Saggi immunochimici: traccianti e anticorpi

Campioni Biologici

• I campioni biologici sono prelevati per analisi chimiche.
• Il sangue è un fluido biologico prelevato da una vena del braccio e un volume medio prelevato è di 5 ml.
• I campioni di sangue sono raccolti in provette sottovuoto (vacutainer).
• I volumi richiesti per le analisi automatizzate variano da 2 a 100 μL per singola analisi.

Altre Matrici Biologiche

• Oltre al sangue, molti fluidi corporei sono usati per analisi di chimica clinica.
• Esempi includono sangue intero, siero o plasma, urina, liquido cerebrospinale (CSF), liquido amniotico, saliva, liquido sinoviale (cavità delle giunture), liquido pleurico (attorno ai polmoni), liquido pericardico (attorno al cuore), e liquido peritoneale (addominale).
• Fluidi diversi contengono gli stessi analiti biologici, ma differiscono nelle proprietà chimiche/fisiche.
• Le differenze nelle caratteristiche dei fluidi definiscono le differenze delle matrici.
• Metodi di analisi per plasma sanguigno non sono adatti per altri fluidi.
• Quando si analizza un fluido diverso dal sangue, è essenziale verificare che il metodo sia idoneo al tipo di campione disponibile.

Immunochimica

• L'immunochimica è un metodo analitico sensibile e specifico per rilevare molecole.
• I test immunochimici si basano sull'uso di un anticorpo (Ab) per identificare un analita, considerato quindi l'antigene (Ag).
• La quantificazione dell'analita avviene tramite un tracciante.
• Il tracciante rileva un segnale proporzionale al numero di complessi Ag-Ab formati.

Immunochimica - Fasi

• Incubazione per la formazione di complessi Ag-Ab
• Separazione dei complessi Ag-Ab dalle molecole di Ab e Ag non reagite
• Rilevazione del segnale analitico
• Elaborazione dei dati ed estrapolazione delle concemtrazioni di analita

Dosaggio Immunochimico

• Metodi competitivi: si misurano in difetto di Ab/eccesso di Ag.
• Si usa un solo Ab per identificare l'Ag.
• Il segnale è inversamente prop. alla concentrazione.
• Metodi non competitivi: si misurano in eccesso di Ab/ difetto di Ag.
• È previsto l'uso di due Ab.
• Il segnale è direttamente prop. alla [Ag].
• Componenti fondamentali:
  • Analita (Ag)
  • Molecola legante (Ab)
  • Tracciante (sistema che emette il segnale in funzione del legame Ag e Ab)

Analita

• Antigeni (Ag) sono macromolecole (proteine, glicoproteine, polisaccaridi) con epitopi differenti.
• Il determinante antigenico o epitopo è la regione dell'antigene riconosciuta dall'anticorpo (Ab).
• Gli antigeni (Ag) che inducono una risposta immunitaria sono detti IMMUNOGENI.
• Molecole a basso PM (< 2 kDa) possono essere antigeniche ma non immunogene (APTENI).
• Per produrre Ab contro un aptene, questo viene legato ad un carrier.
• Metodi immunochimici possono misurare qualsiasi analita riconoscibile e legabile ad altra molecola.
• Anche l’Ab, legato da un Ab Anti-Ab, se riconoscibile e legato da un’altra molecola.

Molecola Legante

• Perlopiù Ab (anticorpo).
• Caratteristiche cruciali dell'Ab:
  • Affinità (Keq Ag-Ab)
  • Specificità (riconoscere l'analita tra molecole simili)
• Gli anticorpi più usati sono IgG, monoclonali (verso un epitopo) o policlonali (verso zone diverse dell'epitopo).
• La specificità della misura immunochimica dipende dagli Ab usati come leganti.
• Si definisce la capacità dell'Ab di riconoscere l'Ag da determinare.
• Gli Ab policlonali come leganti sono meno specifici dei monoclonali.

Caratteristiche Ab Monoclonali

• Vantaggi degli Ab Monoclonali:

  • Le caratteristiche di affinità e specificità sono note e costanti.
  • È sufficiente una piccola quantità di Ag per la produzione.
  • Possibilità di selezionare Ab con la specificità desiderata.
  • Può essere prodotto in quantità limitata e processo di purificazione è semplice.
  • Sono caratterizzati da elevata specificità

• Svantaggi Degli Ab Monoclonali:

  • La specificità potrebbe essere eccessiva.
  • Richiede tecnologie più sofisticate per la produzione.
  • Non sempre reagiscono con la proteina A (per supporti solidi-lega IgG).
  • Non formano un precipitato in seguito a legame con l'Ag.
  • Caratterizzati da bassa affinità.

