Biologia molecolare PDF - Struttura e composizione degli acidi nucleici

molecolare possano essere usate in diagnostica molecolare; i processi alla base dei fenomeni connessi con lo sviluppo embrionale. Siti consigliati: http://www.cell.com/trends/molecular-medicine/home PubMed Libri di testo consigliati: 1. ALBERTS et al. “Biologia molecolare della cellula” Zaniche...

molecolare possano essere usate in diagnostica molecolare; i processi alla base dei fenomeni connessi con lo sviluppo embrionale. Siti consigliati: http://www.cell.com/trends/molecular-medicine/home PubMed Libri di testo consigliati: 1. ALBERTS et al. “Biologia molecolare della cellula” Zanichelli 2. WATSON et al. “Biologia Molecolare del gene” Zanichelli 3. ALLISON “Fondamenti di Biologia molecolare” Zanichelli 4. CRAIG et al: «Biologia Molecolare, Principi di funzionamento del Genoma» Pearson 5. LODISH et al. “Biologia molecolare della cellula” Zanichelli 6. AMALDI et al. «Biologia Molecolare» CEA 7. CAPRANICO et al. «Biologia Molecolare» EdiSES 8. COOPER et al. «La Cellula un approccio molecolare» Piccin Summer School 11-13 settembre I temi trattati saranno: infiammazione, sistema immunitario e invecchiamento. Tramite modelli di patologia come le sindromi progeroidi o lo studio degli ultracentenari è possibile comprendere gli aspetti molecolari legati ai processi di invecchiamento. Adesso conosciamo degli elementi che vanno dalla stabilità genomica alla regolazione epigenetica al funzionamento dei mitocondri, dove il sistema immunitario gioca un ruolo importante nei processi di invecchiamento. Conoscere i meccanismi molecolari ci consente di fare prevenzione e di sviluppare terapie. 2. COMPOSIZIONE E STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI 2.1. STRUTTURA PRIMARIA DEGLI ACIDI NUCLEICI Gli acidi nucleici sono polimeri di alto peso molecolare che, per idrolisi completa, danno le componenti base: - basi azotate (puriniche o pirimidiniche) caratterizzate da un anello eterociclico aromatico, con degli elettroni delocalizzati. Le basi azotate sono legate allo zucchero attraverso un legame N-glicosidico (legame covalente piuttosto forte) tra l’azoto e il carbonio 1’ dello Figura 1 13/332  zucchero. Le basi azotate5 presentano dei gruppi laterali, accettori o donatori di legame a H. Questi gruppi sono quelli coinvolti nella formazione delle coppie di basi6. - zucchero: ribosio nel caso del RNA e desossiribosio nel caso del DNA. Il ribosio rispetto al desossiribosio differisce per la presenza in posizione 2’ un gruppo ossidrilico7. La presenza di questo gruppo ossidrilico è alla base della differenza tra le caratteristiche distintive di DNA e RNA (per esempio rende l’RNA più suscettibile a degradazione e inoltre lo rende in grado di svolgere delle funzioni enzimatiche 8). Quello presente in Figura 1 è un desossiribosio perché il carbonio in posizione 2’ è legato a due atomi di idrogeno. - acido fosforico: è un componente di tipo inorganico. L’acido fosforico si lega al carbonio 5’ dello zucchero attraverso un legame fosfoesterico. La presenza di acido fosforico rende gli acidi nucleici molecole acide, che a pH fisiologico sono cariche negativamente. In una catena polinucleotidica, per ogni gruppo fosforico vi è una carica negativa netta, per cui ad ogni nucleotide9 corrisponde una carica negativa netta. Ciò comporta che, per essere contenute stabilmente all’interno delle cellule, questi gruppi negativi devono essere schermati chimicamente da molecole d’acqua o da ioni monovalenti o bivalenti (sodio, potassio, magnesio). Nel caso del DNA nel nucleo sono schermati anche da proteine basiche (il principio base dell’interazione tra proteine e acidi nucleici si basa sulla carica elettrostatica). 2.1.1. PESI MOLECOLARI Peso molecolare di un nucleotide: 300-350 Da - Zucchero + fosfato Ribosio (212 Da: 132 Da + 80 Da 10) Desossiribosio (196 Da: 116 Da + 80 Da) - Base azotata: Adenina: 135 Da (purinica) Citosina: 111 Da (pirimidinica) Timina: 126 Da (pirimidinica) Guanina: 151 Da (purinica) 5 Le basi azotate prendono il nome IUPAC sulla base della posizione che assumono i gruppi donatori/accettori. La citosina, per esempio, viene chiamata anche 2-ossi-4-ammino-pirimidina. 6 Le coppie di basi standard (G-C, A-T) sono delle coppie che si possono formare grazie ai gruppi donatori e accettori di legami a H, ma non sono le uniche: le coppie che si possono formare sono diverse decine. 7 Gli atomi dello zucchero vengono numerati con l’apice primo per distinguerli dalla numerazione presente nelle basi azotate. 8 L’RNA, a differenza del DNA (che non ha attività né catalitica né autocatalitica), può essere un enzima. I tipi di RNA con attività enzimatica si chiamano ribozimi. Per esempio, la catalisi del legame peptidico viene esercitata da RNA presenti nel ribosoma con funzione enzimatica. Il fatto che gli RNA possano avere attività enzimatica supporta l’ipotesi che la comparsa della vita sulla terra fosse ad origine molecolare con base a RNA. 9 Nucleotide = composizione dello zucchero legato covalentemente alla base azotata, tramite un legame glicosidico, e al gruppo fosforico. Se il nucleotide è privato del gruppo fosforico si parla di nucleoside. Ci sono nucleotidi con funzione regolativa (cAMP) e nucleosidi che vengono usati in chemioterapia (la gemcitabina è un analogo della citidina, il nucleoside della citosina). La nomenclatura di nucleotidi e nucleosidi deriva dalla base di cui sono composti. 10 80 Da sono attribuiti al gruppo fosforico. 14/332  Appartenenti alle rispettive classi purinica e pirimidinica, adenina e citosina sono le basi che pesano di meno, mentre timina e guanina sono le basi che pesano di più (l’adenina è una purina come la guanina, ma la guanina pesa circa 16 Da in più), il che ha un riscontro nel genoma mitocondriale. Il genoma mitocondriale è un genoma a doppio filamento, in cui si riconoscono due filamenti: uno pesante e uno leggero, per la diversa composizione in basi azotate (il filamento pesante ha più basi pesanti rispetto all’altro). Nel genoma nucleare, invece, i due filamenti pressoché si equivalgono in termini di peso molecolare. 2.1.2. PROPRIETÀ CHIMICO-FISICHE DEGLI ACIDI NUCLEICI Esse dipendono dalle caratteristiche chimiche che troviamo nelle componenti di cui si è precedentemente parlato: - Elettroni π: elettroni spaiati, delocalizzati che si trovano negli anelli aromatici delle basi azotate. Dagli elettroni π discendono: La stabilità della doppia elica: gli elettroni π consentono alle basi che si trovano su nucleotidi adiacenti di formare dei legami deboli transitori (legami stacking) che danno stabilità alla doppia elica. La reattività: la presenza degli Figura 2 elettroni π rende gli acidi nucleici chimicamente instabili. Ciò vuol dire che ci possono essere sia agenti chimici reattivi sia agenti fisici (radiazioni ultraviolette) che interagendo con gli elettroni possono indurre delle modificazioni covalenti alle basi azotate, il che è alla base della fissazione di mutazioni. - Gruppi donatori (gruppi amminici) ed accettori (gruppi chetonici e l’azoto all’interno dell’anello pirimidinico e purinico) di legami H. Possono essere chimicamente modificati: possono essere deaminati, oppure modificati attraverso la presenza di protoni (un gruppo chetonico può diventare ossidrilico). In Figura 2 si vedono alcuni esempi di modificazioni. In questo modo le proprietà delle basi azotate possono cambiare: se un gruppo viene deaminato, da donatore, diventa accettore di legame a H; se viene idrossilato, da accettore, diventa donatore di legame a H. - Gruppo OH in 2’: nel caso dell’RNA, lo rende suscettibile a degradazione. - Gruppo fosforico: svolge la funzione di carica elettrostatica. Lezione 1.2 – 07/02/2024 – [Francesca Rizzi– Simone Bosello] 2.1.3.BASI CHETONICHE E BASI AMMINICHE Le basi azotate presentano: - gruppi chetonici basi chetoniche o basi ossoniche (guanina, timina, uracile); - gruppi amminici basi amminiche (adenina, citosina); I gruppi chetonici e i gruppi amminici possono essere chimicamente modificati e ciò può dipendere dalle condizioni ambientali. Le basi azotate operano in un intervallo di pH tra 4 e 10. Al di sotto di un pH di 4 o al di sopra di un pH di 10, i gruppi chetonici vengono protonati, mentre i gruppi amminici vengono deprotonati. Queste Figura 3 modifiche influenzano le caratteristiche della funzione di donatori o accettori di legame idrogeno delle basi azotate. 