Méthodes d'étude des protéines PDF

METHODES D4ETUDE DES PROTEINES Mme ROUDJ  Méthodes d’extraction 1. Lyse cellulaire : Principales approches de lyse: Choc osmotique ; Lyse mécanique (homogeneisateur à piston) Permettent de lyser la plupart des cellules animales. Souvent, une dési...

METHODES D4ETUDE DES PROTEINES Mme ROUDJ  Méthodes d’extraction 1. Lyse cellulaire : Principales approches de lyse: Choc osmotique ; Lyse mécanique (homogeneisateur à piston) Permettent de lyser la plupart des cellules animales. Souvent, une désintégration mécanique est nécessaire afin de briser les cellules et permettre l’accès à leur contenu interne. Les techniques utilisées sont :  broyage avec du sable, de l’alumine ou des billes de verre de petite taille;  broyage mécanique (blender) ;  homogénéisateur (Potter en téflon) ;  rupture par haute pression (French press) ;  sonication par vibration ultrasonique Les cellules bactériennes: on doit tenir compte de la présence d’une paroi résistante: -Traitement avec les enzymes lytiques qui détruisent la paroi sans briser la membrane (lysozyme, mutanolysine….) -Traitement brutal:  Ultra-sons: vibrations ou ondes de pression ultra sonique  Lyse en utilisant des billes en verre (bead beater)  Press Aminco-French  Cycles de congélation-décongélation Le lysat obtenu peut être : filtré ou centrifugé afin d’enlever les particules ou débris cellulaires, laissant ainsi la protéine d’intérêt dans le surnageant de la solution. 2. Propriétés physico-chimiques utilisées pour la caractérisation des protéines : Les protéines parfaitement solubles peuvent se disperser dans un milieu que si la mise au contact de la surface de la protéine et du solvant s’accompagne d’une diminution d’énergie libre. Dans l’eau, les parties hydrophobes sont repoussées par l’eau, elles se regroupent pour se protéger. 2.1. Application pour la purification des protéines :  la solubilité différentielle Pour purifier des protéines à partir de leur solubilité, 4 facteurs : 1°) Les sels : Ils diminuent la solubilité. 2°) Le pH : la solubilité maximum est atteinte à pHi. 3°) Le solvant : les solvants organiques neutres diminuent la solubilité 4°) La température  La charge électrique La charge de la protéine dépend de la charge de ses résidus aminés. Chaque protéine à, en général, une charge différente. On peut donc purifier la protéine par électrophorèse ou chromatographie échangeuse d’ions.  La masse molaire et forme La Masse Molaire (MM) est une bonne caractéristique des protéines.  2.2. Solubilité et précipitation : La solubilité en solution aqueuse d'une protéine est liée à ses groupements chimiques de surface. Les zones de surface au contact de l'eau d'une protéine sont soit :  Hydrophobes  Hydrophiles (responsables de la solubilité) Plus la surface d'une protéine présente de résidus hydrophiles par rapport aux zones de surface hydrophobes, plus la concentration en sel nécessaire pour sa précipitation sera élevée. 2.3. Centrifugations Principe : Séparation des particules contenues dans un solvant (cellules non lysées, macromolécules …….) Sédimentation Résultante de l’effet de 2 forces : pesanteur, viscosité du milieu Modifications de la sédimentation  ralentissement : augmentation de la viscosité  accélération : augmentation de la force de pesanteur = création d’une force centrifugation 2.4. Ultracentrifugation Principe : Accélération élevée (> 100000g), température réfrigérée Ultracentrifugation préparative :  Différentielle  En gradients de densité o Zonale : séparation selon les coefficients de sédimentation (gradient de saccharose) Isopycnique : séparation selon la densité (chlorure de césium) 2.5. Dialyse La dialyse est un procédé de séparation par membrane des molécules ou des ions en solution. Les molécules ou les ions traversent la membrane semi-perméable. La dialyse est la méthode la plus utilisée pour changer la concentration en sels d'une solution protéique. Les sels auront tendance à équilibrer leur concentration de part et d'autre de la membrane de dialyse, on utilise un volume de tampon de dialyse beaucoup plus grand que celui de la solution protéique, on changera rapidement la teneur en sels de celle-ci. La dialyse peut être utilisée pour concentrer les protéines : il faut alors utiliser un tampon de dialyse très concentré, contenant un agent comme le polyethylèneglycol (PEG) (ou le saccharose) de taille supérieure à la porosité de la membrane. Applications de la dialyse: o Dessaler des échantillons  o Equilibrer une solution protéique avec un tampon qui modifie le pH de la solution protéique Eliminer des produits diffusibles contenus dans des solutions protéiques o Concentrer une solution protéique 2.6. Ultrafiltration L'ultrafiltration est une technique de séparation qui utilise des membranes semi- perméables dont le diamètre des pores est compris entre 0,001 et 0,1 µm. Principe : séparation des substances selon leur taille moléculaire. Les membranes jouent le rôle de filtre Membrane ne laisse passer que les solvants, comme l'eau, et non les substances en solution. Rétention des macromolécules telles que protéines. 