molto elevata. Per esempio se prendo una coppia di basi appaiate nel DNA, si tratta di legami covalenti. Una molecola organica non biologica, come il benzene, presenta una risonanza che fa si che nel tempo ogni singolo legame sia un intermedio tra un singolo e un doppio legame che va a stabilizzare la molecola. L’anione acetato, per esempio, presenta un doppio legame non statico, quindi presenta una risonanza che lo rende più stabile. Questo perché in un arco di tempo, i singoli legami saranno doppi legami. Le reazioni biochimiche richiedono la rottura e formazione di legami covalenti per creare una nuova molecola, questo per mantenere vitale il nostro organismo. Anche i legami non covalenti sono importanti, perché permettono di far avvenire eventi dinamici. Un processo biologico, che “sulla carta” appare statico, in realtà è dinamico. La dinamicità permette di far avvenire reazioni che senza quest’ultima non potrebbero avvenire. Se i legami tra le basi fossero troppo forti e fossimo in assenza di dinamicità, con i meccanismi della cellula, quest’ultimi non potrebbero essere rotti. INTERAZIONI ELETTROSTATICHE Le interazioni elettrostatiche sono i legami deboli più forti e sono dovute dalla vicinanza di una molecola carica positivamente con una molecola carica negativamente. Se si avvicinano abbastanza si instaura una forza di attrazione che li tiene ad una certa distanza e fa sì che si formi un legame debole con un’energia di pochi kcal/mol. Questo può avvenire tra molecole diverse ma può avvenire anche all’interno della stessa molecola. Questo può contribuire a tenere in una certa conformazione la proteina che si sta avvolgendo durante il folding. Questo tipo di legame è regolato dalla legge di Coulomb, la quale afferma che l’energia di legame dipende dall’intensità delle due cariche ed è inversamente proporzionale alla distanza delle cariche. Legame a idrogeno: Il legame a idrogeno coinvolge due basi azotate che si uniscono a formare la doppia elica. Se i due atomi coinvolti in questo legame hanno angolazione e distanza diversa, questo può portare ad un contenuto energetico differente. La molecola che lega con un legame covalente l’H è un donatore nel ponte a idrogeno, mentre colei che riceve una parte negativa dell’elettrone dell’H, si chiama accettore. Nel folding delle proteine i legami a H sono fondamentali. Interazioni Van der Waals: Le interazioni di Van der Waals hanno un’interazione minore rispetto le precedenti, dovuta dal fatto che ogni elettrone avendo una nube elettronica, quest’ultima non è distribuita in modo simmetrico ma si muove continuamente, provocando la formazione di un lato carico positivamente e un lato carico negativamente. Infatti se di fianco ci fosse stato un altro atomo, questo sarebbe stato influenzato a sua volta. L’energia dell’interazioni che si forma è molto debole ed è molto facile rompere il singolo legame. Però quando parliamo di ambiente cellulare, più precisamente della membrana cellulare, sappiamo che è costituita da un doppio strato lipidico dove l’ambiente interno è idrofobico ma anche tenuto insieme dalle interazioni di Van der Waals. In questo caso non parliamo di singole reazioni ma di centinaia di interazioni tra le molecole. Questo fa sì che dobbiamo moltiplicare questo valore per un numero molto più alto e avere delle forze di interazioni globalmente maggiori ma allo stesso tempo dinamiche. Ovvero è possibile rompere la singola interazione ma è complesso distruggere le interazioni dell’intera membrana. Grazie a queste interazioni, la membrana non appare rigida ma molto fluida. Quindi, in conclusione, se considero l’interazione tra due molecole che possono costituire tante interazioni di Van der Waals, queste interazioni singolarmente è insignificante ma nell’insieme assume un valore. Le interazioni deboli sono fondamentali sia per la costruzione della proteina che per permettere la sua funzione. Queste interazioni temporanee, basate spesso su legami non covalenti, sono fondamentali