15/332 Il pH, quindi, modifica le caratteristiche dei gruppi chimici delle basi azotate. Per questo motivo, dato che i gruppi definiscono gli accoppiamenti e questi sono alla base della stabilità della doppia elica, se varia il valore di pH si modifica la stabilità della doppia elica. Le caratteristiche dei gruppi accettori o donatori di legami idrogeno sono alla base di accoppiamenti fra le coppie di basi. Le coppie di basi più stabili scoperte da Watson e Crick nella doppia elica di DNA sono quelle di tipo standard/canonici. Ad esempio, nella coppia di basi C-G, la citosina presenta tre siti, due accettori ed uno donatore di legami idrogeno. La guanina presenta tre siti, con uno come accettore e due come donatori di legame idrogeno. Queste caratteristiche rendono complementare la coppia G-C. Tuttavia, esistono anche altri accoppiamenti tra basi definiti non standard. Gli accoppiamenti canonici identificati da Watson e Crick delineano le coppie di basi più stabili all'interno della struttura a doppia elica del DNA, che sono A-T e G-C Figura 4. Ciò significa che le basi sui filamenti opposti sono chimicamente stereo-selettive: conoscendo la sequenza di un filamento di DNA, è possibile determinare la sequenza Figura 4 del filamento complementare. Questa stereo-selettività è basata sulla complementarità dei gruppi donatori e accettori di legami ad idrogeno ed è fondamentale per il successo del DNA come molecola portatrice dell'ereditarietà genetica. Quando si replica una molecola di DNA, seguire una regola che consente di determinare un nuovo filamento da uno di sequenza nota offre un sistema estremamente efficace per trasmettere la stessa sequenza genetica alla progenie. Watson e Crick, anche senza conoscere inizialmente la stereo-selettività, riuscirono a dedurla osservando gli accoppiamenti delle basi. Notarono che questo meccanismo poteva spiegare come l’ereditarietà dei caratteri potesse essere trasmessa. La stereo selettività comporta: - un’efficacia nel mantenimento stabile dell’informazione genetica; - numerosi meccanismi di riparazione del DNA; Una molecola di DNA è a doppio filamento mentre una di RNA è tipicamente a singolo filamento. Ciò fa sì che il doppio filamento abbia sempre un modo per correggere eventuali errori o modifiche. In genere il danno al DNA non avviene in maniera massiccia, ma coinvolge uno solo dei due filamenti complementari della molecola di DNA, di conseguenza il filamento che non è stato danneggiato può essere utilizzato come matrice per la correzione dell’errore. Questa caratteristica ha reso la molecola di DNA a doppio filamento un grande successo nella filogenesi sulla Terra come portatrice dell’informazione genetica. 2.1.4.IL DNA È ELASTICO Il DNA possiede un’elasticità derivante dalle caratteristiche degli accoppiamenti stereo-selettivi. Grazie all’elasticità il DNA può essere denaturato e rinaturato: - denaturazione: rottura di legami idrogeno tra le diverse coppie di basi azotate per mezzo di agenti fisici, come l’aumento di temperatura, o per agenti chimici attraverso l’utilizzo di basi forti come la soda - rinaturazione: rimozione dell’agente denaturante (fisico o chimico) affinché i due filamenti si riappaiano. 16/332 Anche le molecole di RNA generano accoppiamenti o comunque strutture a doppio filamento. Spesso non sono sempre regolari come quelle del DNA. È difficile incontrare un filamento di RNA che formi strutture simmetriche e organizzate come quelle del DNA, dipende largamente dal gruppo ossidrilico che per motivi strutturali di tipo chimico rende la molecola di RNA meno predisposta a formare una struttura a doppio filamento stabile, come nel caso della molecola di DNA. Strutture particolari formate da RNA sono strutture secondarie, per esempio le “strutture a forcina” Figura 5. Servono per schermare le basi azotate, contenenti anelli eterociclici aromatici (idrofobici), dall’acqua. Ciò rende più stabili e meno reattive le basi azotate sottraendole dall’interazione con l’acqua, il solvente. Figura 5 Le caratteristiche della doppia elica variano quando si tratta di doppi filamenti formati da RNA o formati sia da DNA che RNA. Queste differenze influenzano il funzionamento della struttura rispetto alla classica doppia elica di DNA. L’RNA può assumere diverse strutture complesse, tra cui quelle tridimensionali. Un esempio è la molecola di tRNA con funzione di mediatore fra la sequenza di riconoscimento dell’mRNA (porzione anticodonica) e l'amminoacido. Si possono formare accoppiamenti non canonici (differiscono dai classici accoppiamenti di Watson e Crick) per esempio tra la guanina e uracile. Ciò è dovuto al gruppo ossidrilico che modifica la configurazione dello zucchero impedendone la formazione di strutture regolari molto complesse. Questa caratteristica suggerisce che la molecola di RNA è stata probabilmente la prima molecola evolutivamente significativa dal punto di vista ereditario comparsa sulla Terra. Oltre ad avere attività enzimatica può formare strutture Figura 6 tridimensionali particolari, caratteristica successivamente assunta dalle proteine a loro volta molto importanti data la loro possibilità di formare strutture tridimensionali (terziarie o quaternarie). 2.1.5.IL DNA È FLESSIBILE La molecola di DNA oltre ad essere elastica (denaturazione e rinaturazione per aggiunta o rimozione di un agente denaturante) è anche flessibile. Grazie alla flessibilità i gruppi di cui gli acidi nucleici sono composti possono ruotare attorno ai legami covalenti che li tengono legati (anche per l’RNA). Il gruppo fosfato forma un legame fosfodiesterico composto da due legami fosfomonoesterici con i carboni di due zuccheri, uno sul carbonio 5’ di un nucleotide e uno sul carbonio 3’ del nucleotide adiacente Figura 7. Attorno ai legami, vi è la possibilità di rotazione, seppur limitata, delle due molecole di zucchero attorno al gruppo fosforico. Le basi azotate, a loro volta, possono ruotare di 360° attorno al legame N-glicosidico. Le rotazioni rendono gli acidi nucleici flessibili, capaci di muoversi ed assumere strutture terziarie di diversa grandezza ed importanza come: Figura 7 - super strutture come il DNA; 17/332  - avvolgersi attorno agli istoni; Senza la capacità di flessibilità il DNA sarebbe rigido e costituirebbe un rischio in un ambiente dinamico come quello di una cellula. 