3. Détection des protéines 3.1. Dosage des protéines : Mesure de l'absorption UV : Les acides aminés aromatiques absorbent la lumière dans l'UV. Le maximum d'absorption à lieu à 280 nm. En mesurant la densité optique (DO) on peut déterminer la concentration de protéine. I A  log( t )   .C.l Io 3.2. Dosage au bleu de Coomassie (Bradford) : Le colorant bleu de Coomassie G250 s'adsorbe sur les protéines (acides aminés aromatiques) en milieu acide. Le colorant passe du rouge au bleu (absorbance à 595 Å). La gamme de linéarité est très étroite (2mg-120mg). 3.3. Dosage par la méthode de Biuret : Le cuivre se complexe avec les azotes de la chaine principale à pH alcalin. Le cuivre ainsi coordonné absorbe à 540nm (violet). Méthode peu sensible (1 mg). 3.4. Dosage à l'acide bicinchoninique (amélioration de la methode de Biuret) : On couple le dosage par la méthode du Biuret avec l'acide bicinchoninique. Cu 2+ est réduit grâce à certains acides aminés. Ensuite 2 molécules de BCA chélate spécifiquement Cu+1 et le complexe absorbe à 562nm (pourpre). Cette méthode est très sensible jusqu'à 2mg/ml. Très bonne linéarité et peu sensible aux détergents 3.5. Dosage par la mesure d'activité : si la protéine est une enzyme, on peut estimer sa concentration à partir de la mesure de l'activité de l'échantillon (U.I ou Katal). U: 1 unité =1 mmole de substrat hydrolysé par min Kat: Katal =1 mol de substrat hydrolysé par sec Pour cela il faut connaître l'activité spécifique de l'enzyme: U/mg ou Kat/mg  Techniques de séparation des protéines  Séparation des protéines en fonction de la taille des protéines: Chromatographie d’exclusion, HPLC  Séparation en fonction de l’hydrophobicité des protéines: Reverse Phase  Séparation en fonction de la charge des protéines: Echangeuse d’ions, électrophorèse 1. Chromatographie d’exclusion :  La séparation dépend du diamètre des particules ainsi que de leurs porosités  La vitesse de migration est directement liée à la taille des molécules  Contrairement à d’autres modes de chromatographie, elle repose sur l’absence de toute interaction entre l’analyte et la phase stationnaire de la colonne Les molécules de plus petite taille passent plus de temps dans les pores et éluent plus tard. Les molécules de plus grande taille passent moins de temps dans les pores et éluent plus tôt. le volume total Vtotal d’une colonne remplie d'un gel solvaté : V0 = volume d'eau externe aux granules Vi = volume d'eau interne aux granules Vg = volume du gel Un soluté est distribué dans l'eau interne et l'eau externe selon un coefficient de partage Kd si Kd = 0, le soluté est totalement exclu. si 0 < Kd 1, le soluté est inclus et adsorbé. Kd = (Ve – V0) / (Vt – V0) Vt = volume total (il est mesuré en remplissant la colonne d'eau) V0 = volume mort (il est déterminé en mesurant le Ve d'une substance totalement exclue) Ve = volume d’élution d’une substance donnée Droite étalon : log (masse molaire) = f (KD) ou masse molaire = f(KD) La partie linéaire de cette droite permet de déterminer la masse molaire d'une molécule X dont le volume d'élution a été mesuré dans les mêmes conditions, en reportant son K D 2. Chromatographie d’affinité  basée sur des interactions spécifiques entre deux molécules comme une protéine et son ligand.  Dans une colonne on fixe sur un support inerte de façon covalente un ligand.  On fait passer dans la colonne une solution contenant plusieurs protéines. La formation d'un complexe stable mais réversible permet de séparer la protéine ayant de l'affinité pour ce ligand.  En modifiant les conditions d'élution, on décroche la protéine qui sera récupérée. Fixation : Le mélange de molécules contenant le composé à purifier est chargé sur la colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour l’effecteur sera retenue. Purification : En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molécules contaminantes sont éliminées et éluées Elution : La molécule purifiée est décrochée de la colonne et recueillie dans l'éluat. Les protéines sont chargées sur la colonne dans des conditions qui influencent la liaison entre la protéine et son ligand. La protéine liée est lavée dans des conditions qui ne perturbent pas l'interaction spécifique, mais qui peut perturber les interactions non spécifiques entre protéines contaminantes et la phase stationnaire. La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective mais délicate à mettre en œuvre : o la matrice ne doit pas adsorber. o la fixation de l'effecteur à la matrice ne doit pas modifier l'affinité de celui-ci vis à vis de la macromolécule cible.  