Tracciante

• La rilevazione del segnale è importante per la sensibilità.
• Il tracciante indica la reazione analitica e rende rilevabile la sostanza misurata.
• Questo avviene con l’introduzione di un marcatore che non deve alterare il sistema.
• La porzione di Ag o Ab coniugata al tracciante si definisce MARCATO.
• Un tempo esistevano solo traccianti radioattivi.

Caratteristiche del Tracciante

• Il legame chimico con Ag o Ab deve minimizzare l'interferenza con la formazione del complesso Ag-Ab.
• Segnale analitico deve avere alta intensità per unità di massa, dipendente dal limite di rilevabilità del tipo di tracciante.
• La specificità del segnale deve essere massima per garantire un basso rumore di fondo e migliorare la rilevabilità.
• Segnale non deve essere modificato dalla matrice circostante.
• È preferibile che la misura sia ripetibile e che il tracciante possa essere rilevato in un'ampia gamma di concentrazioni.

Tipi di Tracciante

• Le caratteristiche dipendono dalla natura del segnale e dalla strumentazione.

• I traccianti possono essere raggruppati in categorie:

  • Radioattivi
  • Enzimatici
  • Fluorescenti
  • Chemiluminescenti

• Ogni categoria ha una tipologia di segnale emesso diversa.

• Si sceglie quindi il tipo di rivelatore da utilizzare per la misurazione.

Traccianti Utilizzabili in Immunochimica

Tipi di Tracciante

• Alcuni traccianti forniscono un segnale esplicito, esempio radioattività o luminescenza.
• Il segnale esplicito è misurabile direttamente con gli strumenti di rilevazione idonei.
• Altri traccianti sono portatori di un segnale implicito (attività enzimatica o fluorescenza).
• Il segnale implicito richiede un ulteriore passaggio per effettuare la misura.

Traccianti Radioattivi

• Sono stati gli unici usati per lo sviluppo e l'esecuzione delle determinazioni di immunochimica.

• I principali radio elementi come marcatori in radio immunochimica:

  • 125| (radiazioni γ)
  • 3H (radiazioni β)

• Vantaggi:

  • Segnale diretto (emesso dal marcato) e positivo (emissione di particelle/radiazioni).
  • Spontaneo (no sorgenti esterne di E) e molto specifico (radiazioni spurie/contaminazioni rare).
  • L'emissione del segnale non dipende dall'ambiente e l'attività è proporzionale al numero di marcate.
  • Rilevazione del segnale: semplice conteggio numerico correggibile x il rumore di fondo.

Traccianti Enzimatici

• Nelle determinazioni immunoenzimatiche il marcato è un Ag o un Ab associato ad un enzima.
• La misura dell'attività enzimatica consente di valutare la quantità di marcato libero o legato nell' immunocomplesso
• La quantificazione è resa possibile tramite l'aggiunta del substrato appropriato che innesta la reazione enzimatica
• I marcatori enzimatici non emettono un segnale diretto.
• il segnale quantitativamente misurabile è proporzionale all'attività catalitica degli enzimi e quindi alla sua conc.
• Il segnale analitico emesso è dipendente dal tipo di trsformazione indotta sul substrato da parte dell'enzima:
  • L'Abs dell'enzima di radiazioni luminose (assorbanza)
  • L'emissione di radiazioni luminose/fluorescenza

Traccianti Enzimatici - Segnale di Assorbimento

• Il segnale di assorbimento delle radiazioni luminose in una reazione enzimatica si ottiene con metodologie diverse:Utilizzo di un substrato cromogeno
• Un cromogeno è una molecola che, quando trasformata chimicamente da un enzima-tracciante, altera il suo spettro di assorbimento.
• Es: H2O2 + o-fenildiamminao-nitro-anilina + 2H2O (Perossidasi di rafano)
• La perossidasi catalizza l'ossidazione e trasferisce gli e- all'H2O2 H2O. Il picco di assorbimento della o-Nitro-anilina è a 492 nm.
• Es: p-Nitro-fenilfosfatop-Nitrofenolo + Pi (Fosfatasi Alcalina)
• p-nitrofenolo è un buon analita con un picco di assorbimento a 405 nm.