2.1.6.LA REATTIVITA’ DELLE BASI AZOTATE La reattività delle basi azotate è dovuta dall’eventuale modifica dei gruppi accettori o donatori di legame idrogeno, cosa che rende il DNA instabile e suscettibile a modificazioni chimiche. Le modificazioni chimiche delle basi come l’alchilazione, l’ossidazione la deaminazione non sono mutazioni Figura 8. Sono mutazioni solo quando, a seguito di un processo di replicazione o di riparazione non corretta, viene sostituita una base diversa dall’originale a quella precedente, cambiando la sequenza di coppie di basi originali in un Figura 8 determinato segmento di DNA. Non si tratta di una mutazione finché una base non viene permanentemente convertita in un’altra base. Fino a qualche anno fa si pensava che le instabilità chimiche fossero eccezionali ma in realtà sono molto frequenti. Possono subire modificazioni tutti i legami chimici della molecola e delle catene polinucleotidiche come, ad esempio, l’idrolizzazione del legame glicosidico o dei legami covalenti che mantengono unito lo zucchero Figura 9. Figura 9 Thomas Lindal nel 2015 ricevette il Nobel per la Chimica per la scoperta dell’instabilità degli acidi nucleici del DNA e per la prima via di riparazione delle cellule umane per escissione di base. Le cellule umane sono particolarmente soggette a modificazioni chimiche, in particolar modo all’acqua che nelle nostre cellule ha una concentrazione di 55M. Altre sostanze che portano a modificazioni chimiche sono: - Le specie reattive dell’ossigeno prodotte dalla respirazione mitocondriale: vanno ad ossidare le basi azotate. Queste sostanze sono prodotte per il semplice fatto che le cellule vivono. La cellula utilizza i mitocondri per produrre energia sotto forma di ATP il che porta alla produzione di sostanze altamente reattive come l’acqua ossigenata, l’anione superossido ed il radicale ossidrilico; - Cofattori enzimatici come l’S-adenosilmetionina; - Sostanze provenienti dall’ambiente come la formaldeide che deriva da prodotti alimentari contaminati oppure da azioni di detossificazione da parte degli epatociti dell’etanolo; 18/332  Dalla Figura 10 si nota che Thomas Lindal misurò la capacità di modificare le basi del DNA semplicemente tenendo una soluzione di DNA in acqua per 24h ad una temperatura di 37°C, vide fenomeni di idrolisi e rotture del legame N- glicosidico. Questo esperimento è stato eseguito e misurato su un genoma umano (3 miliardi di paia di basi). Alcuni dati: 9020 casi di depurinazione, 1020 di ossidazione della guanina, numeri molto alti. Da qui dedusse che queste modifiche erano poco compatibili con la vita e che potevano sfociare in mutazioni genetiche. Figura 10 Oggi noi sappiamo quant’è il livello di mutazione che le cellule umane fissano nel genoma ad ogni ciclo replicativo ed è circa 3/4 mutazioni su tutto il genoma per ogni replicazione, quindi molto di meno rispetto ai dati di Thomas Lindal, questo perché esistono delle vie di riparazioni molto efficaci che riparano tutte le varie lesioni. Esse sono specifiche per ogni tipo di lesione, reintegrano la funzione normale di quel segmento di DNA, ristabiliscono l’informazione genetica corretta per contrastare potenziali lesione mutageniche. Nell’uomo sono presenti sette vie di riparazione per specificità di lesione. Thomas Lindal studiò quella per escissione di base, che ripara: Figura 11 - L’ossidazioni nel DNA; - La rottura del singolo filamento causato da specie reattive dell’ossigeno, agenti alchilanti, radiazioni ionizzanti come raggi x; - L’uracile, base presente nell’RNA (ma può essere presente anche nel DNA per fenomeni di deaminazione). Il fondamento della ricostruzione dell'informazione genetica su un filamento danneggiato è il doppio filamento. Gli enzimi leggono l'informazione dal filamento intatto e la ripristinano sul filamento danneggiato, eliminando la lesione. Questo principio è essenziale per garantire la fedeltà e la stabilità genomica. In alcuni geni, come quelli degli anticorpi, i meccanismi di riparazione vengono usati al contrario, quindi per introdurre mutazioni. Nel 2015 Thomas Lindal, Aziz Sancar e Paul Modrich vinsero il premio Nobel per aver scoperto dell’instabilità del DNA e del fatto che esistevano vie di riparazione. Lezione 1.2-16/02/2024 [Gabriele Capizzi-Michele Giacomini] 2.2.BASI PIRIMINIDICHE Le basi pirimidiniche derivano dal composto eterociclico aromatico pirimidina. Le principali basi sono: Citosina (C): che è presente sia nel DNA che nell’RNA Uracile (U): che è presente esclusivamente nell’RNA (può trovarsi anche nel DNA a seguito di deaminazione spontanea o di tipo enzimatico della 5 metil- citosina. L’Uracile nel DNA è considerato come una base mutagenica) Timina (T): che è presente solo nel DNA 19/332 La numerazione dei carboni presenti all’interno dell’anello eterociclico aromatico parte dall’azoto coinvolto nel legame N-glicosidico, che è l’azoto 1, e segue in senso crescente verso il secondo atomo di azoto, che è l’azoto 3 e poi, generalmente, la numerazione procede in senso orario. Figura 12: Sezione immagine 2.1 che mostra la numerazione di una pirimidina 2.2.1. TAUTOMERIA NELLE BASI PIRIMIDINICHE Tutte le basi pirimidiniche dispongono di tautomeria: Tautomeria cheto-enolica: In particolare nella Figura 13 è possibile vedere la tautomeria cheto-enolica per quanto riguarda l’uracile: la tautomeria cheto-enolica è un equilibrio che coinvolge il gruppo chetonico, in questo caso dell’uracile, che può essere in parte protonato sotto forma enolica dando origine al gruppo ossidrilico Figura 13 Tautomeria amino-immino: In particolare nella Figura 14 si fa riferimento alla tautomeria amino-immino della citosina: il gruppo aminico può diventare gruppo imminico. 20/332  Figura 14 L’equilibrio chimico è fortemente spostato verso sinistra: dunque verso la forma chetonica (nella tautomeria cheto- enolica) e verso la forma aminica (nella tautomeria amino-imminica). Questo spostamento è di circa 10.000 a 1: cioè nel caso della tautomeria cheto-enolica, ogni 10.000 forme chetoniche ve ne è 1 enolica. Alla base di questi equilibri chimici si possono avere delle mutazioni: cambiando l’equilibrio cheto-enolico o amino- imminico, infatti, cambia di conseguenza lo schema di donatori-accettori di legami idrogeno per quella specifica base. Questa mutazione può, dunque, impattare sugli accoppiamenti che quella base può instaurare se essa viene replicata. 2.2.2. MODIFICAZIONI CHIMICHE DELLE BASI PIRIMIDINICHE La citosina può essere metilata in 5 metilcitosina o può essere idrossi-metilata in 5 idrossi-metilcitosina. Queste molecole rappresentano delle basi modificate presenti in numerosi genomi (descritti per la prima volta nei genomi di organismi semplici come i batteriofagi) osservate in varie regioni regolative dei geni umani: molti promotori e sequenze enhancer (sequenze regolative con funzione positiva nell’espressione dei geni umani) sono dotate di queste basi enzimaticamente modificate che rappresentano dei segnali e fanno parte di quelli che sono i principali marcatori epigenetici dell’espressione genica. La 5 metilcitosina può essere convertita in Timina (come si può vedere nella Figura 15) per deaminazione (perdita gruppo aminico). Questa reazione ha un importante significato funzionale dal momento che la 5 metilcitosina è presente nel genoma umano sia a livello nucleare, sia a livello mitocondriale. Figura 15 21/332 La 5 metil citosina e la 5 idrossi-metil citosina, come detto precedentemente, sono dei marcatori epigenetici e sono fra i principali meccanismi di regolazione dell’espressione genica (contribuiscono a controllare lo stato di condensazione della cromatina) con funzione ereditaria (ereditarietà di tipo epigenetico). Questi meccanismi sono controllati finemente da una classe di enzimi, denominati metilasi. Nell’uomo vi sono 2 classi di metilasi: 1) Metilasi di mantenimento: mantengono la metilazione della citosina durante le replicazioni cellulari e dunque mantengono quel marcatore in maniera