Biologia Molecolare 11.2 Past Paper PDF (21/11/2023)

Biologia molecolare 11.2 21/11/2023 IL SILENZIAMENTO GENICO La parte del genoma definita junk DNA, ovvero DNA “spazzatura”, non corrisponde a RNA messaggero o codificante per proteine, bensì a RNA NON codific...

Biologia molecolare 11.2 21/11/2023 IL SILENZIAMENTO GENICO La parte del genoma definita junk DNA, ovvero DNA “spazzatura”, non corrisponde a RNA messaggero o codificante per proteine, bensì a RNA NON codificanti e regolatori e costituisce la maggior parte del genoma (circa il 98%). Grazie all’analisi di questa componente è stato chiarito il paradosso della complessità del genoma: quest’ultima sale nella scala evolutiva, nonostante il ridotto numero di geni che codificano per proteine, proprio perché aumentano gli RNA non codificanti e, di conseguenza, la possibilità di influenzare forza, potenza e qualità dell’espressione dei singoli geni. L’ESPERIMENTO DI FIRE E MELLO Andrew Fire e Craig Mello (premio Nobel per la Medicina nel 2006) sono stati i primi a chiarire il meccanismo con cui si verifica il silenziamento genico, il quale è alla base della modulazione della trascrizione. In un articolo del 1998 i due chiariscono quali sono le caratteristiche che portano all’eliminazione di un RNA messaggero corrispondente ad una certa proteina in una cellula eucariote, eliminazione mediata da una corta molecola di RNA non codificante. Come modello di studio hanno utilizzato il verme trasparente Caenorhabditis elegans, la cui caratteristica fondamentale consiste nel possedere un numero finito e costante di cellule a livello delle quali è stato mappato ciascun trascrittoma. Questo ha permesso di conoscere che cosa produce ogni singola cellula e di identificare con chiarezza le conseguenze di eventuali modifiche apportate al genoma. L’esperimento mirava a silenziare un gene ed ottenere un riscontro facilmente controllabile ed osservabile a livello dell’intero organismo: il gene scelto è stato unc- 22, il quale codifica per una proteina contrattile che se non viene espressa correttamente determina uno spasmo muscolare incontrollato. I ricercatori, sapendo che il silenziamento poteva essere guidato da corti filamenti di RNA non codificanti, hanno: 1. provato inizialmente a trasferire nell'organismo una molecola di RNA esattamente identica al mRNA del gene target, non riscontrando però alcun tipo di fenotipo; 2. cercato di silenziare unc-22 trasferendo nell’organismo una molecola di RNA antisenso rispetto al RNA messaggero del gene, non riscontrando nemmeno in questo caso alcun tipo di effetto; 3. trasferito nell’organismo una sequenza di RNA corrispondente a quella del gene target ma a doppio filamento: in questo caso la molecola di mRNA del gene scompariva dall’organismo (mentre il resto dei geni rimaneva regolarmente trascritto ed espresso perché, sia in natura che in laboratorio, una volta scelto il gene da silenziare, il processo è specifico verso solo e soltanto quel gene). Sbobinatore: Bardelotto Chiara Revisore: Zanta Emma Biologia molecolare 11.2 21/11/2023 L’RNA a doppio filamento usato per silenziare il gene target possiede una sequenza che corrisponde a quella del messaggero del gene e non comprende sequenze introniche, quindi quello che viene identificato come bersaglio è proprio l’mRNA maturo e non il precursore trascritto nel nucleo. Il silenziamento, dunque, avviene a livello citoplasmatico e ciò è verificabile dal momento che il messaggero, ad un certo punto, sparisce dalla cellula. Inoltre, le molecole di silencer che vengono trasferite nell'organismo agiscono con un effetto catalitico; infatti, quella parte di loro in grado di identificare il messaggero di unc-22 è in grado di spegnerne completamente l’espressione globale e, oltretutto, riesce a passare di cellula in cellula e a far diffondere nell’interno organismo l’effetto del silenziamento del gene. Durante il corso ci si concentrerà su una soltanto delle numerose classi di RNA non codificanti con effetto di modulare l’espressione genica nelle nostre cellule, e si focalizzerà lo studio sui microRNA. Le altre classi che vengono affrontate e quotidianamente investigate dai ricercatori non saranno oggetto delle nostre lezioni e del nostro studio. Verrà fatto un discorso generale sui microRNA accompagnato da