Traccianti Enzimatici - Segnale di Emissione

• Il segnale di emissione di radiazioni luminose di una reazione enzimatica si ottiene con diverse: Utilizzo di un substrato fluorogeno
• Es: 4- Me-umbelliferil-ß-galacto-piranoside 4-Me-umbrelliferone (ß-D-galattosidasi,)
• Il 4-me-umbrelliferone è fluorescente.
• Un luminogeno e una molecola la cui trasformazione chimica produce un'emissione luce reazione di chemiluminescenza
• Utlizzo di due substrati di cui uno luminogeno.
• H2O2 + o-fenildiammina ione ammino ftalato + 2H2O (Perossidasi di rafano)

Traccianti Fluorescenti Diretti

• I traccianti fluorescenti (fluorofori) rimettono a lunghezze d'onda maggiori (E<) le onde elettromagnetiche ricevute eccitazione con λ ultravioletto/visibile.
• I traccianti fluorescenti devono emettere un segnale intenso e specifico.
• Fluorofori convenzionali (fluoresceina): emettono un segnale intenso ma poco specifico.
• Vari fenomeni interferenti aumentano il rumore di fondo ottico nella banda passante di rilevazione.
• Per un adeguato limite di rilevazione nelle determinazioni è necessario che il rapporto tra segnale e rumore sia elevato.
• Importante usare fluorofori che emettano un segnale intenso e misurabile con la massima specificità.

Traccianti Chemiluminescenti Diretti

• I chemiluminescenti sono molecole in cui l'eccitazione e l'emissione di radiazioni luminose si ottengono con energia chimica (ossidazione della molecola).
• I composti e metodi di marcatura devono avere queste caratteristiche:
  • Capacità di formare legami covalenti con le molecole da marcare.
  • La reazione chimica NON deve alterare l'immunoreattività del complesso.
  • La chemiluminescenza NON deve diminuire eccessivamente dopo il legame.

Traccianti Chemiluminescenti Diretti - Esempi

• FTALIZARIDI: luminolo, l'isoluminolo e i derivati per sostituzione dell'isoluminolosono quelli più usati

• H2O2 + luminolo ione ammino ftalato + 2H2O +hv (Perossidasi, OH-)

• Nella chemiluminescenza :

  • Diretta il tracciante costituisce il substrato luminoso, al termine del dosaggio si aggiunge la perossidasi insieme al perossido di idrogeno.
  • Indiretta è costituito dalla perossidasi e il substrato luminogeno è aggiunto successivamente insieme al perossido di idrogeno

Formazione Del Complesso Ag-Ab E Reazione Di Equilibrio

• gli Ab sono proteine del gruppo delle immunoglobuline.
• Si classificano in 5 classi:IgG, IgA,IgM, IgE et IgD.
• L'IgG è la più semplice e hanno 4 catene polipeptidiche (2 leggere e 2 pesanti).

Formazione Del Complesso Ag-Ab E Reazione Di Equilibrio

• Il legame che si instaura tra un Ag ed il corrispondente Ab porta alla formazione dell' immunocomplesso.
• Tale unione è altamente specifica ed è regolata da forze di tipo chimico-fisico (legami di natura non covalente) che agiscono tra i determinanti dell'antigene e dell'anticorpo (Forze di Coulomb, Forze di Van der Waals, legami H);

Formazione Del Complesso Ag-Ab E Reazione Di Equilibrio

• I metodi immunochimici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e avidità del legame fra Ab e Ag permettono la quantificazione dell'analita nelle matrici complesse.
• L'avidità del legame Ag-Ab si misura con la cosatante di affinità Kaff, che è una costante termodinamica di equilibrio Keq
• Un Ab è ideale per lo sviluppo di metodi immunochimici se ha un valore di Keq di 109-1012 M-1

Formazione Del Complesso Ag-Ab E Reazione Di Equilibrio(2)

• Ka e Kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo.
• L'affinità dell'Ab per l'analita può esser determinata dal diagramma di Scatchard che si ottiene sperimentalmente incubando quantità crescenti di analita con una quantità costante di Ab e misurando in condizioni di Eq.
• Della reazione di formazione del complesso AgAb la [Ag) libero e legato all'Ab [AgAbleq = Keq Apt - Keq [AgAbleq [Agleq La conc totale di Ab Abt = Abbleq + AgAbleq

Diagramma Di Scatchard

• Ab, = [Ableg + [AgAb]eg
• Il diagramma di Scatchard è un plot che riporta in ascisse la [AgAb] (legato) e in ordinata il rapporto fra Ag legato e libero

Ab Usato In Un Saggio Immunochimico

• Le caratteristicher dell'Ab usato in un saggio immunochimico è determinante per valutare la sensibilità del metodo e quindi l'intervallo di[Ag] misurabili.
• Un Ab con > costante di affinità rispetto ad un altro, a parità di concentrazione fa registrare un segnale analitico più intenso alla medesima [Ag].