ereditaria 2) Metilasi de novo: introducono una nuova metilazione. Una citosina metilata a livello delle regioni regolative dei geni contribuisce alla compattazione della struttura della cromatina (eterocromatina): in una struttura cromatinica condensata il DNA è difficilmente accessibile dagli enzimi che trascrivono quella regione di DNA. Per cui si parla in questi casi di silenziamento dell’espressione genica. La metilazione enzimatica della citosina, a livello delle regioni regolative ed in particolare in corrispondenza di determinate sequenze nucleotidiche (ricche di Guanina e Citosina, per questo dette isole CpG), comporta la compattazione della struttura cromatinica e, conseguentemente, il silenziamento genico. La metilazione enzimatica delle citosine contribuisce, inoltre, a definire e mantenere l’identità tissutale dell’organismo: prende parte, nello specifico, nei processi di differenziamento che portano una cellula totipotente a diventare una cellula differenziata. La metilazione delle citosine insieme ad altri meccanismi di tipo epigenetico, agiscono sia nella determinazione fenotipica di una cellula (condizionandone l’espressione dei geni che sono necessari per il mantenimento del fenotipo della cellula stessa), sia nel mantenimento di quel fenotipo durante le varie replicazioni cellulari, perpetrando il set di geni che devono essere espressi per consentire l’omeostasi tissutale alle cellule figlie. La metilazione della citosina, dunque, è uno dei principali meccanismi di regolazione epigenetica assieme alle modificazioni istoniche ed al ruolo degli RNA non codificanti. 2.3. BASI PURINICHE Le basi puriniche derivano da fenomeni di condensazione di un anello pirimidinico ed un anello purinico o imidazolico. La numerazione degli atomi che costituiscono gli anelli eterociclici delle basi puriniche è diversa: in particolare è diverso l’atomo di azoto coinvolto nel legame N-glicosidico che non è più l’azoto 1 ma è l’azoto 9. (aggiunta dello sbobinatore, informazioni derivate dalla sbobina dell’anno scorso: la numerazione parte dall’azoto 1 presente nell’anello pirimidinico e procede in senso antiorario: viene completata prima la numerazione degli atomi dell’anello pirimidinico e poi di quelli dell’anello imidazolico come si vede nella Figura 16) Figura 16 Le principali basi puriniche sono: Guanina (G): presente sia nel DNA che nell’RNA Adenina (A): presente sia nel DNA che nell’RNA 22/332 Vi sono delle ulteriori basi puriniche naturali come l’ipoxantina, la xantina e l’acido urico che derivano da fenomeni di deaminazione o di degradazione delle basi puriniche che possono trovarsi in alcuni tipi di acidi nucleici (ad esempio la ipoxantina è possibile trovarla in alcune molecole di RNA). Figura 17: basi puriniche 2.3.1. TAUTOMERIA DELLE BASI PURINICHE Le basi puriniche, come le basi pirimidiniche, presentano sia tautomeria cheto-enolica, sia tautomeria amino-imminica. La Figura 18 mostra la tautomeria cheto-enolica della guanina. Questo equilibrio è fortemente spostato verso sinistra (forma chetonica) anche se può anche essere presente la forma enolica. Anche in questo caso l’effetto di questa tautomeria è il cambiamento dello schema degli accettori-donatori del legame idrogeno. Come si può vedere nella Figura 18: tautomeria della guanina la forma chetonica presenta 2 donatori di legame idrogeno (freccia rivolta verso l’esterno) ed 1 accettore di legami idrogeno, mentre nella forma enolica vi è la modifica dello schema accettori-donatori dei legami idrogeno: in particolare l’azoto 1 perdendo il protone, da donatore diventa accettore di legami idrogeno. Le tautomerie ed in particolare le forme enoliche, ma anche quelle imminiche in quanto prevedono il cambio dello schema accettori-donatori, rappresentano la causa più frequente di mutazione spontanea a cui è soggetto il genoma degli organismi. Figura 18: tautomeria della guanina La Figura 19 mostra la tautomeria amino-imminica della citosina. La forma aminica della citosina presenta 2 accettori di legami idrogeno (freccia verde) ed 1 donatore di legami idrogeno (freccia rossa). Lo schema accettore-donatore cambia nella forma imminica dove l’azoto 3 acquisendo un protone diventa un donatore di legami idrogeno, mentre l’azoto 4 perdendo il protone diventa accettore di legame idrogeno. La forma imminica della citosina, indicata con la lettera C*, non si accoppia più con la guanina (G) ma con l’adenina (A). Di conseguenza, se viene replicata la C* accoppiata alla adenina, nel filamento complementare verrà inserita una base mutata. 23/332 Figura 19 Lo stesso discorso si può fare per la tautomeria cheto-enolica della guanina (Figura 20). La forma enolica della guanina, indicata con la lettera G*, non si accoppia più con la citosina (C) ma con la timina (T). La replicazione della guanina sotto forma enolica fissa una mutazione sul filamento complementare. Figura 20 Esempio per la tautomeria amino-imminica della adenina: la Figura 20 mostra sia la coppia naturale T-A (o coppia di Watson e Crick) sia la coppia che l’adenina imminica A* forma con la citosina. L’adenina imminica è mutagenica: infatti, se viene replicata, in corrispondenza del filamento complementare che usa l’adenina come stampo, non viene più inserita una timina ma una citosina. Questo provoca una mutazione, una modificazione di una base azotata con un’altra base (Non è una modificazione chimica della base!). Nel filamento neosintetizzato la timina diventa citosina. Quando questo filamento neosintetizzato diventa un filamento stampo, viene fissata una mutazione. Dopo due cicli di replicazione (Figura 21) vi è una conversione di una coppia T-A in una coppia C-G. Questo tipo di mutazione è denominata transizione: la natura della coppia varia, ma non viene, invece, modificato l’ordine del tipo di base (la base pirimidinica rimane comunque una base pirimidinica e la base purinica rimane base purinica). Se cambia l’ordine del Figura 21 tipo di base (ad esempio se al posto di una base pirimidinica viene sostituita una base purinica) si parla invece di un’altra mutazione, detta transversione. Dal punto di vista biologico è più impattante una transversione rispetto ad una transizione per la ridondanza del codice genetico. 24/332  2.3.2. INFLUENZA DEL PH SULLO SCHEMA DONATORI- ACCETTORI LEGAMI IDROGENO Non sono solo le tautomerie cheto-enoliche o amino-imminiche a variare lo schema dei donatori-accettori del legame idrogeno, ma anche il pH. L’equilibrio di ionizzazione descrive l’equilibrio chimico dipendente dal pH di ciascuna base azotata. Nella Figura 22 si può osservare l’influenza del pH sugli equilibri di ionizzazione delle varie basi azotate. In particolare, per quanto riguarda la guanina a pH inferiore a 2,1 la guanina presenta l’azoto in Figura 22 posizione 7 protonato che diventa così un donatore di legame a idrogeno, invece la guanina a pH fisiologico ha l’azoto 7 che è un accettore di legami idrogeno. Di conseguenza cambia lo schema donatore-accettore (vi è la possibilità di avere dunque un appaiamento delle basi diverso). A pH maggiori di 9,2 l’azoto 7 è deprotonato ed è quindi accettore di legami idrogeno. Gli equilibri di ionizzazione delle basi azotate che condizionano pesantemente gli schemi donatore-accettore di legami idrogeno fanno sì che gli schemi di accoppiamento fra basi azotate possono essere variati ad estremi di pH. Un DNA a doppio filamento il quale è tenuto stabile dalla correttezza degli accoppiamenti, a pH molto bassi o molto alti (dal momento che si vengono a cambiare gli schemi di accoppiamento), viene destabilizzato: