Técnicas de Inmunología

UT5. Valoración de la Funcionalidad de la Inmunidad Celular

• Los linfocitos son responsables de la inmunidad específica.
• Es importante estudiarlos para comprender el sistema inmune.
• Estudios importantes incluyen pruebas de funcionalidad y cuantificación.
• La separación de linfocitos del resto de componentes sanguíneos es un paso previo necesario.

Técnicas de Separación de Linfocitos

• Gradiente de Ficoll: Es el método más común para obtener preparaciones de linfocitos purificados o enriquecidos para experimentos in vitro.
• Procedimiento: Sangre desfibrinada se diluye en medio de cultivo y se vierte en un tubo con Ficoll hasta la mitad. Se centrifuga para separar los linfocitos de otros leucocitos (mononucleares) como monocitos.
• Gradiente de Ficoll: Está compuesto por Ficoll 400, un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina con una densidad mayor que los linfocitos, pero menor que los eritrocitos y granulocitos, provocando la aglutinación de eritrocitos.
• Diatrizoato de sodio: Se mezcla con ficoll para generar soluciones de baja viscosidad y alta densidad creando la condición óptima para la separación celular y la viabilidad.

Preparación del Medio Separador Ficoll

• Preparar disolución de Ficoll 400 al 14%.
• Mezclar 12 partes de solución de Ficoll con 5 partes de diatrizoato de sodio al 32.8%.
• Ajustar densidad y osmolaridad.
• Esterilizar por filtración.
• Conservar a 4°C en oscuridad (el diatrizoato es fotosensible).
• Preparaciones comerciales disponibles en el mercado.

Fundamento del Proceso con Gradiente de Ficoll

• Con la centrifugación de la sangre desfibrinada se separan las células sanguíneas según sus densidades.
• Los granulocitos tienen mayor densidad y sedimentan en el fondo.
• Los eritrocitos, también de alta densidad, se aglutinan con el Ficoll y sedimentan en el fondo.
• Los linfocitos y monocitos, de menor densidad, permanecen en la interfaz entre el plasma y el medio.

3 Fases Observadas en la Centrifugación

• Superior: Plasma.
• Intermedia: Células mononucleadas (linfocitos, monocitos).
• Inferior: Eriroocitos y granulocitos.

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos B

• La funcionalidad se estudia induciendo mitosis in vitro mediante diferentes métodos.
• Las determinaciones in vitro reflejan los mecanismos de activación y proliferación celular durante la respuesta inmunológica in vivo.
• La producción de anticuerpos se usa como un parámetro para evaluar la funcionalidad de los linfocitos B, ayudando en el diagnóstico de inmunodeficiencias.
• Se utilizan métodos como la inmunodifusión radial y la turbidimetría para cuantificar las inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA).
• En caso de inmunodeficiencia en la producción de IgM, se recomienda la detección de anticuerpos específicos mediante ELISA.
• Se miden subclases de inmunoglobulinas frente a diferentes antígenos, por ejemplo, IgG2 frente a polisacáridos capsulares de neumococo.
• Detectar los anticuerpos en sobrenadantes de cultivo in vitro estimulados por antígenos mediante ELISA con antígenos específicos.

Estudio de la Funcionalidad de los Linfocitos T

• El nivel de proliferación en respuesta a mitógenos se evalúa mediante:
• estudio de proliferación en respuesta a mitógenos.
• estudio de proliferación mediante citometría de flujo.
• Valoración de citoquinas.
• Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada.
• Los linfocitos T sensibilizados frente a antígenos se transforman en linfoblastos que se dividen activamente al ser cultivados en presencia de mitógenos.
• La proliferación implica la síntesis de ADN que se puede medir por la tasa de incorporación de timidina tritiada.