o l'affinité effecteur-macromolécule doit être suffisamment forte pour permettre la fixation, mais pas trop pour que l'on puisse, ensuite, dissocier la liaison et éluer la protéine sans la dénaturer. o dans le cas d'un isolement d'une enzyme, il est important de veiller à ce que les conditions ne permettent pas à cette enzyme d'être fonctionnelle, risquant ainsi de transformer l'effecteur. 3. Chromatographie par échange d’ions Principe: Cette méthode repose sur la différence d'interaction entre les molécules chargées à séparer et la phase stationnaire La phase stationnaire = un support macromoléculaire (dextrane, cellulose ou gel de polyacrylamide) sur lequel sont greffés par liaison covalente des groupements soient:  acides, donc charge négative lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH > à leur pKa. Il s'agit alors d'échangeur de cations.  basiques, susceptibles de se charger positivement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH < à leur pKa. Il s'agit alors d'échangeur d'anions. L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs: o de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend: -de leur nature (pKa) o du pH de la solution o de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend o de la charge de cet ion (pKa, pHi) et du pH de la solution o de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il est chargé, ou/et qu'il est petit) o de la concentration des ions o de l'accessibilité des groupements fonctionnels La chromatographie d'échange d'ions se réalisent en 4 étapes: Première étape: la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé. Deuxième étape: dépôt des molécules à séparer sur la colonne. La solution est dans le même tampon de pH qui a permis de ioniser l'échangeur d'ions. Troisième étape: élution des molécules fixées sur la résine soit en modifiant le pH soit, en ajoutant un sel Quatrième étape: régénération de l'échangeur d'ions (par lavage avec une solution de pH permettant de remettre les charges dans leur valeur initiale). Fixation au gel Dans un premier temps: la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :  dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5)   dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4) Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de leur point isoélectrique ou pHi, elle porte une charge nette : négative ; nulle ; positive Elution des molécules fixées au gel Il y a deux manières pour éluer les molécules fixées sur la résine :  en ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre ion.  en modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions). Il n'y a plus d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées. 4. High performance liquid chromatography: HPLC Principe: Les composés à séparer sont mis en solution dans un solvant. Le mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans la colonne chromatographique. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique Le mélange à analyser est injecté : Les composés en solution se répartissent suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. Notion de pression : pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la pression (la granulométrie de la phase stationnaire est faible) En HPLC : pressions entre 20 et 150 bars. Pour qu’il y ait séparation, les molécules interagissent de manières différentes avec au moins une des phases (stationnaire et mobile). Ces phases doivent avoir des polarités différentes.  Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus que les composés non polaires.  