i filamenti tendono a separarsi. Per questo motivo la doppia elica del DNA è stabile a pH fisiologico. Figura 23 2.4. BASI INSOLITE Oltre alla 5 metil-citosina ed alla 5 idrossi-metilcitosina vi sono numerose altre basi chimicamente ed enzimaticamente modificate. Esse sono presenti nel DNA ma in particolare nell’RNA, che è l’acido nucleico che presenta più basi di tipo insolito che possono essere semplici come l’adenina metilata in varie posizioni o più complesse come la wybutosina. La wybutosina (Figura 24) è caratterizzata da una catena alifatica ramificata collegata ad un insieme di anelli eterociclici aromatici in cui vi sono due imidazoli ed un anello pirimidinico. La wybutosina si può trovare in particolare regioni del tRNA, recanti Fenilalanina. Queste basi, dette basi ingombranti, hanno un significato funzionale: la wybutosina serve come elemento distintivo all’enzima che accoppia quel tRNA con l’amminoacido per riconoscere la correttezza della 25/332  coppia tRNA-amminoacido. L’amminoacil tRNA sintetasi per la Fenilalanina riconosce il tRNA che deve portare la fenilalanina stessa anche utilizzando la wybutosina. Da ricordare oltre la wybutosina sono: la inosina, che deriva dalla deaminazione della adenina, la diidrouridina e la pseudouridina, in cui la formazione del legame con lo zucchero non coinvolge l’azoto 1, ma il carbonio 5. Queste tre basi rappresentano delle importanti base insolite, presenti in varie molecole di RNA, come i tRNA ma anche gli rRNA. Figura 24 wybutosina La pseudouridina, nella struttura tridimensionale del tRNA, si trova a livello delle anse. L’ansa del tRNA contenente pseudouridina ed altre basi insolite, rispetto ad altre regioni, prevede degli schemi di accoppiamento diversi in quanto le basi insolite presentano una distribuzione dei donatori-accettori di legami idrogeno diverso dalle basi canoniche da cui derivano. Per questo le basi insolite servono o come elementi strutturali di riconoscimento, come la wybutosina, o per contribuire, attraverso gli schemi di accoppiamento diversi, a formare delle strutture tridimensionali particolari, le anse che a livello delle molecole di tRNA consentono l’ampliamento dello schema di accoppiamento (similmente a quello che nelle proteine è fatto dalle catene laterali). Le basi insolite permettono di instaurare legami chimici intramolecolari all’interno dell’acido nucleico. Figura 25 Figura 26 tRNA con anse 2.5. ZUCCHERI In entrambi gli acidi nucleici lo zucchero è un pentoso, cioè a 5 atomi di C, nella forma D-ribofuranosica (aggiunta sbobinatore: con forma furanosica si intende l’anello a 5 atomi di carbonio che ricorda il furanosio): Nell’RNA è presente il ribosio Nel DNA è presente il desossiribosio La numerazione dello zucchero parte dal carbonio 1 coinvolto nella formazione del legame N-glicosidico con la base azotata. 26/332 La differenza fra ribosio e desossiribosio consta nel fatto che a livello del carbonio 2, nel caso del ribosio, vi è un protone (H) ed un gruppo ossidrilico (OH), mentre nel caso del desossiribosio, vi sono due protoni. La presenza/assenza del gruppo OH determina la maggior parte delle differenze chimico-fisiche dell’RNA rispetto al DNA che condizionano le proprietà biologiche. Grazie alla presenza di questo gruppo OH, l’RNA può avere funzione enzimatica (Riboenzimi), è più facilmente degradabile ed instabile chimicamente e può fare delle strutture secondarie alternative diverse da quelle a livello del DNA. L’RNA a doppio filamento, infatti, a causa del gruppo ossidrilico assume una particolare struttura destrorsa (struttura A) diversa da quella del DNA, che invece assume una struttura B, che è la struttura di Watson e Crick. STRUTTURA C2’ ENDO E C3’ ENDO L’effetto che il gruppo ossidrilico ha sulla struttura secondaria è dovuto alla configurazione tridimensionale che lo zucchero assume quando è presente il gruppo ossidrilico oppure quando è assente. La configurazione dello zucchero determina nel DNA la struttura B e nel RNA la struttura A. Sia ribosio che desossiribosio presentano una struttura a barca ma: Il desossiribosio ha una struttura C2’ endo: rispetto al piano immaginario che interseca la molecola di zucchero e che esce dal piano, il carbonio 2’ e la base azotata legata attraverso il legame N-glicosidico sono rivolte nella stessa direzione. Questa configurazione C2’ endo è la struttura dello zucchero all’interno della doppia elica del DNA. Il ribosio ha una struttura C3’ endo: Il gruppo ossidrilico a livello del carbonio 2’ del ribosio, essendo Figura 27 differenza fra ribosio e desossiribosio piuttosto ingombrante ed idrofilico rispetto all’anello eterociclico della base azotata, determina una struttura dello zucchero che è inversa a quella del desossiribosio. Il carbonio 2’, infatti, non punta più verso la base azotata, ma nella direzione opposta. Siccome i legami covalenti fra i diversi carboni sono piuttosto rigidi, ma rispetto a ciascun atomo vi è un certo grado di rotazione, il C2’ punta nella direzione opposta rispetto al piano immaginario, ma per risposta il C3’ punta verso l’alto. Questa configurazione dello zucchero determina delle caratteristiche strutturali nella molecola di RNA a doppio filamento (struttura A) diverse rispetto a quello che determina lo zucchero C2’ endo nella molecola di DNA a doppio filamento (struttura B). Figura 28 Il gruppo ossidrilico nell’RNA è estremamente reattivo. L’OH può deprotonarsi formando un ossianione che può causare un attacco nucleofilo di un gruppo fosforico adiacente. Per questo motivo il gruppo ossidrilico può causare la degradazione della molecola di RNA (la molecola di RNA viene chimicamente decomposta nei singoli costituenti). Per evitare un’eccesiva reattività del gruppo OH, in particolare per quei genomi a RNA, vi sono dei processi di metilazione del gruppo ossidrilico: per questo motivo è possibile trovare il ribosio sotto forma di metil-ribosio. 27/332 2.5.1. CONFIGURAZIONE DEL LEGAME GLICOSIDICO Il legame glicosidico può assumere diverse configurazioni, ciò è dovuto al fatto che la base azotata può ruotare di 360 gradi. Questa rotazione è poco consentita in una doppia elica, in quanto vi è l’accoppiamento fra basi complementari che vincola e limita la rotazione stessa. L’angolo di rotazione è chiamato χ (chi). Vi sono due configurazioni della base azotata nel legame glicosidico. Per identificare queste configurazioni si prendono in considerazioni alcuni atomi della base in particolare il C8 nelle purine e il C6 nelle pirimidine: Configurazione anti della base avviene quando il carbonio 8 delle purine o il carbonio 6 delle pirimidine si trova sopra il piano dello zucchero. Questa configurazione della base si trova nella forma B del DNA destrorso, in condizioni di accoppiamento Watson e Crick. Configurazione sin della base avviene quando la molecola di DNA viene disidratata pesantemente (H2O importante per mantenere la struttura secondaria del DNA) e quando si presenta sotto forma di DNA sinistrorso (DNA nella forma Z). La posizione delle basi è ruotata di 180 gradi rispetto alla configurazione anti, la posizione dello zucchero è anche essa modificata (è C3’ endo). Il carbonio 8 nelle purine e il carbonio 6 nelle pirimidine si trovano sotto il piano dello zucchero. Ha un importante ruolo dal punto di vista biologico. Figura 29 Lezione 2.2 – 16/02/2024 – [Lara Picco – Benedetta Bon] 2.6. NUCLEOSIDI Derivano dalla condensazione fra la base azotata e la molecola di zucchero attraverso la formazione del legame N-glicosidico. Il nucleoside, a seconda che lo zucchero sia desossiribosio può essere ribonucleoside o desossiribonucleoside. La nomenclatura dei nucleosidi deriva dalle basi azotate: Dall’adenina deriva l’adenosina Dalla guanina deriva la guanosina Dalla citosina deriva la citidina Dalla timina deriva la timidina Figura 30 28/332  Dall’uracile deriva l’uridina Dall’ ipoxantina deriva l’inosina La pseudouridina, che deriva da uno pseudouracile, è il nome di fatto del nucleoside. Il nome dei nucleosidi più comuni, ma anche di quelli anomali, deriva dalla modifica della base di cui sono composti; con ovviamente le indicazioni nel caso in cui si verifichino fenomeni di metilazione dello zucchero come nel caso dell’RNA. Per esempio, nella metilazione dell’uridina, lo zucchero viene indicato come 2’ o metiluridina dove il gruppo metilico va a sostituire il protone del gruppo ossidrilico. 