Metodi Immunochimici Senza Tracciante

• Nelle determinazioni immunochimiche senza tracciante (label free) la formazione de complesso AgAb viene evidenziata direttamente, senza dover separare le forme di Ag e Ab non legate

• Principio Analitico

  • Agglutinazione (Emoagglutinzione, agglutinazione al lattice)
  • Precipitatzione (Rocket immunoelettroforesi Immunoturbidimetria/Nefelometria)
  • Immunosensori (Resonant mirror biosensor Surface plasmon resonance)

• Se la concentrazione è elevata i complessi sono evidenziabile a occhio nudo, altrimenti si quantificano sfruttando la capacità a deviare un raggio luminoso.

Fotometria

• Oltre all'assorbimento della radiazione esistono altri fenomeni che possono essere sfruttati per le misure

Definizioni

• Riflessione: fenomeno per cui un'onda cambia direzione e torna nel mezzo di provenienza.
• Rifrazione: deviazione di un'onda che passa da un mezzo ad un altro, dipendente dall'indice di rifrazione del mezzo stesso.
• Diffusione (o scattering): fenomeno in cui le particelle vengono deflesse (cambiano traiettoria) a causa della collisione con altre particelle
• Diffrazione: avviene quando un'onda incontra ostacolo/fenditura con dimensioni simili a λ.

Fotometria

• La luce può essere assorbita da una sostanza disciolta nella soluzione (assorbanza) ed emessa da una sostanza che assorbe la luce su λ ed emette su un'altra lunghezza d'onda (fluorescenza).
• La luce può essere diffusa o rifratta da particelle sospese nella soluzione (turbidimetria o nefelometria).

Turbidimetria E Nefelometria

• Sia nella Turbidimetria che Nefelometria sono tecniche immunochimiche che non utilizzano un tracciante.
• A una maggiore concentratione dell’analita corrisponde un maggior num di particelle che impedisconoil passaggio della luce/aumentano la quantità di luce riflessa.
• Sono techniche basate sulla valutazione della luce difusa (eterogeneity dell sistema ovvero soln colloidali o in sospensione)
• Si applicano in techniche di immunoprecipitazione I fase liquida

Turbidimetria E Nefelometria(2)

• Casi Limite:
  • La luce è assorbita in maniera notevole per cui l'intensità del raggio uscente è particolarmente attenuata
  • La luce è notevolmente diffusa dalle particelle in sospensione anche grazie ad un insieme di fenomeni difriflessione e rifrazione da parte delle particelle sospese (effetto Tyndell) originando la cosiddetta luce opalescente

Nei colloidi le particele sono sufficientemente grandi da disperdere la lucem perciò un raggio che la colpisce può essere osservato lateralmente

• In realtàI due fenomeni limte coesistono sempre a divesea intensità

Turbidimetria E Nefelometria(3)

• Quando l'assorbimento prevale sulla diffusione, si valuta l'entità dell'assorbimento (MISURA TURBIDIMETRICA).
• In TURBIDIMETRIA l'intensita della luce traversante
• viene misurata una sospensione e si possono usare colorimetri/spectrofotometri UV-VIS.
• II rilevatore viene posto in asse con la luche incidente, la luce rivelata dimunuisce con l'aumentare delle partcelle presenti

Turbidimetria E Nefelometria(4)

• Quando il fenomeno di diffusione è molto più intenso si valuta la luce diffusa
  • (MISURA NEFELOMETRICA).
• In nelometro il rilevstore viehe posto a 90° rispetto la radiazione incident in tal modo rileva unicamete luche difussa(a 90° rispetto fascio luminoso originario) Le misure nefelometriche sono altamente sensibilli ma econdizionate da molti fattori (PH del reaz, presenza di interferenti che si so possono assorbire
• Sulle Particelli Colloidalic dELL SO
• La loro pesione è condizionata da molti fattori a interferrenti oh si possonoadsortare sulle particalle colloidal de despenzone la Il PH del mare la •

Spettroscopia di Rifflettanza

• Usata perlopiù per la determinazione di analiti che dopo una reazione chimica formano colorate su
• Un istriscion,reaktrochimica, oppure perla leitura distrisceoveèstato fatta separavone di varie fasi colorate.
• Principio: si fonda sull varrazione del intensita luminosa della lece reflessa ad una specifica lunghezza d'onda

Spettroscopia di Riflettanza (2)

• Studia luche in funzione della lunghezza d'onda riflessa diffusada un solido.
• I campione assorbe alcune componenti del
• La radiazione riducen del intensita d LA LICE DIFESA

Spettroscopia Di Raflettanza(3)