Si la phase stationnaire est apolaire, les composés apolaires seront plus retenus que les composés polaires. phase stationnaire polaire : Si-OH. Pour que la séparation soit efficace, la phase mobile doit alors être peu polaire. phase stationnaire polaire et phase mobile peu polaire: la chromatographie à polarité de phase normale: détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations. Par la suite, les particules de silice (support) ont été enrobées de paraffine en C 18 pour faire une phase apolaire: dans ce cas, pour que la séparation soit efficace, la phase mobile est polaire (généralement à base d’eau). "phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire" La phase mobile: un mélange eau/solvant organique, en proportion variable chromatographie à polarité de phase inversée. a) la phase aqueuse L’eau est le solvant le plus polaire Un acide fort TFA (l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine) neutralisent les charges portées par les molécules à séparer donc augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire. b). le solvant organique : les plus employés: acétonitrile et méthanol. le choix du solvant organique dépend de l'hydrophobicité des molécules à séparer : o pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne o ou une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible. 5. Chromatographie d'interactions hydrophobes Principe : Quand un composé hydrophobe se trouve dans un environnement polaire comme l'eau, il en résulte un état thermodynamiquement défavorable. 1ère étape : On fixe la protéine à séparer sur le support chromatographique en présence d'une forte concentration en sel : il en résulte une modification de l'organisation des molécules d'eau autour des protéines et ce changement d'environnement est favorable à l'établissement d'interactions hydrophobes entre les régions hydrophobes à la surface des protéines et le groupement hydrophobe porté par la phase stationnaire 2ème étape : - Après rinçage du gel afin d'éliminer les protéines non adsorbées, l'élution des protéines fixées est obtenue : en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi progressivement éliminés. - les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase mobile, c'est-à-dire que la solubilité des protéines dans la phase mobile redevient maximale et elles sont éluées. Autres moyens d'éluer les protéines fixées : - ajouter un ion qui induit une diminution de l'organisation des molécules d'eau (donc une augmentation de leur entropie) : la force des interactions hydrophobes est ainsi diminuée. - ajouter un détergent / augmenter le pH / diminuer la température puisque la force des interactions hydrophobes diminue avec celle -ci. En résumé : Les différents principes de chromatographie sont basés sur un des facteurs suivants : Facteur Technique chromatographique  Taille et forme: Chromatographie d’exclusion  Polarité: Chromatographie d’adsorption et d’adsorption en phase inversée  Charge électrique: Chromatographie par échange d’ions  Groupement d’atomes formant des sites particuliers : Chromatographie d’affinité  6. Electrophorèse L'électrophorèse est une technique biochimique de séparation fondée sur le fait que des molécules portant des charges électriques différentes migrent à des vitesses différentes lorsqu'elles sont placées dans un champ électrique. Celles qui sont chargées négativement, les anions, migrent vers l'anode; celles qui sont chargées positivement, les cations, migrent vers la cathode; celles qui ne sont pas chargées, neutres, ne migrent évidemment pas Principales matrices d’électrophorèse La matrice d'une électrophorèse est le support dans lequel l'échantillon sera déposé et ses molécules migreront. Plusieurs types de matrices qui diffèrent au niveau de leur constitution, du type de montage dans lequel elles sont utilisées et leurs caractéristiques physico-chimiques. La séparation moléculaire est basée sur la mobilité électrophorétique des molécules, Les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille plus grande, La migration des molécules larges est donc retardée par rapport aux molécules plus petites Principe : La molécule chargée, va migrer dans le champ électrique, vers l'électrode de charge opposée. La mobilité électrophorétique est proportionnelle à la densité de charge (charge/taille) de la particule. 6.1. Electrophorèse native - les différentes protéines séparées en fonction de leurs charges - Les états d'oligomérisation sont conservées - on peut faire migrer les protéines dans des conditions non dénaturantes - Révélation par l'activité 6.2. Gels SDS-PAGE (dénaturante) La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a été décrite par Ulrich Laemmli en 1970. Cette technique dépend du fait que certains détergents, par le biais de leurs interactions hydrophobes, sont capables de dénaturer la structure d’une protéine [CH3 - (CH2)10 – CH2 – O – SO3]Na+ ) SDS Le sodium dodécyl sulfate (SDS) se lie et dénature la plupart des protéines. Sa liaison masque toutes les charges de la protéine, et lui confère une charge globale négative élevée (polyanion). La densité de charge globale de toutes les protéines est similaire, donc la mobilité