qualche esempio. I MICRO-RNA I microRNA sono molecole tipiche del mondo eucariota (ma non solo) e sono molecole codificate dal nostro genoma. Esse subiscono un processo di biogenesi ben preciso e sono molecole già presenti nel panorama clinico; infatti, da vent’anni (ovvero da quando sono stati scoperti ad oggi) sono impiegati in ambito terapeutico e farmacologico e costituiscono una parte fondamentale di quest’ultima frontiera del trattamento farmacologico. I geni che codificano per queste molecole sono presenti all’interno del nostro genoma e vengono trascritti dalla RNA polimerasi II con lo stesso meccanismo visto nelle scorse lezioni. Dopo la biogenesi e la maturazione, le molecole di microRNA interagiscono col proprio bersaglio (mRNA) nel citoplasma, riconoscendo in maniera precisa sequenze a livello della regione 3’ UTR, (anche se in realtà sarebbero in grado di riconoscere sequenze disposte lungo tutta la lunghezza del trascritto e solo per comodità bersagliano proprio quelle a livello di 3’ UTR). La caratteristica vantaggiosa di queste molecole, usate come mezzo di comunicazione e repressione trascrizionale da alcune cellule, è la loro presenza e circolazione nei fluidi biologici. Esse infatti passano nella linfa, nel latte materno e nell’urina e risultano quindi molecole stabili che rendono possibile una comunicazione simil ormonale a livello dell’intero organismo. In aggiunta, è stato osservato che i microRNA vengono attivamente secreti dalle cellule. Questo sottolinea la loro volontà di incapsulare e rilasciare i microRNA in modo che possano essere captati da altre cellule, anche se Sbobinatore: Bardelotto Chiara Revisore: Zanta Emma Biologia molecolare 11.2 21/11/2023 distanti dal punto di vista topografico. Questo processo si è evoluto e mantenuto costante affinché potesse avvenire il silenziamento di bersagli a RNA specifici a distanza. Una cellula di un certo distretto dunque riesce quindi a indurre a distanza il silenziamento di uno specifico RNA messaggero in un’altra cellula. Le sequenze dei microRNA si sono conservate nell’evoluzione, a riprova del loro funzionamento molto simile in organismi diversi (come il verme e l’homo sapiens). La loro organizzazione può essere varia: Ø In alcuni casi i microRNA hanno struttura genomica sovrapponibile a quella di qualsiasi altro gene: sono dotati di un proprio promotore, con elementi prossimali e distali di regolazione esattamente sovrapponibili a quelli di qualsiasi altro gene. Ø In altri casi, invece, le sequenze che codificano microRNA sono state identificate all’interno delle sequenze introniche Ø Alcune volte invece i microRNA sono nascosti all’interno di esoni di geni assolutamente non correlati e vengono excisi dal trascritto principale da una macchina molecolare deputata a questo tipo di funzione. I microRNA che sono presenti a livello degli introni hanno nascosta nella sequenza intronica il promotore specifico, quindi di fatto gli introni, oltre ad essere la macchina che il genoma ha affinato per variare la sequenza degli RNA che codificano proteine, possono nascondere sequenze di RNA regolatori compresi di promotori specifici. Questo va a spiegare perché l’analisi genetica che viene effettuata sugli esoni è parziale: perché rappresenta solo il 2%, il vero messaggio è contenuto nel junk DNA. I microRNA che presentano una sequenza genica simile sono raggruppati in famiglie. Spesso queste famiglie condividono lo spazio in cui sono concentrati nel genoma: ad esempio i microRNA che vanno dal mir-35 al mir-41 sono concentrati in una regione specifica del genoma, permettendo alla DNA polimerasi di trascrivere tutta la famiglia di microRNA a partire da un unico promotore. Un microRNA può riconoscere la sua sequenza bersaglio in più RNA messaggeri; pertanto, una stessa molecola può avere diversi bersagli, così come un singolo RNA messaggero può essere identificato come bersaglio da molteplici microRNA. Sbobinatore: Bardelotto Chiara Revisore: Zanta Emma Biologia molecolare 11.2 21/11/2023 Questo comporta una pressoché infinita variabilità delle combinazioni che permettono la modulazione di ogni singolo RNA messaggero che viene trascritto dalla RNA polimerasi II. Il database aggiornato conta ben 2300 microRNA depositati. Sbobinatore: Bardelotto Chiara Revisore: Zanta Emma