2.6.1. UTILIZZO DEI NUCLEOSIDI IN CHEMIOTERAPIA I nucleosidi non sono solamente intermedi della biosintesi dei nucleotidi e quindi componenti importanti degli acidi nucleici, ma vengono utilizzati anche in terapia oncologica. Vi sono molti farmaci chemioterapici derivati dalla citidina come ad esempio la gemcitabina, l’azacitidina, la citarabina. Questi sono tutti nucleosidi derivati dalla citidina che vengono utilizzati in chemioterapia, in particolare per tumori ematologici come la leucemia o il linfoma di Hodgkin. Sostanzialmente la loro funzione è quella di causare un arresto della replicazione. Questi Figura 31 farmaci si sostituiscono ai nucleosidi naturali e causano o un’alterazione nei processi di biosintesi dei nucleotidi o fenomeni di arresto della replicazione impattando sull’attività replicativa delle cellule tumorali che sono altamente proliferanti. Una conseguenza è l’arresto della replicazione delle cellule che incorporano questi nucleosidi anomali. Naturalmente sono efficaci per le cellule tumorali, ma hanno degli effetti collaterali in quanto non sono specifici per queste, ma vanno ad agire su tutte le cellule proliferanti. Le terapie che usano questi farmaci hanno infatti una serie di effetti collaterali che impattano sempre sul sistema ematopoietico e causano effetti come l’anemia. Agiscono anche sui linfociti che sono il target di questo tipo di farmaci. N.B. I linfociti sono tra i tipi cellulari che proliferano più rapidamente nel nostro organismo; hanno un ciclo di replicazione di circa 8 ore, quindi molto elevato. 2.7. NUCLEOTIDI I nucleotidi sono gli esteri fosforici dei nucleosidi. Questo vuol dire che a un nucleotide può essere legato un gruppo fosforico che può essere legato a livello di diversi atomi di carbonio dello zucchero che presentano una molecola di ossigeno, come un gruppo ossidrilico. L’estere fosforico può essere legato al carbonio 5’ e quindi si chiama 5’-nucleotidemonofosfato; può essere legato al carbonio 3’ oppure può essere legato al 2’ ma solo nel caso del ribosio, perché nel desossiribosio non abbiamo un gruppo ossidrilico. Il gruppo fosfato, nel desossiribosio, può essere legato o attraverso l’ossigeno collegato al carbonio 5’ o al carbonio in posizione Figura 32 3’. Nella descrizione dei ribonucleotidi, oltre a definire se si Nella nomenclatura si utilizza la sigla Np o pN per far capire se il gruppo fosforico (p) sta a monte o a valle rispetto alla base (N). tratta di ribonucleotidi o desossiribonucleotidi si può indicare Stessa cosa per le catene polinucleotidiche: pNpNpNpNpN vuol dire anche la posizione che il gruppo fosforico assume con che il gruppo fosforico si trova in posizione 5’ mentre NpNpNp vuol ciascuno degli ossigeni legati ai carboni dello zucchero. dire che il gruppo fosforico si trova in posizione 3’. 29/332 2.7.1. CARATTERISTICHE DEL GRUPPO FOSFORICO Il gruppo fosforico a pH fisiologico dona una carica negativa netta agli acidi nucleici, ogni nucleotide in una catena polinucleotidica porta a pH fisiologico una unità di carica negativa netta. All’estremità il gruppo fosforico presenterà due cariche negative. Quindi a pH fisiologico le catene polinucleotidiche Figura 33 sono cariche negativamente, il che fa sì che nei processi regolativi e strutturali, per mantenere i genomi compattati, le proteine che legano acidi nucleici siano proteine basiche cioè che a pH fisiologico siano cariche positivamente; l’interazione fra proteine ad acidi nucleici è di tipo elettrostatico. Gli istoni sono tra le proteine più basiche che conosciamo. Più nucleotidi sono legati insieme attraverso legami fosfodiesterei, ma ogni nucleotide è legato tramite un legame fosfomonoestereo con il gruppo fosforico. I nucleotidi sono ribonucleotidi nel caso dell’RNA e desossiribonucleotidi nel caso del DNA, però possiamo avere anche dei ribonucleotidi dentro i desossiribonucleotidi ed è anche importante ricordare che sia i ribonucleotidi che i desossiribonucleotidi possono presentare non solo un gruppo fosforico, ma più gruppi fosforici. Quando abbiamo nucleotidi con più gruppi fosforici legati tra loro si nomina anche la posizione del gruppo fosforico. I gruppi fosforici vengono nominati con alfa (posizione più prossimale al carbonio 5’ dello zucchero), beta (posizione intermedia) e gamma (posizione esterna). Figura 34 2.7.2. IL RAPPORTO FRA LA CONCENTRAZIONE DI DEOSSIRIBONUCLEOTIDI E RIBONUCLEOTIDI ALL’INTERNO DELLE CELLULE Nella tabella (Figura 35) viene rappresentata una quantificazione in termini di concentrazione dei desossiribonucleoitidi rispetto ai ribonucleotidi nel Saccharomyces (organismo eucariote unicellulare facile da usare nella sperimentazione). Figura 35 30/332 Le concentrazioni trovate sono molto simili a quelle che sono state trovate nell’uomo: la concentrazione del desossiribunucleotide è intorno ai 10-20 micromolare, quella dei ribonucleotidi varia fra i 500 e i 3000 micromolare, il che vuol dire che i ribonucleotidi sono più concentrati di un centinaio di volte all’interno delle cellule rispetto ai desossiribonucleotidi. Questo si spiega perché, mentre il genoma è al massimo in forma diploide, l’RNA è molto più abbondante in termini quantitativi perché abbiamo molte copie e molti tipi di RNA e di conseguenza abbiamo la necessità di avere molti più ribonucleotidi. Questo è potenzialmente un problema perché, cosa che sta riemergendo negli ultimi anni, l’enzima che è necessario per la replicazione del DNA si trova a dover discriminare fra i deossiribonucleotidi (meno concentrati) e i ribonucleotidi (molto più concentrati), per cui potrebbe commettere degli errori, e di fatto questo avviene. Oggi sappiamo che la presenza di ribonucleotidi nel DNA rappresenta la quota di errori più frequenti presenti nel genoma; quindi, è stato stimato che il genoma è composto da circa un ribonucleotide ogni mille desossiribonucleotidi. Questo può impattare sulla struttura secondaria del DNA in corrispondenza di dove è inserito il ribonucleotide. Inoltre, il fatto che il gruppo ossidrilico sia un gruppo molto reattivo in corrispondenza di ogni ribonucleotide il genoma è fragile e si possono rompere i legami fosfodiesterei, per cui si ritiene che la presenza di ribonucleotidi costituisca una sorgente di instabilità genomica molto frequente. Oggigiorno si ritiene che questi fenomeni siano legati all’insorgenza di alcune patologie. Un’ esempio è la sindrome di Aicardi-Goutières, una malattia rara e debilitante, che porta alla morte in tempi molto brevi e che è associata a un difetto genetico legato agli enzimi in grado di riparare i ribonucleotidi presenti nel DNA. La malattia causa Figura 36 fenomeni di infiammazione cronica a livello cerebrale ed epatico, questo avviene perché si è visto che la presenza di ribonucleotidi nel DNA rende il genoma instabile e ciò causa la frammentazione del genoma a livello nucleare. Questi frammenti di DNA nucleare (detti micronuclei) vengono trasferiti a livello citoplasmatico nelle cellule dove vi è un sistema di sorveglianza, che originariamente è stato selezionato nelle cellule umane per rispondere ai virus e alle infezioni virali, che innesca un meccanismo infiammatorio. Questo tipo meccanismo, nei pazienti con questa sindrome, è cronicamente attivato. Vi è una pathway che si chiama di cGAS-STING che promuove la produzione di citochine con effetto infiammatorio per cui i soggetti presentano dei processi cronici di infiammazione. 