électrophorétique est déterminée par les effets de tamisage. La mobilité devient fonction de la masse moléculaire de la protéine, et non de sa forme. On ajoute très souvent au mélange dénaturant du 2-mercaptoéthanol: réduit les ponts disulfure unissant les différentes sous-unités des protéines oligomériques. Chaque sous-unité, une fois dissociée, fixe le SDS et prend une charge apparente négative. Les sous-unités étant dissociées, sur le gel, apparaitrons après migration, autant de bande qu'il y avait de sous-unités constitutives. En résumé: Les protéines sont dénaturées :  elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native  Les protéines n'ont plus de ponts disulfure : elles sont sous une forme monomérique Séparation des protéines afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes plus minces, on utilise deux gels dans des tampons différents: - un gel de séparation (running gel), - un gel de concentration (stacking gel), qui surmonte le gel de séparation et qui est de plus haute porosité Les protéines vont se déplacer rapidement dans le gel de concentration et s'accumuler à l'interface avec le gel de migration avant de pénétrer ce dernier. Cela accroît la concentration des protéines avant qu'elles n'entrent dans le gel de migration, ce qui augmente la résolution. En utilisant des marqueurs de poids moléculaires connus, il est possible de calibrer la migration sur gel par rapport aux poids moléculaires Relation linéaire entre la mobilité électrophorétique et le logarithme du poids moléculaire 7. Visualisation des protéines dans les gels les différentes approches : o la coloration avec le bleu de Coomassie brillant o la coloration au nitrate d’argent o une approche plus spécifique consiste à détecter la protéine d’intérêt avec un anticorps qui reconnaît cette protéine: « Western blot » 6.3. Electrofocalisation ou Isoelectrique Focusing (IEF) Séparation des protéines en fonction de leurs points isoélectriques Utilise des gradients de pH, Grand pouvoir de résolution La migration est effectuée dans un gradient de pH; chaque molécule migre jusqu'à l'endroit où le pH est égal à son pHi. Le gradient de pH est généré par des ampholytes: molécules amphotères de synthèse (ampholines) introduites dans le gel. Ces molécules migrent rapidement dans le gel jusqu'à atteindre une zone où leur charge devient nulle. Elles ont alors une distribution statistique telle qu'elles génèrent un gradient de pH. 6.4. Electrophorèse en 2 dimensions L’électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide, appelé gel 2D – PAGE («two- dimensional polyacrylamide gel electrophoresis») introduite par O'Farrel en 1975, elle permet d’étudier l’ensemble des protéines exprimées par un organisme ou un type cellulaire donné. C’est l’association de: électrofocalisation et électrophorèse en SDS Méthode très résolutive, c’est l’approche la plus courante pour l’analyse des protéines (proteomique), Lecture des résultats par analyse d’image Couplée à une identification par spectrométrie de masse (MS) Elle permet, à l’issue de deux migrations électrophorétiques successives, de visualiser un grand nombre de protéines de façon simultanée Principe: Deux séparations électrophorétiques des protéines en fonction de:  leur point isoélectrique (pHi)  leur masse moléculaire La première dimension: focalisation isoélectrique (IEF). Les protéines migrent sous l’action d’un champ électrique jusqu'à une zone de pH égale à leur pHi. La seconde dimension utilise un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (PAGE) en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) qui va permettre de séparer les protéines en fonction de leur masse moléculaire. Les paramètres de la séparation sont indépendants, Sur le gel, les protéines sont révélées par des techniques de coloration utilisant: - le bleu de Coomassie, nitrate d'argent - ou des réactifs fluorescents - ou encore par autoradiographie (marquage radioactif). Les protéines apparaissent sous forme de taches de protéines ou spots sur un gel dont les intensités sont proportionnelles à la quantité de protéine. Le plus souvent, après séparation sur le gel 2D, les tâches correspondant aux protéines d’intérêt sont découpées du gel et digérées par une enzyme, l’hydrolysat est analysé par spectrométrie de masse. On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique". La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse d'images (Exemple:Expert Protein Analysis System «Expasy») En résumé, La technique d'électrophorèse permet, entre autre, de : Déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse respective D'évaluer le degré de purification d'une protéine  De séparer des protéines pour les révéler par la technique de Western blot (réaction avec un ou plusieurs anticorps) par exemple. De séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels, selon 2 paramètres : point isoélectrique (isofocalisation), puis masse molaire 7. Digestion enzymatique des protéines La digestion des protéines engendre un mélange complexe d’un grand nombre de peptides, elle simplifie l’analyse par spectrométrie de masse Principe de la digestion enzymatique : La digestion enzymatique consiste à fragmenter de manière localisée une protéine au moyen d’une protéase. L’enzyme la plus couramment utilisée est la trypsine. C’est une enzyme extrêmement spécifique hydrolysant la liaison peptidique après les acides aminés, lysine et arginine sauf si ces acides aminés sont suivis par une proline La pepsine, est active à pH acide (pH 1-3), elle coupe les liaisons peptidiques dans lesquelles est engagé un acide aminé aromatique. La pepsine, moins spécifique que la trypsine, coupe préférentiellement au niveau des acides aminés phénylalanine, tyrosine, tryptophane et leucine. La digestion des protéines possédant des ponts dissulfure est rendue difficile puisque les sites de coupures ne sont pas tous facilement accessibles. Aussi, avant la digestion enzymatique, un protocole de réduction-alkylation des ponts disulfures est très souvent appliqué pour rompre cette structure. Les morceaux de gel d’intérêt sont découpés puis déshydratés par de l’acétonitrile et le tampon dans lequel se trouve l’enzyme est ajouté. Les échantillons sont ensuite analysés par spectrométrie de masse. Lorsque que seule la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est la méthode choisie pour l’analyse des protéines, celles-ci sont digérées le plus souvent en solution: le protocole consiste à ajouter l’enzyme de digestion à l’échantillon de protéines dans les conditions optimales de pH et de température. 8. Détection par spectrométrie de masse : technique d’étude structurale des protéines une technique d'analyse physico-chimique permettant de détecter, d'identifier et de quantifier des molécules d’intérêt (protéines) par mesure de leur masse mais aussi pour leur caractérisation (modifications post-traductionnelles, chimiques, mutations d’acides aminés…). Principe de MS : la spectrométrie de masse consiste à produire des ions à partir de composés et à les détecter en fonction de leur rapport masse/charge ( m/z, où m est la masse du composé et z son nombre de charge). Les informations obtenues permettent d’établir les abondances relatives des ions en fonction du rapport m/z. Un spectromètre de masse comporte 3 parties:  Une source d’ion, où les ions sont produits en phase gazeuse à partir des états solides, liquides ou gazeux.  Un ou plusieurs analyseurs dans lequel les ions sont manipulés (transportés, tournés, triés, sélectionnés, fragmentés…).  Un détecteur qui compte des ions et amplifie leurs signaux ou enregistre l’image d’un courant induit par le mouvement des ions.  Enfin un système informatique qui collecte toutes les données à partir de ces trois éléments pour générer un spectre de masse. Protéomique 1. Définition La protéomique: l’étude de l’expression des protéines totales qui permet de mieux comprendre l’implication des protéines dans la machinerie cellulaire. 2. Les étapes de la protéomique: Passent par l’étude: o structurale et fonctionnelle de ces macromolécules, o l’analyse quantitative mettant en évidence les mécanismes de régulation régissant leur synthèse o le regroupement de toutes les données à l’aide d’outils informatiques de plus en plus performants L’ensemble de ces connaissances entraîne des innovations majeures, en recherche fondamentale, en biotechnologie industrielle et en biotechnologie appliquée au domaine de la santé. L'analyse protéomique permet une description dynamique de la régulation de l'expression génique, grâce à l'étude des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles. Elle trouve deux approches :  Cartographie protéique : Recenser toutes les protéines visibles  Comparaison de l’expression protéique dans plusieurs situations: Recenser les protéines différentiellement exprimées La Bioinformatique est un outil indispensable pour l’identification des protéines lors d’une analyse protéomique: On consulte les banques de données, telles que Swiss-Prot avec des logiciels dédiés à l’identification des protéines (Sequest, Mascot, Peptide Search, Protein Prospector) Les logiciels vont comparer la masse de la protéine étudiée aux masses des protéines des banques de données Si la protéine n’est pas identifiée, on réalise la comparaison avec les masses des peptides issues de la digestion trypsique. 