Estudio de Proliferación mediante Mitógenos

• Separar los linfocitos por centrifugación con Ficoll y diatrizoato.
• Lavar los linfocitos varias veces con medio de cultivo.
• Ajustar con medio de cultivo a una concentración de 5-10 células/ml de linfocitos.
• Dispensar la muestra en placas de microtitulación de 96 pocillos.
• Añadir solución de mitógenos, con excepción de los pocillos de control.
• Incubar 72 horas a 37˚C en atmósfera de CO2.
• Añadir timidina a los pocillos para incubar mínimo 16 horas.
• Recoger las células en filtros de fibra de vidrio y colocar en viales con líquido de centelleo.
• Medir la radiactividad en el líquido.
• Comparar la radioactividad de las células estimuladas y las del control para establecer la tasa de proliferación.
• Cuantificar en una cámara y ajustar la concentración celular (5-10 células/ml).

Estudio de Proliferación mediante Citometría de Flujo

• Utilizar un marcador en los linfocitos y medir la reducción de la señal de fluorescencia.
• La reducción de la señal es proporcional a la actividad mitógena.

Valoración de Citoquinas

• Se estudian los sobrenadantes de cultivos estimulados con antígenos o mitógenos mediante ELISA en sándwich de dos anticuerpos.
• Tapizar las placas con un anticuerpo monoclonal contra la citoquina a determinar.
• Adicionar la muestra problema y lavar.
• Añadir un anticuerpo monoclonal marcado con biotina contra la citoquina, incubar y lavar.
• Adicionar conjugado e incubar en ambiente de temperatura ambiente y lavar.
• Agregar sustrato e incubar en ambiente de temperatura ambiente hasta que aparezca el color.
• Cuantificar la intensidad del color con un lector de placas.
• Los resultados positivos son aquellos valores que superan en tres desviaciones al valor medio de las muestras de control negativas. Crear una curva estándar para validad los resultados.

Prueba de Hipersensibilidad Cutánea Retardada

• Se inocula intracutáneamente una cantidad conocida de PPD (derivado proteico purificado) a nivel intracutáneo.
• Tras 48-72 horas se observa la zona de la inyección.
• La prueba es positiva si aparece una pápula de más de 2 mm de diámetro.
• Un resultado positivo puede indicar alguna inmunodeficiencia.

Deficiencias Inmunitarias Congénitas y Adquiridas

• Se presenta una lista de deficiencias congénitas e inmunitarias adquiridas.

Cuantificación de Linfocitos

• Se utiliza la inmunofluorescencia directa con anticuerpos específicos para identificar y cuantificar las poblaciones de linfocitos.
• Se puede realizar la cuantificación mediante inmunofluorescencia y recuento microscópico para linfocitos B.
• La citometría de flujo es otra opción para cuantificar linfocitos T.
• Otras técnicas incluyen la formación de rosetas-E, prueba de citotoxicidad por liberación de cromo.

Técnica de Formación de Rosetas-E

• Obtener linfocitos por centrifugación.
• Ajustar el número de células a 5x10⁵/ml en medio sin suero.
• Lavar eritrocitos de carnero 4 veces con solución salina 0.85%.
• Resuspender eritrocitos en medio sin suero (0.5% v/v).
• Añadir 0.1 mL de eritrocitos resuspendidos y 0.1 mL de linfocitos.
• Adicionar 20 µL de suero fetal bovino inactivado.
• Centrífugas a 50x g durante 5 minutos e incubar a 4ºC durante 90 minutos.
• Agregar azul tripán para teñir la muestra.
• Resuspender suavemente la muestra.
• Tomar una gota con capilaridad y colocar en cámara de recuento.
• Contar 100 linfocitos vivos y anotar como rosetas los que tengan 3 o más eritrocitos adheridos.
• Los resultados se expresan como porcentaje.

Prueba de Citotoxicidad por Liberación de Cromo

• Se utiliza para detectar linfocitos T CD8+ específicos de antígeno.
• Se basa en la capacidad del linfocito para lisar células diana, marcando las células dianas con un isótopo radiactivo (Cr).
• El complejo péptido antigénico/molécula de histocompatibilidad es reconocido por su TCR, produciéndose la lisis.
• Se mide la radiación con un contador gamma.