2.7.3. NUCLEOTIDI CON FUNZIONE REGOLATIVA I nucleotidi hanno anche un ruolo regolativo, in particolare conosciamo numerosi ribonucleotidi con funzione regolativa come l’ATP. L’ATP oltre ad avere una funzione energetica ha anche delle funzioni accessorie come, per esempio, il fatto di svolgere un’attività come mediatore autocrino e paracrino. Molecole di ATP, molecole di ADP, ma anche di altri ribonucleotidi nella forma mono-/di-/tri-fosfato sono dei mediatori solubili che vengono secreti da tutti i tipi cellulari e che svolgono il proprio ruolo perché esistono dei recettori di membrana, detti recettori purinergici, specifici per questi mediatori. Attraverso dei meccanismi a cascata di trasduzione del segnale mediati da recettori, questi nucleotidi possono svolgere un ruolo funzionale importante. È stato visto che questi nucleotidi solubili, secreti da diversi tipi cellulari, hanno un ruolo pro-infiammatorio: possono essere prodotti da cellule del sistema immunitario (linfociti neutrofili, monociti) a seguito dell’infezione, per esempio, per contatto con agenti patogeni come i batteri; uno di questi agenti patogeni derivati dai batteri è il lipopolisaccaride (componente chiave della parete batterica dei vari batteri sia Gram + che Gram -). I neutrofili hanno dei recettori che si chiamano Toll-like receptor (TLR) per le componenti del lipopolisaccaride e a seguito del legame con il lipopolisaccaride secernono nucleotidi regolativi come ATP, ALP e ADP. Questi nucleotidi regolativi che svolgono un ruolo chemiotattico verso altri tipi cellulari come i monociti, che poi arrivano nel luogo dell’infiammazione e promuovono la produzione di sostanze tossiche per i batteri, fanno parte integrante di un processo fisiologico di risposta innata da parte del sistema immunitario. Fra i tipi cellulari che sono dotati di maggiori quantità di nucleotidi regolativi ricordiamo le piastrine. Le piastrine sono i tipi cellulari più ricchi di nucleotidi regolativi e per questo svolgono un ruolo importante nelle prime fasi del processo 31/332 coagulativo, dove è necessaria l’attivazione della risposta immunitaria. Tanta di questa risposta immunitaria iniziale avviene attraverso questi mediatori solubili e fra le citochine infiammatorie, prodotte attraverso la stimolazione da parte di questi nucleotidi e recettori colinergici, uno dei mediatori delle citochine infiammatorie più potenti è l’interleuchina 8. Oltre ai nucleotidi con funzione autocrina e paracrina, che possono stimolare cellule diverse nei processi infiammatori, ma anche contribuire al promuovere l’auto attivazione delle cellule che le producono, svolgono attività di mediatore contocrino alcuni ribonucleotidi, in particolare quelli ciclici svolgono un ruolo intracellulare come secondi messaggeri 2.7.4. AMP CICLICO È derivato dalla ciclizzazione del legame fosfodiestereo intra nucleotidico, coinvolge l’ossigeno presente sul carbonio 5’ e quello presente sul carbonio 3’ (adenosina 3’-5’ ciclico monofosfato). È un mediatore importante anch’esso nella trasduzione del segnale di vari tipi di cascate, fra cui quelle attivate dai fattori di crescita in cui un enzima chiave (adenilato ciclasi) promuove la produzione di AMP ciclico. L’AMP ciclico a sua volta svolge la sua funzione di segnalatore intracellulare che attiva una famiglia di chinasi (cioè di proteine che vanno a fosforilare i substrati) della famiglia delle proteinchinasi A. In questo caso attraverso il signaling recettoriale di membrana viene attivata l’adenilato ciclasi a produrre elevati livelli di AMP ciclico che attivino a loro volta delle cascate di trasduzione del segnale che possano svolgere vari tipi di funzioni. Un tipo cellulare che utilizza molto questo sistema di segnalazione è la tiroide, le cui cellule producono ormoni tiroidei su segnalazione da parte dell’ipotalamo attraverso l’ormone TSH che attiva l’adenilato ciclasi e quindi la cascata di trasduzione del segnale. Un altro tipo di nucleotide ciclico è il 2’-3’ ciclico, questo tipicamente è un prodotto di degradazione derivato dall’idrolisi dell’RNA. 2.7.5. LEGAMI FOSFOESTEREI DI TIPO ANOMALO Uno dei più importanti da ricordare è quello che riguarda in particolare gli mRNA eucariotici. Gli mRNA eucariotici sono RNA che codificano per le proteine e presentano una modificazione post trascrizionale che viene aggiunta dopo che è iniziata la biosintesi dell’mRNA relativo e che si chiama capping. Il capping è un meccanismo di tipo enzimatico che attraverso tre categorie di enzimi: una RNAtrifosfatasi, una adenilguaniltransferasi e una metiltransferasi porta all’aggiunta di un residuo di 7-metil guanosina all’estremità 5’ della molecola di mRNA a formare un legame a ponte 5’-5’ con estremità 5’ di quella molecola di RNA. Questa aggiunta post trascrizionale (capping) è un segnale di posizionamento del ribosoma. Il ribosoma, quindi, tra gli elementi che riconosce per individuare il Figura 37 primo codone codificante è il capping e questa struttura ha un significato importante sia per il posizionamento del ribosoma sia perché impedisce alle esoribonucleasi presenti a livello nucleare e citoplasmatico nelle cellule eucariotiche di degradare l’RNA; quindi, è un segnale di stabilizzazione di quella molecola di mRNA (questo vale per mRNA eucariotici). Negli mRNA procariotici invece questo meccanismo non esiste e ciò causa la loro poca stabilità e fa sì che vengano degradati più rapidamente. Gli mRNA materni hanno un’emivita molto lunga. La necessità di renderli più stabili deriva dal fatto che può passare molto tempo tra la loro trascrizione e la loro traduzione, in un batterio c’è invece una logica diversa in quanto, si trascrive e traduce immediatamente; gli RNA non vengono accumulati come avviene negli eucarioti. 32/332 Lezione 3.1 – 21/02/2024- [Giulia Zanor - Rania Hoxhalli] 3.COMPOSIZIONI IN BASI DEI GENOMI 3.1. REGOLE DI CHARGAFF Dopo aver trattato gli acidi nucleici, vengono approfonditi alcuni aspetti collegati alla loro funzione: la composizione in basi dei genomi, la quale inizia storicamente dagli studi di E. Chargaff del 195 e la definizione della struttura secondaria del DNA da parte di J. Watson e F. Crick del 1953. È anche grazie agli studi fatti da E. Chargaff che J. Watson e F. Crick poterono definire la struttura secondaria della doppia elica, così come viene ancora definita oggi. Le regole di Chargaff sono basi fondamentali per gli studi di tipo strutturale, in particolare le tre regole principali Figura 38 (con la lettera χ si indica la frazione molare di ciascuna base): 1. l’equivalenza della somma molare delle basi puriniche con quella pirimidiniche, 2. la frazione molare di adenina è uguale a quella della timina, così come guanina e citosina. 