per permettere che avvengano funzioni dinamiche. All’interno di una proteina, nonostante il folding le dia una struttura relativamente stabile, se fosse completamente rigida non potrebbe funzionare. Tutto questo avviene in ambiente acquoso: noi come organismo siamo fatti da circa 85% di acqua, ma forma le nostre singole cellule per più del 90% ed è per questo che l’ambiente dove avviene il folding è l’acqua. Quest’ultima è importante perchè è un dipolo, non è completamente neutra in quanto l’ossigeno, che è più elettronegativo, tende ad attirare nubi elettroniche dei protoni, creando quindi i delta+ e i delta- coinvolti nei ponti idrogeno per esempio con altre molecole di acqua e questo è fondamentale affinché a temperatura ambiente sia un liquido. Questo reticolo non è statistico: se si abbassa la temperatura, i legami si ordinano e vanno a formare nei cristalli di acqua una struttura stabile e questa diventa un solido. Da altra parte se si fornisce energia al sistema si rompono i ponti idrogeno e acqua diventa gas. Di solito una macromolecola funziona bene se isolata: l’aggregazione, ovvero l’unione forzata di proteine che normalmente dovrebbero essere singolarmente sospese in acqua, causa infatti malattie. L’acqua inoltre è importante perché fa ponti idrogeno anche con le altre molecole che hanno disponibilità di formarli: se uniamo due molecole con un gruppo carbonilico e uno amminico secondario che si affacciano l’uno all’altro a una distanza tale per cui riescono a formare un ponte, l’intervento delle molecole d’acqua può disfare dinamicamente questi per crearne altri due. Questo tipo di passaggio è ciò che fa avvenire nel sito catalitico degli enzimi una reazione. EFFETTO IDROFOBICO C’è un quarto tipo di interazione: effetto idrofobico. Questo non si crea in modo positivo ma avviene per esclusione delle molecole di acqua: se costringi una molecola idrofobica a stare a contatto con l’acqua, la goccia d’acqua è costretta a stare insieme ma se, dopo aver mosso la soluzione, si aspetta abbastanza tempo, si può vedere che le gocce idrofobiche si uniscono tra loro e vanno a galla/ sul fondo e c’è una coalescenza di queste ad unirsi. Dunque sono costrette a stare a contatto con l’acqua, ma se ci sono altre idrofobiche preferiscono stare con queste. Questo è importante non solo per tenere insieme il doppio strato fosfolipidico di una membrana biologica, ma anche per il folding delle proteine, il quale è guidato primariamente da esse, siccome sono necessarie per l’arrotolamento nella conformazione funzionale. pH e pKa Parliamo di forza di acidi e basi in acqua. L’acido tende a ionizzarsi e a liberare protoni se sciolto in acqua, mentre la base tende a cedere gruppi idrossilici. Un acido generico, se ha la possibilità di cedere un protone, si dissocia in protone e base coniugata (molecola di acido deprotonata). Per misurare la concentrazione dei protoni si usa il pH, in quanto il logaritmo negativo della concentrazione dei protoni in una soluzione corrisponde al pH. Se si ha una situazione che è apparentemente statica, si ha un equilibrio: se in ogni momento successivo misuriamo le varie concentrazioni, questi tre valori saranno costanti. Quando misuriamo una concentrazione di una soluzione, stiamo misurando una concentrazione di un acido sciolto in una certa concentrazione. Quindi non stiamo parlando di una singola molecola ma di una popolazione. Quindi possiamo misurare costanti dinamiche perchè sono date da popolazione di molecole diverse. La costante di dissociazione dell’acido (Ka) è il rapporto delle concentrazioni costanti all’equilibrio dei prodotti e le concentrazioni dell’acido indissociato. Un acido forte avrà valore di Ka piú alto di un acido debole perchè forte è quasi tutto completamente dissociato. Maggiore pKa corrisponde a piú piccola Ka siccome interviene anche il logaritmo nel calcolo. Nel nostro organismo si ha pH 7,4 (extracellulare), quindi dobbiamo avere equilibri di acidi deboli sennó si rischia di far crollare