3. Grands domaines d’application de la protéomique La spectrométrie de masse et l’analyse en gel 2D représentent les méthodes majeures d’utilisation en recherche fondamentale:  De nombreux profils d’expression d’organismes , soumis à différents stimuli, ou lors d’un phénomène de différentiation ou encore au cours du développement d’organisme sont établis.  Analyse des modifications post-traductionnelles : Les modifications post- traductionnelles constituent un autre champs d’application très important au niveau du métabolisme des protéines et de leur régulation qui peut être explorée par l’analyse protéomique.  Analyse protéomique de microorganismes : L’approche du protéome par les gels 2D est de plus en plus réalisée sur des microorganismes modèles ou pathogènes ou sur des champignons. Séquençage des protéines 1. Etapes impliquées dans le séquençage d’une protéine : Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités) dans la protéine Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires) Détermination de la composition des acides aminés de chaque chaîne polypeptidique Les chaînes polypeptidiques sont souvent trop longues pour être directement séquencées; elles doivent être coupées en des plus petits fragments peptidiques par des réactions spécifiques. Détermination de la séquence de chacun des fragments peptidiques par la dégradation d’Edman Élucidation de la séquence de chacune des chaînes polypeptidiques par recouvrement des séquences des différents fragments Détermination de la structure de la protéine entière, incluant les liens disulfures entre les sous-unités  2. Analyse des résidus terminaux : chaque chaîne polypeptidique possède un résidu N terminal et C-terminal, le nombre de sous-unités distinctes dans une protéine peut être déterminé en identifiant le nombre de chacun des résidus terminaux Analyse N-terminal :  Réaction avec du chlorure dansyl (réagit avec des α-amines) Méthode de Sanger  Dégradation d’Edman (phényl isothiocyanate: PITC) analyse séquentielle:  Réaction enzymatique (exopeptidase): L’utilité des aminopeptidases pour l’analyse des résidus N-terminal est limitée puisque ces enzymes agissent spécifiquement sur certains acides aminés et avec des vitesses de réaction différentes. Analyse C-terminal :  Réaction enzymatique (exopeptidase): Due à la nature sélective des carboxypeptidases, certains résidus sont résistants aux coupures ou sont coupés très lentement.  Réaction chimique (ex. hydrazinolyse) Coupure des liens disulfures : Les liens disulfures doivent être coupés avant le séquençage pour séparer et déplier les sous-unités.  Oxydation avec de l’acide performique: Toutes les cystéines dans une protéine sont oxydées (celles qui sont liées ensemble par des ponts disulfures et celles qui sont en forme de thiol). L’acide performique réagit aussi avec d’autres résidus: ex. le groupement indole de Trp (partiellement détruit) et les résidus Met sont oxydés.  Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol Détermination de la composition d’acides aminés d’une protéine Le nombre de chaque acide aminé dans une chaîne polypeptidique est un paramètre caractéristique de chaque protéine: une protéine inconnue peut souvent être identifiée en mesurant le pourcentage relatif des différents acides aminés et en comparant avec des bases de données. Les liens peptidiques dans une protéine sont hydrolysés par traitement acide, basique ou enzymatique. Les acides aminés libérés sont ensuite séparés et quantifiés. les conditions optimales pour l’hydrolyse acide sont difficiles à établir, la réaction est effectuée plusieurs fois dans des conditions différentes et la composition des acides aminés est déduite à partir des différentes expériences d’hydrolyse. - Les méthodes enzymatiques sont surtout utilisées pour la détermination de l’Asn, de la Gln et du Trp. Les exopeptidases et endopeptidases montrent des spécificités élevées, il est essentiel d’utiliser un mélange d’enzymes pour assurer l’hydrolyse de tous les liens peptidiques. Après hydrolyse (acide, basique ou enzymatique), les acides aminés libres sont séparés par chromatographie à échange d’ions ou par HPLC à phase inversée. Les acides aminés peuvent être identifiés selon leur temps de rétention et quantifiés selon leur volume d’élution. Coupure spécifique des liens peptidiques : fragmentation enzymatique Fragmentation chimique : Le CNBr coupe les liens peptidiques du côté C-terminal d’un résidu Met.