3. la somma delle frazioni molari delle basi amminiche è equivalente alla frazione molare delle basi ossoniche, Le regole sono valide in quasi tutte le specie viventi, possono però variare le percentuali o esserci delle vere e proprie eccezioni. Figura 38 Figura 39 Figura 2 Esistono forme di vita con differenti livelli di complessità, dai mammiferi ai microorganismi unicellulari e virus. In questi organismi, le frazioni molecolari seguono generalmente le regole di Chargaff, sebbene vi siano eccezioni. Ad esempio, nel germe di grano, la frazione molare delle citosine può differire da quella delle guanine, ma considerando anche il contenuto di 5-metilcitosina nel genoma, la somma complessiva mostra un'approssimativa equivalenza con la frazione molare delle guanine. Nel fago ϕX174, dove non ci sono basi modificate che complementano le differenze presenti tra le quantità delle basi come al contrario avviene nell’esempio precedente, la frazione molare dell’adenina è diversa dalla frazione molare della timina e quella delle citosine risulta diversa da quella delle guanine. La spiegazione di queste anomalie è che il genoma di questo fago è a singolo filamento e, di conseguenza, questo spiega come il doppio filamento è in linea con la spiegazione di Chargaff, regole teorizzate prima ancora della scoperta della struttura secondaria DNA. Anche nell’uomo e negli organismi eucariotici superiori ci sono delle anomalie rispetto alle regole di Chargaff: ad esempio nell’uomo si possono trovare anomalie del DNA mitocondriale, in particolare irregolarità che riguardano la prima regola. La spiegazione è legata al fatto che il DNA mitocondriale umano (16 mila paia di basi e di origine materna, tematica legata a patologie del DNA mitocondriale di ereditarietà materna), e in generale di tutti gli organismi, segue un meccanismo di replicazione indipendente a quello del genoma nucleare; infatti, si possono avere diverse copie del genoma mitocondriale presenti contemporaneamente. Durante questi processi di replicazione indipendenti, il genoma mitocondriale viene metilato, in particolare la citosina (5-metilcitosina) ed essa può andare incontro a deaminazione 33/332 spontanea trasformandosi in timina. Il risultato di questa operazione, che dipende anche dal tempo in cui il genoma è nella forma denaturata (tanto più sta nella forma denaturata tanto più è frequente la sua replicazione), è legato all’accessibilità dello stampo da parte della DNApolimerasi. Dove sono presenti questi fenomeni di denaturazione più frequenti in associazione con 5-metilcitosina, si hanno più frequenti e spontanei eventi di deaminazione della citosina in timina. La deaminazione spontanea comporterà come risultato un filamento più ricco di timina e guanina e un altro più ricco di adenina e citosina, perché T e G sono le basi azotate (rispettive pirimidiniche e puriniche) che pesano di più. Quindi sarà presente un filamento pesante, detto filamento H, e uno leggero. Se si vuole separare il genoma mitocondriale nei due filamenti lo si deve denaturare e, analizzandolo su gel, si identificano i due filamenti: uno pesante e uno leggero. Le analisi sulla composizione in basi dei genomi con le regole di Chargaff, ha esposto delle variazioni nel contenuto nella frazione molare delle singole basi nei diversi organismi con genoma costituito da DNA a doppio filamento. Per comprendere la variazione nelle frazioni molari, si conduce uno studio sul contenuto delle coppie GC (guanina-citosina) nei diversi genomi, come illustrato nella Figura 40. Inizialmente, gli studi venivano condotti senza conoscere la sequenza precisa dei genomi, distinguendoli invece in base al loro contenuto di coppie GC. Nell'uomo, in media, la percentuale di questa coppia è del 41%; tuttavia, questa percentuale varia considerevolmente tra gli organismi. Gli eucarioti che vivono a temperature costanti, ad esempio, presentano un contenuto intorno al 40%, mentre microorganismi adattati a condizioni estreme come gli estremofili possono avere contenuti molto elevati, anche superiore al 70%. Questa variazione è legata alla necessità di mantenere una stabilità della doppia elica nonostante le condizioni avverse, come pH o temperature estreme. Il diverso contenuto in GC, insieme all’universalità del codice genetico, va ricollegato alla ridondanza dei codoni ed ai meccanismi che consentono l’utilizzo di questi codoni ridondanti con un codice universale, anche se il contenuto in base dei diversi genomi varia. Figura 40 3.2. DIMENSIONI DEI GENOMI Dal punto di vista dimensionale il genoma può variare: in modo crescente, si passa dai più semplici genomi degli organismi procariotici unicellulari, come E. coli che ha un genoma di circa quattro milioni di paia di basi in un unico genoma circolare, agli eucarioti unicellulari, come saccharomyces che ha un genoma di circa dieci milioni di coppie di basi, a drosophyla, che è un vertebrato di circa cento milioni di copie di basi, per passare all’uomo, il quale ha un genoma di 3,2 miliardi di coppie di basi. Il contenuto in coppie di basi dei vari genomi si chiama valore C, questo identifica la quantità totale di genoma di DNA per genoma aploide di una specie. Progressivamente si può vedere come questo valore C aumenti dimensionalmente passando da 4 milioni dei batteri a 3 miliardi dell’uomo. Se però si guarda il numero di geni (per geni indichiamo le sequenze di genoma trascritte e tradotte in proteine), esso non varia dello stesso ordine di grandezza, si passa, infatti, da un numero di circa 4 mila di geni in E. coli a 19 mila di geni nell’uomo; cosa compresa solo recentemente. Prima si pensava che il numero dei geni durante la filogenesi, quindi tra organismi diversi, fosse esattamente coerente con l’aumento dimensionale del genoma. Questa mancanza di coerenza viene chiamata il paradosso del valore C, il quale identifica il fatto che il numero dei geni non aumenta proporzionalmente alle dimensioni del genoma, poiché, esistendo il junk DNA (DNA ripetuto), il genoma risulta codificante per proteine per meno del 2%. Infatti, a livello regolativo, il genoma è diviso in sequenze codificanti chiamate esoni e sequenze non codificanti chiamate introni, che inframezzano le prime; poi vi sono numerosi altri elementi, come: 34/332  - segmenti intergenici, che sono sequenze di DNA che contengono regioni regolative dei geni o con funzione strutturale che intervallano i geni, - possiamo avere geni in coppia singola o multipla (questi ultimi costituiscono le famiglie geniche, derivate da fenomeni di ricombinazione, a partire da un gene ancestrale che è stato, per ricombinazione, duplicato e ha cominciato a mutare, dando un guadagno di funzione, per esempio geni Hox nello sviluppo embrionale di cui parleremo), - abbiamo geni detti pseudogeni, non più funzionali, geni che per diversi motivi non vengono più trascritti né tradotti, ma sono ancora presenti nel genoma, sono cicatrici che il genoma si porta dietro, - sono cicatrici del genoma quelle derivate da infezioni virali, molti virus (es Covid) utilizzano come meccanismo di replicazione quello della retrotrascrizione, codificando il loro RNA in cDNA. Questo cDNA viene integrato nel genoma dell’ospite costituendo appunto cicatrici, le quali possono essere rilevate. La maggior parte sono non funzionali e non hanno effetto sul genoma. La grossa quota del genoma umano, circa 75%, è dovuto a pseudogeni e sequenze ripetute (ad esempio sequenze interdisperse o di tipo consecutivo, piccoli blocchi di nucleotidi che si ripetono uno dietro l’altro, come nelle sequenze telomeriche e centromeriche dove abbiamo una ripetizione con funzione strutturale di nucleotidi a T o a C vicino al centromero), il restante 25% contiene regioni aventi a che fare con i geni, sia sequenze codificanti (