• Reazione Cromogene su supporto sollido(cellubsa modificealtri mat)
• Dry Chemistry
• Zona reattira delimitata (analita ncl fluido biologicu Intensità

1. colarazzione in funzione della Conc dell analis

• Msrra della Lice Rifese Analisi Quantitativa

Spettroscopia Di Riflettanza (4)

• Vantaggi:
  • In diverse zone dello stesso supporto é possibile applicare reattini diversi (urina).
  • Reattivi sul supallo stato secco,quindi di facile conservazione
  • Ireattivi possono essere stratificati quindi separat, (de dissolvendosi solo al momento dell analysis
  • La sona reattva perà essere costruita in modo da assarbte sempre il la stesse q di cantione

Spettroscopia Di Riflettanza(5)

Applicazione • Glucosio Colestrerolo totale.

• Colesterold HDL
• Trigliceridi
• Creatinina. Enzimi. GOT (AST) GPT (ALT) Emoglobina. Analboli catabolic cari nelle wrne (AC vrrico)

Spettroscopia Di Riflettanza(6)

Applicazioni Dosaggio qualitatice della malania Dosaggio quantitatice de cari analits nei sangue determinazioni ce cari anali press steds medie. determinazioni dicar analisti in veternaria Lastre o stricce a cari skati LA TECNICA 04 chemy svluppaca da 7 kodake. la tecnica si base sa

Spettroscopia di Riflettanza(7)

• La chimica secca Kodak Ektechem (1986) è un'apparecchiatura di laboratorio per l'analisi di componenti chimici nei campioni.
• Automatizzati e ad alti volume sono gli strumenti di punta per chimiche come elettroliti, enzimi etc...

Spettroscopia di Riflettanza(8)

1. Strato di diffusione (porosità isotropica).Serve per distribuire uniformemente il campione sulla superficie della lastra trattenendo molecole
2. Strato di reagenti. Su di esso sono presenti i reagenti specific la reazione avviene quì
3. Membrana semipermeabile. Passaggio del solo prodotto intermedio di reazione
4. Strate indicatore reattivo.Reazione reattivo di reazione
5. Supporto.pellicola trasparente

Determinazione Semi-Quantitativa In Dry Chemistry

• L'applicazione piff dilfusa. è quella delle dstrisee reative perla determinazione dai catatten chimaci de lle wne
• Procedrmento: una goccia dicantione urina reagisce su un suppatto indetutde
• feadico specifico la celerasione chelisi fa letta perriflessione medhante l'ase defbreottiche mempre intensital colare sará

• VANTAGG della chunca secca:
• Smaltimeuto dennnt
• Fastdita de esecuzione es otterimante

SVANTAGG

pochi sul mercate

• rigidita delle calibrazioni
• . Si Stema neotamente chiuso

PresentazioneDel Corso

• Gli obiettive DelCorso è fornire le Conoscengs. Di Bace Sol Metod ANALTICY a Tipo Chimico a Blochimico in Neguati nell ambito DelLaboratorio.
• Textoli Approfondimento: Ciacciola Trattate de Bicchima Olinica e Medicira di Laboratorio ed Edese, Amo Di Pubblicarione 204l
• Modalita D Esonte Textosatite Prava Parziale)

FUNZIONI DEL LABORATORIO BIOMEDICO

• Assistere il medico nella Diagnosi in una malattia prognos selba E nonitataggio
• Della terania Serenting Laborato attente clinca.
• Laboratanio and all tiva

FUNOZONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO (2)

• II I lahoratonio blomedico informazooni dimche qualificate se ottenudi can ban déterminat criteria, Quests data sona il risoltata dimisuremorniche sona #l compite principale and tecnico sanitario dilabaratorio himedico.
• Il tecnico di laboratorie hlomedicas dere conoscer le rarahik che prissona influenzore una masura trallare im Maniena carella I campeeni in Esamine

conescere le teknche al masure al mannale a.d

• I primcipidi funzionamente degli strementi and laboratoria

DEFINTOTONI DOMETADEDLA (1)

Msurazone: process medante al quale la descrivare quantitativamete ama propiesta grande de ma cesa fenomeno

. Msua It nswtato de an process de misurazione formato de an Msieme de diredatanumer untea di musuna grado die Incertezze di musura

Grande 2za attritude una cosa di un fenomeno che per assere imdividuata qualetatramente a quantitatinment

Misurando granderra asgette delta misurazione che dele assere attentarmente individuale de crei necessano deimite lostato ces Tunito de misora granderna adottala per conrenziche per exprumere Quantiatiomate quandere arunt, la Sesta dimimane

PROCESSO DIRUSURADONE.