Estudio de Células Fagocíticas

• Los fagocitos (neutrófilos y macrófagos) son fundamentales para la inmunidad innata.
• Se utilizan diversos métodos para evaluar su funcionalidad, incluyendo capacidad fagocítica , activación , eficiencia microbicida y ensayos quimiotaxismo.

Evaluación de la Capacidad Fagocítica

• Se incuba una fracción de leucocitos con microesferas de látex o microorganismos (bacterias, levaduras) para permitir la fagocitosis.
• La técnica cuantifica la fagocitosis.
• Inconvenientes: no distingue entre partículas fagocitadas y las adheridas a la membrana.

Evaluación de la Activación de los Fagocitos

• Se utiliza la prueba de reducción de NBT para evaluar el estallido respiratorio de los fagocitos.
• El estallido respiratorio es inducido por la activación del sistema NADPH oxidasa, que produce anión superóxido.
• En inmunodeficiencias pueden existir defectos en el sistema NADPH oxidasa, lo que resulta en la incapacidad de reducir el NBT.

Evaluación de la Actividad Microbiana

• Se incuba a los fagocitos con un inóculo conocido de microorganismos (bacterias o levaduras).
• Se realiza un recuento para determinar la viabilidad residual de microorganismos.
• La disminución en el número de microorganismos indica la actividad microbicida de los fagocitos.
• Evalúa la capacidad de destrucción además de ingestión.

Ensayos de Quimiotaxis

• Se evalúa la capacidad de locomoción direccional de los neutrófilos.
• Se utilizan cámaras aisladas separadas por un filtro.
• Las células se colocan en una cámara y el quimioatrayente en la otra.
• El movimiento de las células desde la cámara superior a la inferior es una medida de la quimiotaxis.

Estudio del Complemento

• El sistema del complemento está compuesto por proteínas plasmáticas que se activan en cascada.
• Su función principal es producir la lisis de membranas de patógenos.
• Promueve procesos inflamatorios y la fagocitosis.
• Si se deposita, puede causar enfermedad.

Vías del Complemento

• Vía clásica: Iniciada por anticuerpos (IgM e IgG).
• Vía alternativa: Iniciada por moléculas presentes en la superficie de patógenos.
• Vía de las lectinas: Iniciada por residuos de manosa en superficies bacterianas.

Alteraciones/Evaluaciones del Complemento

• Pruebas funcionales y pruebas inmunoquímica.
• Se miden las fracciones C3 y C4.
• Análisis de la vía clásica utilizando la técnica CH50 y técnica de hemólisis en gel de agarosa.

Cuantificación de las Fracciones C3 y C4

• Se utilizan técnicas como la inmunodifusión radial e inmunonefelometría para cuantificar los componentes funcionales y otros productos de degradación.

Análisis de la Vía Clásica (Técnica CH50)

• Se mezcla suero fresco con eritrocitos sensibilizados con anticuerpos para activar el complemento.
• Se crea una curva patrón con cantidades crecientes de suero problema para determinar el volumen de suero requerido para la lisis del 50% de los eritrocitos.
• La unidad hemolítica 50 (CH50) representa la cantidad de suero que produce la lisis del 50% de eritrocitos.

Técnica de Homólisis en Gel de Agarosa

• Se prepara un gel de agarosa que contiene eritrocitos sensibilizados con anticuerpos.
• Se añaden muestras de suero con complemento a los pocillos.
• El halo de lisis en el gel es proporcional a la concentración y funcionalidad de complemento.
• Se mide el diámetro del halo para evaluar los resultados.

Este cuestionario evalúa tu comprensión de diversas técnicas de inmunología, incluyendo la técnica CH50 y la formación de rosetas-E. Se abordarán procedimientos, condiciones y componentes clave que afectan los resultados de estas pruebas. Prepárate para poner a prueba tus conocimientos sobre hipersensibilidad e inmunodeficiencia.