pH. Lo stomaco è un’eccezione perché arriva anche a pH=1, in quanto deve denaturare le proteine. L’interno di una cellula invece è circa pH=6,8. Questo è diverso da quello extracellulare a causa delle membrane cellulari, degli equilibri ionici e l’insieme dell’ambiente cellulare. La differenza deve essere dinamica ma costante, in quanto ci sono sempre scambi siccome la membrana non è rigida ma permette entrata e uscita di ioni e di molecole. La differenza inoltre è tenuta insieme da sistema tampone. Perchè c’è bisogno di ciò? Ad esempio, se prendiamo una molecola di DNA, la mettiamo dentro una provetta e abbassiamo il pH di essa, riusciamo a separare le eliche artificialmente, questo perché i protoni in eccesso protonano la molecola di DNA e portano alla rottura dei ponti idrogeno e al distanziamento delle due catene, dunque alla denaturazione del DNA. Questo ovviamente non deve avvenire nella cellula. Stessa cosa vale per le proteine: l’emoglobina è fatta da 4 catene polipeptidiche, tenute insieme in un unica proteina. Le singole catene non funzionano, ci vuole la proteina intera. Queste potrebbero essere mantenute insieme anche da ponti idrogeno. Se aumentiamo o abbassiamo troppo il pH della cellula dove c’è la proteina, vengono rotte le interazioni e si ottiene la denaturazione della proteina. Per questo deve essere mantenuto il pH nelle cellule. Dentro la cellula esiste il tampone fosfato. L’acido fosforico è un acido forte e dunque avrà una pKa bassa, quindi questo acido non va bene per sistema tampone cellulare. Bisogna dunque trovare un acido adeguato. Nell’evoluzione è stato assegnato il diidrogenofosfato: questo ha ancora due protoni che può perdere prima di arrivare completamente deprotonato a fosfato. In particolare il passaggio con perdita di protone, rende questo sistema un acido debole con un pKa a intorno alla neutralità adeguato a funzionare a sistema tampone. La regione tampone di una certa sostanza avviene nel range di pH intorno alla pKa della sostanza. Se si misurano le concentrazioni di fosfati dentro le cellule, è presente in quantità di parecchi millimolar, in quanto fanno sistema tampone adeguato alla cellula. Il pKa sarà 7.21 che è perfetto per pH intracellulare, siccome dentro la cellula il valore fosfato impone un valore vicino alla neutralità importante, ma esistono anche altre molecole che con il loro pKa influiscono con il pH totale della cellula. Esiste altro un sistema tampone extracellulare, ovvero il tampone carbonato. In seguito alla respirazione cellulare, si crea tanta CO2 che diventa acido carbonico e in equilibrio con l’acido carbonico crea un secondo sistema tampone che funziona nell’ambiente extracellulare. Usando le curve di titolazione, si capisce come si comportano gli amminoacidi a pH diversi e si capisce in che zona di pH può agire il tampone. pH-metro: apparecchio usato in laboratorio che serve a regolare il pH. Equazione di Henderson e Hasselbalch: serve a mettere in relazione il pH con il pKa. È importante conoscere questo rapporto perchè ci può dare informazioni sullo stato della molecola a un certo pH. SCOPI DELLA BIOCHIMICA Descrivere struttura, organizzazione e funzione cellule in termini molecolari. ELEMENTI FONDAMENTALI I 4 elementi fondamentali per la vita sono Carbonio, Ossigeno, Idrogeno e Azoto e comprendono il 95%. Ci sono anche altri elementi come Sodio, Potassio, Calcio, Magnesio, Ferro… in piccole concentrazioni. Esistono anche elementi essenziali per la vita che possono essere velenosi in eccesso, come Rame e Cobalto. Però anche la loro assenza completa è altrettanto pericolosa. Ad esempio senza rame non potremmo fare fosforilazione ossidativa. Il Carbonio: compone il 60% delle cellule; è versatile; crea legami stabili C-C; si lega anche agli altri tre elementi fondamentali; può fare strutture cicliche e ramificate; rispetto all’ossigeno e all’ azoto è piú stabile nella formazione dei 4 legami di ed è dunque il miglior elemento fondamentale delle molecole organiche.